способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов

Формула изобретения

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ, включающий приготовление суспензии печени кроликов, павших после заражения вирулентным вирусом геморрагической болезни, и ее инактивацию, отличающийся тем, что суспензию готовят 20 25%-ной концентрации, инактивацию проводят 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазатрициклодеканом в концентрации 1г на 1000 мл суспензии печени при 27^oС в течение 48 ч, после чего стабилизируют и осветляют хлороформом в соотношении 1 часть хлороформа к 5 частям суспензии в течение 10 ч, добавляют защитную среду, состоящую из 5% ной смеси лактозы и пептона в равных частях в буферном растворе с pH 7,2 7,4 в соотношении 1 часть защитной среды к 2 частям инактивированной суспензии, замораживают при 45 50^oС в течение 10 ч лиофилизируют при вакууме 11,0 15,0 Па, выдерживают при температуре 45 0^oС в течение 22-24 ч, доводят температуру до 18 20^oС в течение 3 4 ч и досушивают в течение 2 3 ч.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу изготовления инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни кроликов (ВГБК), и может быть использовано в научных и производственных лабораториях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известны способы изготовления вакцины против геморрагической болезни кроликов (Гу Чжэньдэ, Ван Сисюнь, Ли Цицзу, Кун Фаньфан, Чжунью Шоуи цзачжи. 1986, т.12, N 12; авт.св. ЧССР, N 8808644, 1988).

Вакцина готовится из вируса, выделенного в Китае в 1984 году от кроликов. В качестве вирусного сырья используют смесь органов печень, легкие, селезенка, почки, из которых готовят 10%-ную суспензию на соляном растворе, инактивируют 0,8% раствора формалина при 37^оС в течение 24 ч. После этого к суспензии добавляют масло в соотношении (3:1), затем консервант глицерин (1: 9) и наполнитель стеариновокислый алюминий и вакцину применяют для профилактики заболевания. Вакцину вводят подкожно и внутримышечно в дозе 0,5-1 мл. Иммунитет формируется на 7 сут, продолжительностью 6 месяцев. Вакцина сохраняет иммунобиологические свойства при хранении при температуре 2-8^оС в течение 8 мес. при температуре 10-20^оС 6 мес. После прививки у животных возникают осложнения.

Известен также способ изготовления тканевой гидроокисьалюминиевой формолвакцины против ВГБК.

В качестве вирусного сырья используют 2,5-12%-ную суспензию печени кроликов, павших от вируса ГБК. Суспензию готовят на забуференном физиологическом растворе (рН 7,2-7,4) с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 200 ед/мл) и мертиолятом (1:100000). Вирус экстрагируют при 22-24^оС в течение 1-3 ч. Осаждают клеточный детрит путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин или сепарированием, общее количество белка не более 20 мг/мл. Вирусную суспензию инактивируют 0,1-0,14% -ным формальдегидом при 27-28^оС в течение 3-4 сут. Остаточный формальдегид нейтрализуют метабисульфитом натрия и добавляют 10-15% геля гидроокиси алюминия (Временная инструкция по изготовлению и контролю тканевой формолвакцины гидроокисьюалюминиевой против вирусной геморрагической болезни кроликов, утвержденная ГУВ СССР 05 июля 1990 г). Такая вакцина сохраняет свои антигенные свойства в течение 12 мес. Иммунитет формируется на 3 сут. после однократного внутримышечного введения вакцины в дозе 0,5 мл продолжительностью 7 мес. Однако после иммунизации у животных отмечаются поствакцинальные осложнения.

Предлагаемый способ изготовления устраняет перечисленные недостатки.

Задача изготовление ареактогенной инактивированной вакцины против ВГБК, обладающей стабильными свойствами в процессе длительного хранения.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что используется 20-25%-ная суспензия печени на забуференном растворе (рН 7,2-7,4).

Инактивацию вирусного сырья проводят 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазотрициклодеканом (А-24) из расчета 1 г препарата на 1000 мл сырья.

Применяют хлороформ из расчета 1 ч. на 5 ч. сырья для очищения сырья от клеточного детрита.

Стабилизацию сырья осуществляют 5%-ной смесью лактозы и пептона на буферном растворе (рН 7,2-7,4), взятых в соотношении 1:1 и смешанных с сырьем 1:2.

