способ получения 2-замещенных 4-(3-трет-бутил-4- гидроксифенил)-тиазолов

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2-ЗАМЕЩЕННЫХ 4-(3-ТРЕТ-БУТИЛ-4-ГИДРОКСИФЕНИЛ)-ТИАЗОЛОВ общей формулы I



где R₁ - насыщенная линейная или разветвленная C₁ - C₅-алкильная группа;

R₂ - водород или C₁ - C₃-алкильный остаток;

A - промежуточная цепь общей формулы

-H=CR₃-(CH₂)_m- или

где R₃ и R₄ - одинаковые или различные, водород или алкильный остаток с числом атомов углерода до 2;

n = 1-4;

m = 0 - 3;

Z - тетразол или остаток общей формулы

--X

где X - гидроксигруппа, или остаток общей формулы R₅O - или R₆R₇N - , причем R₅ - линейный или разветвленный, незамещенный или замещенный гидроксилом, C₁ - C₃ - алкоксилом или C₁ - C₃ - алкиламиногруппой C₁ - C₄-алкил;

R₆ и R₇ - одинаковые или различные, водород, линейный или разветвленный C₁ - C₆ - алкильный остаток, или для того случая, когда R₆- водород или C₁ - C₄-алкильный остаток, R₇-гидрокси, C₁ - C₃ - алкокси или тетразол-5-ил-группа, или X со структурными элементами - А - (С=О) представляет остаток формулы



и физиологически совместимых солей соединений общей формулы I, где X - гидрокси- или гидроксиаминогруппа,

отличающийся тем, что тиазолальдегид общей формулы II



подвергают конденсации с диалкиловым эфиром фосфоновой кислоты общей формулы III

(R₉O)-CHR₃-(CH₂)_m-Z

где R₉ - C₁ - C₃-алкильный остаток,

с получением соединений общей формулы I



где R₁, R₂, R₃, Z имеют указанные значения,

или с 3-галогенпирролидиноном общей формулы IV



вместе с эфиром фосфиновой или фосфорной кислоты в присутствии сильного основания с получением соединений общей формулы I



где Z, R₁, R₂ имеют указанные значения;

R₈ - водород,

или с гидроксиламином общей формулы V

H₂N-O-(CH₂)_n--X

где X и n имеют указанные значения,

с получением соединений общей формулы I



при необходимости полученные соединения общей формулы I подвергают каталитическому гидрированию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к органическому синтезу и касается способа получения 2-замещенных 4-(3-трет-бутил-4-гидроксифенил)-тиазолов, проявляющих высокую терапевтическую активность в отношении лечения воспалительных, особенно ревматических заболеваний.

Потребность в терапевтически полезных противоревматических средствах, от которых на основании их профиля действия можно ожидать глубокого и продолжительного вмешательства в воспалительный процесс, как было теперь найдено, удовлетворяется получением новых производных тиазола, для которых особенно характерен 3-алкил-5-трет-бутил-4-гидроксифениловый заместитель, а также другой заместитель с карбоксильной группой или с образованной от нее группой. Вследствие комбинации этих двух заместителей на тиазоловом кольце усиленно тормозят лежащие в основе хронической фазы воспаления - иммунопатологические процессы и достигают тем самым выгодного противоревматического механизма действия. На основании своих тормозящих циклогеназу и липоксигеназу свойств, способности дезактивировать благодаря антиокислительному потенциалу кислородные радикалы и свойству выгодно вмешиваться в нарушенную иммунную систему, новые производные тиазола пригодны для применения в лекарственных средствах, особенно в таких, которые показаны при воспалительно-ревматических заболеваниях.

