способ очистки бычьего сывороточного альбумина

Формула изобретения

СПОСОБ ОЧИСТКИ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА, включающий осаждение плазмы этанолом при низкой температуре, изменение рН, ионной силы, удаление посторонних белков, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют протеолиз примесных белков с помощью трипсина в бикарбонатном буфере, рН 7,8, при 37^oС и отделяют бычий сывороточный альбумин путем гельфильтрации через сефадекс G-75.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для повышения степени гомогенности коммерческих препаратов бычьего сывороточного альбумина (БСА).

БСА широко применяют в биохимической и иммунологической практике с целью подавления неспецифической адсорбции антител, для стабилизации антигенов, в качестве белка-маркера и т.п. Чистота используемого альбумина, определяемая степенью его гомогенности, является одним из факторов, влияющих на качество проводимых исследований.

В настоящее время для выделения БСА из плазмы используют следующие основные способы: высаливание неорганическими солями (обычно сульфатом аммония), осаждение органическими растворителя при пониженной температуре, избирательная денатурация с последующим осаждением посторонних протеинов. Дальнейшую очистку альбумина с целью повышения степени его гомогенности осуществляют, используя методы препаративного электрофореза, гель-фильтрации, хроматографии, в том числе аффинной и др.

Целью изобретения является дополнительная очистка коммерческих препаратов БСА, первоначально выделенных из плазмы, что достигается ферментативным протеолизом посторонних белков с помощью трипсина с последующим разделением альбумина, трипсина и продуктов протеолиза на сефадексе.

Сущность заявленного способа дополнительной очистки БСА заключается в том, что к 1-3% раствору альбумина в 01, М бикарбонатном буфере (рН 7,8) добавляют кристаллический трипсин (или эквивалентное по активности количество аморфного трипсина), исходя из соотношения белок:фермент, равном 50:1, выдерживают при 37^оС 1 ч и затем раствор пропускают через колонку с сефадексом, при этом альбумин (М=69000) выходит из колонки раньше, чем трипсин (М= 21000) и продукты протеолиза. При необходимости получения белка в свободном состоянии проводят диализ для удаления солей и лиофильную осушку. При выборе оптимальных условий проведения протеолиза (концентрация, температура, рН) руководствуются апробированными данными.

Для контроля за степенью чистоты альбумина выполняли диск-электрофорез белкового раствора в полиакриламидном геле на приборе ПЭФА-1 до и после протеолиза. Значения рН разделяющего геля и буферного раствора составляли 8,9 и 8,3 соответственно, окрашивание белковых зон в геле осуществляли красителем амидо-черным. Следует отметить, что при указанных значениях рН молекулы трипсина заряжены положительно (изоэлектрическая точка 10,5) и мигрировать в геле к положительному электроду не будут, что исключает влияние фермента на результаты электрофореза.

На чертеже представлены электрофореграммы исходного препарата БСА (а) и белка, подвергшегося воздействию трипсина (б).

Как видно, в результате обработки ферментом достигается существенное повышение степени гомогенности белкового препарата.

Для сравнения предложенного способа гомогенизации БСА с ранее известными была выполнена тепловая денатурация посторонних белков, для чего 1%-ный раствор альбумина в дистиллированной воде инкубировали при 70^оС до появления легкого помутнения, фильтровали и проводили электрофорез. Как видно из электрофореграммы, представленной на чертеже (в), полного удаления посторонних протеинов достичь не удалось, вместе с тем уменьшается интенсивность белковой зоны альбумина, что свидетельствует о частичной потере полезного компонента.

Пример конкретной процедуры очистки коммерческого препарата бычьего сывороточного альбумина.

Оборудование:

1. Термостат лабораторный. 2. Прибор для электрофореза ПЭФА-1, ТУ 5-375-4231-77. 3. Стеклянная колонка l=50 см, d=1 см с сефадексом G=75 (LКВ, Швеция).

Реактивы и материалы: 1. БСА марки Б производства Олайнского завода, ТУ 6-09-10-342-75. 2. Трипсин производства Ленинградского мясокомбината. 3. 0,1 М бикарбонатный буфер, рН 7,8. 4. Набор реактивов для проведения диск-электрофореза (по паспорту к прибору ПЭФА-1).

Ход выполнения процедуры: 1 г БСА растворяют в 100 мл бикарбонатного буфера, фильтруют для удаления осадка. Отбирают пробу раствора белка и выполняют диск-электрофорез в соответствии с методикой, приведенной в паспорте на прибор ПЭФА-1 (3), электрофореграмма исходного раствора БСА приведена на чертеже (а). К раствору БСА добавляют 20 мг трипсина, перемешивают и выдерживают в термостате при 37^оС в течение 1 ч. Повторяют электрофорез, результаты приведены на чертеже (б). Для отделения трипсина и продуктов протеолиза раствор пропускают через колонку с сефадексом, фракция очищенного альбумина выходит из колонки первой.

Технико-экономическая или иная эффективность. Предлагаемый способ дополнительной очистки белка является эффективным средством гомогенизации коммерческих препаратов бычьего сывороточного альбумина.