способ определения активности системы пероксидаза - эндогенная перекись водорода в лейкоцитах крови на мазках

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ ПЕРОКСИДАЗА - ЭНДОГЕННАЯ ПЕРЕКИСЬ ВОДОРОДА В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ НА МАЗКАХ, включающий сушку мазка, фиксацию спиртформалиновой смесью, инкубирование в среде, содержащей 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорид и окраску ядерным красителем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, сушку проводят в вакууме, а фиксацию после инкубации, при этом для определения активности в нейтрофилах, моноцитах и базофилах инкубационная среда дополнительно содержит 0,2 М трис-буфер рН 7,5 - 7,7, а для определения активности в лимфоцитах - 0,13 М фосфатный буфер рН 6,1 - 6,4.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам анализа крови, и может быть использовано в лабораторной диагностике.

Пероксидаза - эндогенная перекись водорода - известная система, обладающая антимикробными свойствами. Носителями ее являются нейтрофильные и другие лейкоциты.

Целью изобретения является повышение точности способа за счет лучшей сохранности клетки, более полное выявление активности системы пероксидаза - эндогенная Н₂О₂ и расширение круга исследуемых клеток крови (нейтрофилы, базофилы, моноциты).

Способ осуществляют следующим образом: готовят мазки крови, затем их инкубируют в среде, содержащей субстрат. Далее обрабатывают спирт-формалиновой смесью и окрашивают ядерным красителем. При этом для выявления активности в нейтрофилах, моноцитах и базофилах инкубационная среда дополнительно содержит 0,2 М трис-буфера, рН 7,5-7,7, а потом мазки обрабатывают спирт-формалиновой смесью.

Для определения активности в лимфоцитах инкубационная среда дополнительно содержит 0,13 М фосфатный буфер рН 6,1-6,4.

П р и м е р 1. Изучение нейтрофилов, моноцитов и базофилов человека. Мазки крови выдерживают в вакууме (5^.10^-1-1^.10^-3 То _гг) 1 ч. Инкубацию мазка проводят в течение 1 ч 15 мин при 37^оС в среде, содержащей 10 мг 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорида на 10 мл 0,2 М трис-буфера при рН 7,5-7,7. Промывают дистиллированной водой и фиксируют спирт-формалином (9:1) в течение 10 мин. После промывки подкрашивают ядра 5%-ным водным раствором метилового зеленого 1 мин. Затем под микроскопом определяют активность системы пероксидаза - эндогенная перекись водорода по Кеплоу.

Нейтрофилы содержат многочисленные темно-коричневые пероксидазосомы, равномерно занимающие всю цитоплазму и иногда расположенные над ядром. Пространство между пероксидазосомами бесцветно. Моноциты содержат сравнительно редко расположенные четко контурированные пероксидазосомы на бесцветном фоне. Базофилы содержат редко расположенные очень интенсивно окрашенные и четко контурированные крупные округлые пероксидазосомы на бесцветном фоне.

П р и м е р 2. Из крови готовят мазки, которые сушат под вакуумом (5^.10¹То _гг) в течение 1 ч, затем мазки инкубируют в среде, содержащей 10 мг 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорида и 10 мл 0,13 М фосфатного буфера рН 6,1-6,4. Инкубацию проводят в течение 10 мин. Затем мазки промывают, подкрашивают 5%-ным водным раствором метилового зеленого в течение 1 мин.

При микроскопии лимфоциты содержат темно-коричневые включения, равномерно заполняющие всю цитоплазму и по содержанию в клетках варьирующие в зависимости от вида клеток.

Таким образом, способ позволяет определить активность системы пероксидаза - эндогенная перекись водорода не только в нейтрофилах, но одновременно в нейтрофилах, моноцитах, базофилах и лимфоцитах. Кроме того, способ позволяет полностью сохранить структуру исследуемой клетки и обеспечивает более полное выявление активности системы за счет исключения диффузности окраски.