Предметом изобретения является способ получения новых замещенных тиазолов общей формулы

в которой

R₁ представляет насыщенную линейную или разветвленную С₁-С₅-алкильную группу,

R₂ представляет атом водорода или алкильный остаток с 1-3 С-атомами,

A представляет промежуточную цепь формулы

-(CH₂)_n-CR₃R₄-; -CH=CR₃-(CH₂)_m- или

-CH=N-O-(CH₂)_n-,

R₃ и R₄ одинаковые или различные и представляют атом водорода, или алкильный остаток с количеством С-атомов до 2 и

m - число 0-3 и

n - число от 1 до 4, и

Z представляет группу тетразола или остаток формулы

--X

X обозначает гидроксигруппу или остаток общей формулы R₅O-, или R₆R₇N-, причем R₅ означает имеющий линейную или разветвленную цепь, замещенный в случае необходимости гидроксилом, С₁-С₃-алкокси- или С₁-С₃-алкиламино-группой С₁-С₄-алкильный остаток, R₆ и R₇ одинаковые или различные и обозначают атом водорода, имеющий линейную или разветвленную цепь С₁-С₆-алкильный остаток или для того случая, когда R₆ означает атом водорода или С₁-С₄-алкильный остаток, R₇ представляет гидрокси-, С₁-С₃-алкокси- или тетразол-5-ил-группу или X вместе со структурными элементами -A- (C=O)- представляет остаток общей формулы

а также физиологически совместимых солей этих соединений.

Способ по изобретению отличается тем, что тиазолальдегид общей формулы II

подвергают конденсации с диалкиловым эфиром фосфоновой кислоты общей формулы III

(R₉O)-CR₃H-(CH₂)_m-Z в которой R₉ представляет С₁-С₃-алкильный остаток с получением соединений общей формулы I

в которой R₁, R₂, Z, R₃ и R₅ имеют приведенное значение, или тиазолальдегид общей формулы II подвергают конденсации с 3-галогенпирролидиноном формулы IV

вместе с эфиром фосфиновой или фосфорной кислоты в присутствии сильного основания с получением соединений по изобретению формулы I

причем R₁, R₂, R₈ и Z имеют указанные значения, или тиазолальдегид общей формулы II конденсируют с гидроксиламином формулы V

H₂N-O-(CH₂)_n--X в которой X и n имеют указанные значения с получением соединений по изобретению I

и при необходимости полученные соединения формулы I подвергают каталитическому пурированию.

Применяемые в качестве промежуточных продуктов тиазолальдегиды общей формулы II можно получать выгодным образом превращением соответствующих 2-галоген-1-фенилалканонов с диалкокситиоацетамидами, как например, диэтокситиоацетамид. Для выделения альдегида нагревают соответствующий ацеталь с разбавленными минеральными кислотами, как соляная кислота или серная кислота.

Предпочтительно для получения соединения формулы I является превращение путем активированного РО олефинирования с диалкиловым эфиром фосфорной кислоты формулы III, в которой R₃ означает атом водорода или метил и R₅ и R₉ означают этиловый остаток, при известных специалисту стандартных условиях. В предпочтительном варианте осуществления применяют в качестве растворителя диметилформамид и в качестве основания гидрид натрия, причем реакцию осуществляют при точке кипения растворителя.

Предпочтительным вариантом осуществления способа являются также превращения с 3-галогенпирролидиноном формулы IV, особенно в которых Hal представляет атом брома, с фосфином, как трифенилфосфин, до соответствующих четвертичных солей фосфония, причем в случае, когда R₈ = водород, для защиты свободного амидного азота соединение IV предварительно обрабатывают ацетилирующим средством, как уксусный ангидрид. Эти промежуточные стадии без дальнейшей обработки можно обычно превращать обычными для реакции Виттига стандартными способами с альдегидами формулы V. При этом особенно выгодным оказалось нагревание компонентов реакции в инертном растворителе, особенно в спирте, как этанол или диметилформамид, в присутствии основания, как триэтиламин, алкоголят натрия или калия, гидрид натрия или калия или гидроокись натрия или калия. Реакцию осуществляют при температурах приблизительно от 20^оС до точки кипения применяемого растворителя, предпочтительно в области около 60-80^оС.