Лиофилизацию проводят после замораживания при минус 45 50^оС в течение 10-12 ч, выдерживают материал от минус 45^о до 0^оС в течение 22-24 ч при вакууме 11,0-15,0 Па (80-100 мкм), доводят температуру до 18-20^оС в течение 3-4 ч и досушивают 2-3 ч.

Способ осуществляют следующим образом.

Для изготовления вакцины против ВГБК берут кроликов массой 3,0 кг, заражают внутримышечно вирусом ГБК (регистрационный N 1652 в коллекции ВГНКИ) с инфекционной активностью 10^3,0 ЛД 50/мл. Спустя 24-48 ч от павших кроликов отбирают печень, замораживают, пропускают через мясорубку, фарш размалывают на коллоидной мельнице при зазоре ножей 0,00-0,1 мм. Полученное вирусное сырье доводят физраствором (рН 7,2) до 20% суспензии, выдерживают при 20^оС в течение 3 ч, освобождение от клеточного детрита проводят центрифугированием (общее количество белка не более 5 мг/мл) в течение 20 мин. Надосадок сливают в реактор и инактивируют 1, 8, 3, 6-диэндометилен-1, 3, 6, 8-тетраазатрициклодеканом из расчета 1 г вещества на 1000 мл вирусного сырья. Инактивацию проводят при температуре 27^оС в течение 48 ч при периодическом перемешивании. Затем сырье осветляют и освобождают от клеточного детрита. Для этого добавляют 1 ч хлороформа на 5 ч. сырья, выдерживают 10 ч при температуре 20^оС. Для сохранения нативных свойств в качестве стабилизирующей защитной среды используют стабилизатор, который включает лактозу ТУ 6-09-2293-75 50,0 г. пептон сухой ферментативный ГОСТ 13805-76 50,0 г, калий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 4198-75 1,0 г, калий фосфорнокислый двузамещенный ГОСТ 2493-65-5,2 г, на 1 л дистиллированной воды рН 7,2 ГОСТ 6709-72.

Затем 1 ч. стабилизатора смешивают с 2 ч. инактивированного материала, тщательно смешивают и фасуют при помощи дозатора (АГ-5) в стерильные флаконы или ампулы по 2,0 мл и проводят лиофилизацию при вакууме 80 мкм. Для этого замораживают материал при минус 45^оС в течение 10 ч, выдерживают при температуре от минус 45 до 0^оС в течение 22 ч. Затем доводят температуру до 20^оС в течение 3 ч и досушивают 3 ч. Весь цикл лиофилизации составляет 28 ч. Укупорка флаконов или запайка ампул проводится под вакуумом.

Инактивированная тканевая вакцина против ВГБК, лиофилизированная со стабилизатором, не вызывает поствакцинальных осложнений. Иммунитет формируется через 2 сут при введении 0,5 мл материала продолжительностью 12 месяцев. Вакцина стабильно сохраняет физические и иммунобиологические свойства в процессе хранения в течение 24 месяцев при температуре 4^оС.

В табл. 1 приведены физические и иммунобиологические свойства вакцины против ВГБК, лиофилизированной со стабилизатором после хранения в течение 24 мес. при 4^оС.

Из табл.1 видно, что вакцина, лиофилизированная с защитной стабилизирующей средой, стабильно сохраняет иммунобилогические свойства в процессе длительного хранения (защита 100%).

Применение инактиватора 1,8,3,6-диэкдометилен-1,3,6,8-тетраазатрициклодекана обеспечивает безопасность работ с вирусным сырьем в процессе изготовления.

Сравнительная оценка эффективности режимов лиофилизации вакцин представлена в табл.2, сравнительная характеристика вакцин против ВГБК в табл.3.

Из табл. 2 видно, что вакцина, лиофилизированная по предложенному режиму в течение 28 ч, не изменяет иммунобиоло- гические свойства в процессе лиофилизации.

Таким образом, предлагаемая концентрация сырья, освобождение от клеточного детрита центрифугированием при 3000 об/мин, использование инактиватора А-24 позволяют полностью инактивировать вирус. Осветление и стабилизация хлороформом, лиофилизация препарата по предложенному режиму со стабилизирующей защитной средой все это обеспечивает стабильность и стандартность вакцины при длительном хранении.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.