Превращение с гидроксиланином общей формулы V осуществляют выгодным образом с эквимолярными количествами компонентов реакции в водно-спиртовом растворе, но также в других инертных растворителях, как пиридиндиметилформамид и спирты, как метанол, этанол и различные пропанолы и бутанолы, а также в смесях этих растворителей. При этом производные гидроксиламина формулы VIII целесообразно применять в форме их кислых аддитивных солей, как гидрохлориды, гидробромиды или сульфаты. В этом случае рекомендуется добавлять по меньшей мере в стехиометрическом количестве связывающее кислоту средство, например, гидроокиси или карбонаты щелочных металлов или также органическое основание, как триэтиламин. Реакцию проводят при температурах приблизительно между 20^оС и точкой кипения растворителя, предпочтительно между 40 и 70^оС.

Соединения по изобретению общей формулы I, поскольку они содержит карбоксиловую группу, могут образовывать соли с неорганическими и органическими основаниями. Поэтому и такие соли входят в объем изобретения. Предпочитают соли с неорганическими основаниями, особенно физиологически не вызывающие опасений соли щелочных металлов, прежде всего соли натрия или калия.

2-замещенные 4-(3-алкил-5-трет-бутил-4-гидроксифенил)-тиазолы формулы I и их соответствующие соли по изобретению на основании своих ценных фармакологических свойств особенно пригодны для применения в качестве активных веществ в лекарственных средствах, особенно в таких средствах для лечения воспалительно-ревматических заболеваний. Их можно назначать или один, например, в форме микрокапсул, в смесях друг с другом или в комбинации с подходящими вспомогательными веществами и/или веществами-носителями.

Лекарственные средства при этом состоят по меньшей мере из соединения формулы I и/или по меньшей мере из одной из их соответствующих солей или содержат по меньшей мере одно из этих активных веществ наряду с фармакологически подходящими и физиологически совместимыми веществами-носителями, разбавителями и/или другими вспомогательными веществами.

Лекарственные средства на основе соединений по изобретению можно применять орально, ректально или в случае необходимости также парентерально, причем предпочитают оральное применение.

Подходящими твердыми или жидкими галеновыми готовыми формами являются, например, грануляты, порошки, драже, таблетки, микрокапсулы, свечи, сиропы, соки, суспензии, эмульсии, капли или растворы для инъекций, а также препараты с замедленным освобождением активного вещества, при получении которых применяются обычные вспомогательные средства, как вещества-носители, средства взрывания, средства покрытия, средства набухания, смазывающие средства или смазки, вкусовые вещества, сладкие вещества или агенты растворения. В качестве часто применяемых вспомогательных веществ следует назвать напр. карбонат магния, двуокись титана, лактозу, маннит и другие сахара, тальк, молочный белок, желатину, крахмал, целлюлозу и ее производные, животные и растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители, как например, стерильная вода и одно- или многовалентные спирты, например, глицерин.

Предпочтительно фармацевтические препараты получают и назначают в дозировочных единицах, причем каждая единица в качестве активной компоненты содержит определенную дозу по меньшей мере соединения по формуле I и/или по меньшей мере соответствующей соли. При твердых дозировочных единицах, таблетки, капсулы, драже или свечи, эта доза может составлять приблизительно до 800 мг, однако предпочтительно приблизительно от 100 до 500 мг.

Для лечения страдающего от воспалительно-ревматических заболеваний взрослого пациента - в зависимости от эффективности соединений формулы I и/или cоответствующих солей - человеку показаны суточные дозы приблизительно 100-2000 мг активного вещества, предпочтительно 300-1100 мг, при оральном назначении. При известных условиях можно однако назначать также более высокие или более низкие суточные дозы. Назначение суточной дозы может как однократным приемом в форме отдельной дозировочной единицы или же многократным приемом меньших дозировочных единиц, как и многократным приемом отдельных доз в определенные интервалы.

Наконец, соединения формулы I и соответствующие соли при получении вышеназванных галеновых готовых препаратов могут быть применены вместе с другими подходящими активными веществами, например, антимочегонными средствами, ингибиторами скопления тромбоцитов, обезболивающими средствами и другими стероидальными или нестероидальными противовоспалительными средствами.

Структура всех описанных соединений была определена элементарным анализом и инфракрасными спектрами, а также спектрами ^IН-ядерного магнитного резонанса. Полученные по следующим примерам и полученные аналогичным образом соединения формулы I обобщены в табл.1.

П р и м е р 1. Сложный этиловый эфир 3-[4-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)- тиазол-2-ил]-акролеиновой кислоты.

1₁). 4-(3,5-ди-трет-Бутил-4-гидроксифенил)-2-формилтиазол.

90 г (0,27 моль) 2-бром-1-(3,5-ди-трет-бутил-4-оксифенил)-этанола из стадии а1) и 42,4 г (0,26 моль) диэтокситиоацетамида перемешивали в 200 мл этанола 30 мин при комнатной температуре. После удаления растворителя при пониженном давлении остаток обрабатывали 200 мл сложного этилового эфира уксусной кислоты в теплом состоянии. Получающийся кристаллический осадок соответствующего диэтилацетата растворяли для выделения альдегидной группы в 1500 мл ацетона, смешивали с 230 мл 4 н. соляной кислоты и перемешивали 2 ч при комнатной температуре. После нейтрализации при помощи Na₂CO₃-раствора выпадает осадок, который после отфильтровывания еще раз перекристаллизовывали из петролейного эфира.

Выход 63,4 г (77% от теории)

Точка плавления 99-100^оС.

С₁₈Н₂₃NO₂S (мол. м. 317,5).

Вычислено, %: С 68,10; Н 7,30; N 4,41; S 10,10.

Найдено, %: С 67,86; H 7,29; N 4,35; S 9,97.

1₂). Сложный этиловый эфир 3-[4-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-тиазол-2-ил]-акролеиновой кислоты.

В раствор 31,7 г (0,1 моль) альдегида из стадии 1) и 23,3 г (0,1 моль) сложного триэтилового эфира фосфорноуксусной кислоты в 400 мл сухого диметилформамида вводят при перемешивании частями 6,6 г (0,22 моль) 80%-ного гидрида натрия, причем температуру реакции поддерживают благодаря охлаждению водой ниже 30^оС. После 3-часового перемешивания при комнатной температуре и после добавки 375 мл 4 н. серной кислоты экстрагируют несколько раз сложным этиловым эфиром уксусной кислоты. Соединенные эфирные фазы экстрагируют встряхиванием 2 раза соответственно с 300 мл насыщенного раствора NaHCO₃, промывают водой, сушат над сульфатом натрия и сгущают в вакууме.

При перекристаллизации остатка из метанола получим желтые кристаллы.

Выход 33,3 г (86% от теории).

Точка плавления 126-127^оС.

C₂₂H₂₉NO₃S (мол. м. 387,5).

Вычислено, %: М 68,18; Н 7,54; N 3,61; S 8,27.

Найдено, %: С 67,87; Н 7,66; N 3,59; S 8,31.

П р и м е р 2. 3-[4-(3,5-ди-трет-Бутил-4-гидроксифенил)-тиазол-2-ил-метилиден]- пирролидин-2-он.

16,0 г (91 моль) 3-бромпирролидин-2-она нагревали в 30 мл ангидрида уксусной кислоты 1 ч до кипения. После выпаривания реакционной смеси при пониженном давлении досуха растворяли остаток в 50 мл тетрагидрофурана и после добавки 26,2 г (0,1 моль) трифенилфосфина нагревали 5 ч при флегме. После этого снова сгущали, остаток растворяли в 300 мл этанола и смешивали с 24,7 (78 моль) альдегида из примера 2 б₁) и 27 мл (0,26 моль) триэтиламина. После 2-часового нагревания смеси до 70^оС отфильтровывали желтый осадок и промывали этанолом. Растворяли массу кристаллов и маточного раствора приблизительно в 2 л хлороформа, промывали несколько раз насыщенным раствором поваренной соли, сушили над Na₂SO₄ и сгущали фазу хлороформа до трети. При более продолжительном выдерживании осаждаются желтые кристаллы.

Выход 24,7 г (81% от теории).

Точка плавления 244-245^оС.

C₂₂H₂₈N₂O₂S (мол. м. 384,5).

Вычислено, %: С 68,72; Н 7,34; N 7,28; S 8,34.

Найдено, %: C 68,45; Н 7,13; N 6,89; S 7,97.

П р и м е р 3. 2-[4-(3,5-Ди-трет-Бутил-4-гидроксифенил) -тиазол-2-ил-метилиден)-аминоокси]-уксусная кислота.

В раствор 15,9 г (0,05 моль) альдегида из примера 1₁) в 200 мл метанола закапывают одновременно при перемешивании раствор 6,4 г (0,05 моль) карбоксиметиоксиамингидрохлорида в 20 мл воды и 2 г (0,05 моль гидроокиси натрия в 200 мл воды. После дальнейшего 1,5-часового перемешивания при 50^оС метанол в значительной степени отгоняют в вакууме, и остаток многократно экстрагируют сложным этиловым эфиром уксусной кислоты. Соединенные экстракты промывают водой, сушат над Na₂SO₄, и выпаривают в вакууме. Маслянистый остаток после обработки петролейным эфиром (40-60^оС) становится кристаллическим.

Выход 13,8 г (71% от теории).

Точка плавления 178-180^оС.

С₂₀Н₂₆N₂O₄S (мол. м. 390,5).

Вычислено, %: 61,52; Н 6,71; N 7,17; S 8,21.

Найдено, %: С 61,44; Н 6,85; N 6,96; S 8,02.

П р и м е р 4. 2-[4-ди-трет-Бутил-4-гидроксифенил)-тиазол-2-ил)метокси] -2-метилпро- пионовая кислота.

4₁). 4-(3,5-ди-трет-Бутил-4-гидроксифенил)-2-гидроксиметилтиазол.

117,8 г (0,36 моль) 2-бром-1-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-этанола и 72,1 г (0,34 моль) бензоилокситиоацетамида растворяют в 300 мл этанола и перемешивают 4 ч при комнатной температуре. Образующиеся при этом кристаллы отфильтровывают и промывают небольшим количеством этанола. Для отщепления гидроксигруппы 139,4 г выделенного бензоилового эфира (точка плавления 198-199^оС как гидробромид) поглощают в 600 мл этанола, смешивают с 45,6 г (0,69 моль) 85%-ной гидроокиси калия в 30 мл воды и дополнительно перемешивают полчаса при комнатной температуре. После этого смесь сгущают, смешивают с водой и многократно экстрагируют уксусным эфиром. Соединенные экстракты после сушки над Na₂SO₄ смешивают с раствором соляной кислоты в этаноле, причем спирт осаждают в форме гидрохлорида.

Выход 78,6 г (65% от теории).

Точка плавления 185-186^оС (как гидрохлорид).

С₁₈Н₂₆ClNO₂S (мол. м. 355,9).

Вычислено, %: С 60,74; Н 7,36; Cl 9,96; N 3,94; S 9,01.

Найдено, %: С 60,49; Н 7,56; Сl 10,05; N 6,96; S 9,05.

4₂). 2-[4-(3,5-ди-трет-Бутил-4-гидроксифенил)-тиазол-2-ил-метокси]-2-метилпропион оваякислота.

9,6 г (0,031 моль) спирта стадии 4₁) в форме свободного основания смешивают с 6,0 г (0,15 моль) измельченной в порошок гидроокиси натрия в 44 мл ацетона и нагревают суспензию до флегмы. Затем закапывают 4,8 г (0,04 моль) хлороформа в 10 мл ацетона и нагревают еще 5 ч при температуре флегмы. После этого выпаривают растворители в вакууме, и остаток распределяют между простым диизопропиловым эфиром и водой. Органическую фазу отделяют, и водную фазу после вторичного экстрагирования простым эфиром подкисляют концентрированной соляной кислотой до pH 2 и несколько раз экстрагируют хлористым метиленом. Соединенные экстракты хлористого метилена сушат, фильтруют и сгущают. Остаток очищают хроматографией на колонке с силикагелем (90-130), растворитель: хлористый метилен:метанол (50:1), с небольшим количеством петролейного эфира (40-60^оС) доводят до кристаллизации.

Выход 3,1 г (26% от теории).

Точка плавления 158-159^оС.

С₂₂H₃₁ NO₄S (мол. м. 405,6).

Вычислено, %: С 65,16; Н 7,70; N 3,45; S 7,91.

Найдено, %: С 65, 03; Н 7,89; N 3,37; S 7,81.

П р и м е р 5. 3-[4-(3,5-ди-трет-Бутил-4-гидроксифенил)-тиазол-2-ил]-пропионгидро- ксамовая кислота.

В раствор 6,7 г (18,6 ммоль 3-[4-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-тиазол-2-ил] -пропионовой кислоты в 250 мл хлористого метилена добавляют при 0^оС сначала 1,4 г диметилформамида, затем 5,2 г (42 ммоль) дихлорида щавелевой кислоты и перемешивают 1 ч. При закапывании раствора 7,7 г (111 ммоль) гидроксиламин-гидрохлорида в 65 мл тетрагидрофурана и 13 мл воды и 11,2 г (111 ммоль) триэтиламина повышают температуру реакции до 30^оС и дополнительно перемешивают еще 12 ч. Затем добавляют 300 мл 2 н. соляной кислоты и отделяют органическую фазу. Водную фазу еще раз экстрагируют хлористым метиленом и соединенные органические фазы промывают насыщенным раствором NaHCO₃ и NaCl, сушат над Na₂SO₄ и сгущают в вакууме. После добавки петролейного эфира (40-60^оС) остаток затвердевает.

Выход 3,8 г (55% от теории).

Точка плавления 182-183^оС.

C₂₀H₂₈N₂O₃S (мол. м. 376,6).

Вычислено, %: С 63,80; Н 7,50; N 7,44; S 8,52.

Найдено, %: С 63,95; Н 7,61; N 7,42; S 8,63.

Соединения формулы приведены в табл.1.

Фармакологические испытания

Испытание соединений по изобретению формулы I на противовоспалительное действие, влияние иммунопатологических процессов, дезактивирующие кислородные радикалы свойства и влияние метаболизма арахидоновой кислоты производили в описанных ниже моделях и биоанализах.

Ревматический артрит для определения влияния противовоспалительного действия (см. табл.2).

Исследования проводили по методу Pearson (Arthrit. Rheum. 1959, 2, 44). В качестве подопытных животных служили крысы мужского пола штамма Wistar-Lewis c массой тела между 130 и 200 г. Испытываемые соединения назначали в дозах 50 мг на 1 кг массы тела один раз в день с 1-го по 5-й опытный день орально (р. о). Животные контрольной группы получали только индиферентную основу лекарственного препарата. Каждая препаратная и контрольная группа включали 8 животных. В качестве критерия действия служило снижение в процентах увеличения объема лапы по сравнению с необработанной контрольной группой. Величины ЕД₅₀ определяли графически из кривой действия дозы.

В качестве сравнительного препарата в это и нижеследующее исследование включали 4-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-2-метилтиазол - т.е. соединение формулы

CH по патенту США 4535165.

Противовоспалительное действие на 5-й день.

Торможение иммунопатологических процессов.

Общепризнано, что прогрессирующий ход воспалительно-ревматических заболеваний вызывается, главным образом, нарушениями иммунной системы, следовательно, более причинная терапия может удаваться только с такими медикаментами, которые тормозят эти иммунопатологические процессы.

а). Ревматический артрит (модификация Перпера).

В описанной в пункте 1 постановке опыта животных обрабатывали только с 1-го по 12-й опытный день. После свободного от лечения интервала 9 дней происходит определение объема левой и правой задней лапы на 21-й день (см. табл. 3). В этом тесте классические нестероидальные противовоспалительные средства являются неэффективными, так как они не в состоянии тормозить лежащие в основе хронической воспалительной фазы иммунопатологические процессы. Затем результаты ясно доказывают превосходство соединений по изобретению формулы перед сравнительным препаратом из патента США 4535165, который в модификации Перпера ревматического артрита показывает только намекаемое действие.

б). Обратимая пассивная реакция Артуса.

В качестве подопытных животных служили Sprague-Dawley-крысы мужского пола массой тела между 100 и 120 г, которые были подразделены на группы соответственно по 8 животных. Животные получали через 1 ч после орального назначения испытываемого вещества 0,5 мг иммуноглобулина в 0,1 мл раствора хлористого натрия под подошву инъекцией в левую заднюю лапу. Через 4 ч измеряли реакцию Артуса, причем в качестве измерительного параметра действия служило изменение в процентах увеличения объема лапы по сравнению с контрольной группой, получившей только индиферентную основу лекарственного препарата.

По табл.4, например, следующие соединения по изобретению отличаются как сильные ингибиторы реакции Артуса.

3. Действие в качестве ловушки радикалов и в качестве ингибиторов метаболизма арахидоновой кислоты.

а). Свойства ловушки радикалов.

Испытание в этом тесте, который может дать заключение об антиокислительном потенциале вещества, проводилось по Smith и др., Biochem. Pharmacol. 1987, 36, 1456. При этом за реакцией соединений по изобретению со стабильным радикалом 1,1-дифенил-2-пикрил-гидроцилом (ДРРН) наблюдают при 20^оС при помощи оптики. Константа скорости К и порядки реакций n были определены в табл.5 обычным путем графически.

б). Метаболизм арахидоновой кислоты.

Тормозящее действие соединений по изобретению на катализированное циклооксигеназой и липоксигеназой расщепление арахидоновой кислоты в пробирке измеряли при помощи описанной в Weithmann и Alpermann, Arzneim.-Forsch. 1985, 35, 947 тест-системы:

В микросомальной системе циклооксигеназы (фракция из семенных пузырьков овцы, фирма Паэзел, Франкфурт, Германия) измеряют катализированный циклооксигеназой синтез простагландинов из арахидоновой кислоты. Коэнзимом является адреналин, превращение которого в адренохром прослеживают при 492 нм спектральным фотометром. В системе липоксигеназы в пробирке инкубируют цис-9-цис-12-линолевую кислоту с липоксигеназой (L 7127, фирма Сигма, Дайзенхофен, Германия) и прослеживают при 234 нм при помощи оптики происходящее при реакции окисления образование сопряженных двойных связей.

Тормозящие действия или необходимые для 50%-ного торможения активности фермента концентрации ингибитора (IC₅₀-величины) были определены для следующих примеров изобретения:

Липоксигеназа (энзим)

Пример 8: IC₅₀ = 50 ммоль

Пример 12: при 150 ммоль: 73% торможения.

Пример 15: при 100 ммоль: 78% торможения.

Циклогеназа (микросомы)

Пример 7: при 100 ммоль: 65% торможения.

Пример 8: при 100 ммоль: 75% торможения.

Пример 16: IC₅₀: = 34 ммоль.

Кроме того, вещества по изобретению в качестве ингибиторов метаболитов арахидоновой кислоты были характеризованы также в клеточных системах лейкоцитов в пробирке. Для обнаружения метаболитов липоксигеназы инкубировали стимулированные кальцием-ионофором А 23187 (70 мкмоль/л) нейтрофилы человека с ¹⁴C-арахидоновой кислоты (81 мкмоль/л) и количественно определяли образованные через 15 мин при 37^оС основные метаболиты, как 5-гидроксиэйкозожирная кислота с четырьмя ненасыщенными связями (5-НЕТЕ) и имеющий еще более противовоспалительное действие лейкотриен В₄ (LTB₄), после разделения методом HPLC при помощи радиомонитора (табл.6). Соответствующим образом определяли влияние на противоспалительные метаболиты арахидоновой кислоты тромбоксан и LTB₄ в изготовленных из тучных клеток крыс культурах (табл.7).

Влияние соединений по примерам 5 и 6 на активность LTB₄- или 5-НЕТЕ-образования в нейтрофилах человека (n - число измерений).

Влияние различных концентраций соединения по примеру 3 на образование ТХВ₂ и LTB₄ в культурах тучных клеток (крыса).