ингибитор вируса простого герпеса

Формула изобретения

Применение 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана формулы

в качестве ингибитора вируса простого герпеса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для приготовления противогерпетических препаратов.

Известны соединения фосфорорганических производных фосфоновой кислоты, обладающих противогерпетической активностью. Имея выраженную противогерпетическую активность, соединения этой группы обладают значительной токсичностью. Токсичность соединения определяется с помощью химиотерапевтического индекса (ХТИ), который представляет собой отношение максимально переносимой для живой системы дозы изучаемого соединения к дозе минимально ингибирующей размножения вируса в этой системе. Если ХТИ меньше 10, соединение высоко токсично, так как оно обладает слишком малым диапазоном действующих доз ингибитора вирусов.

ХТИ для фосфорорганических производных фосфоновой кислоты определяется в пределах 20-100. Для получения высоко эффективных противовирусных препаратов необходимо соединение с более широким диапазоном действующих доз, т. е. с минимальной токсичностью, так как это обеспечивает гарантию использования их в нетоксичной дозе с сохранением ингибирующих свойств. Эти соединения имеют слабую перспективу для применения в клинике еще и потому, что обладает высокой стоимостью.

Указанных недостатков лишен 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксан, предлагаемый как противогерпетическое средство.

Целью изобретения является расширение ассортимента соединений, обладающих активностью против вируса простого герпеса и минимальной токсичностью.

Указанная цель достигается применением известного соединения 2,2,5,5-тетрадиметил-1,3-диоксана с общей формулой

впервые в качестве ингибитора вируса простого герпеса, что соответствует критериям новизны и существенного отличия.

Замещенные 1,3-диоксана широко используются в качестве ингибиторов коррозии, пластификаторов полимеров, флотореагентов, экстрагентов минерального сырья, растворителей, термо- и светостабилизаторов, компонентов смазочных масел и топлива и т. д.

Физико-химические свойства указанных диоксанов известны.

Противогерпетическую активность, а также токсические свойства предлагаемого соединения ин витро определяют по следующей методике. Используют пробирочные культуры фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) с посевной дозой 500000 клеток в 1 мл. Клетки выращивают на питательных средах Игла, 199, гидролизат лактальбумина в равных количествах, с 10% телячьей сыворотки и добавлением пенициллина и стрептомицина по 100 Е/мл, нистатина 25 Е/мл. После образования сплошного монослоя культуру заражают вирусом простого герпеса, штамм Л-2, полученный из музея Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР. Множественность заражения 100 ТЦД_50/0,2 мл. Одновременно в питательную среду вносят различные концентрации изучаемого соединения. Контролем служат клеточные культуры, зараженные вирусом, но без добавления 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана, пробирки помещают в термостат при 37^оС на 24 ч. Через 24 ч после заражения культуру замораживают и оттаивают 3 раза, затем центрифугируют 20 мин при 1000 об/мин.

Методом титрования надосадочной жидкости в культуре клеток определяют урожай вируса в опытных и контрольных культурах. Результаты учитывают через 48 ч по цитопатическому эффекту. Антигерпетическую активность определяют по методу Рида и Менча. Урожай вируса герпеса в контрольных культурах составляет 105 ТЦД_50/0,2 мл. Соединение 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксан в изучаемых концентрациях (1000, 300, 100, 50, 20 и ниже мкг/мл) не является токсичным, так как в течение 3-7 дней не вызывает видимых цитотоксических изменений в неинфицированных культурах.

П р и м е р 1. Определение противогерпетической активности 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана при концентрации 1000, 500, 100 мкг/мл.

Используются пробирочные культуры фибробластов эмбриона человека. После образования сплошного монослоя культуру заражают вирусом простого герпеса, штамм Л-2, множественность заражения 100 ТЦД_50/0,2 мл. Одновременно в питательную среду вносят одну из доз (1000, 500, 100 мкг/мл) изучаемого соединения. Контролем служат клеточные культуры, зараженные вирусом без добавления этого соединения. После определения урожая вирусов в контрольных и опытных культурах получают данные о противогерпетической активности соединения.

Как видно из таблицы, титр вируса в контроле равен 5,0lg ТЦД_50/0,2мл. При добавлении в питательную среду 1000 мкг/мл 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана титр вируса равнялся 0,5lg ТЦД_50/0,2 мл, т. е. ингибирующая активность в этом случае равна 4,5lg ТЦД_50/0,2 мл. Полученные данные позволяют утверждать, что концентрация изучаемого соединения 1000 мкг/мл обладает выраженным противовирусным действием.

Данные таблицы указывают, что концентрация 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана 500 и 100 мкг/мл также обладают выраженным противогерпетическим действием, так как снижают репродукцию вируса на 3,75 и 3,00lg ТЦД_50/0,2 мл соответственно.

Концентрации 1000, 500 и 100 мкг/мл обладают выраженным противовирусным действием.

П р и м е р 2. Определение противогерпетической активности 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана в концентрации изучаемого соединения 20 мкг/мл.

Используют пробирочные культуры фибробластов эмбриона человека. Работа проводится по методике, описанной в примере 1. После определения урожая вирусов в контрольных и опытных культурах получают данные о противогерпетической активности 20 мкг/мл изучаемого соединения.

Как видно из таблицы, титр вируса в контроле равен 5,0lg ТЦД_50/0,2мл. При добавлении 20 мкг/мл титр вируса снижался до 2,5lg ТЦД_50/0,2 мл, т. е. ингибирующая активность соединения в этой дозе равна 2,5lg ТЦД_50/0,2 мл. Полученные данные утверждают, что концентрация 20 мкг/мл обладает умеренным противогерпетическим действием.

П р и м е р 3. Определение противогерпетической активности 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана в концентрациях 10 и 5 мкг/мл.

Используют пробирочные культуры фибробластов эмбриона человека. Работа проводится по методике, описанной в примере 1, но используют концентрации препарата 10 и 5 мкг/мл. После определения урожая вирусов в контрольных и опытных культурах, получают данные о противогерпетической активности 10 и 5 мкг/мл изучаемого соединения.

Как видно из таблицы, титр вируса в контроле равен 5,0lg ТЦД_50/0,2мл. При добавлении 10 и 5 мкг/мл репродукция вируса снижалась до 3,0-3,25lg ТЦД_50/0,2 мл, т. е. ингибирующая активность соединения в этих дозах равна 2-1,75lg ТЦД_50/0,2 мл. Полученные данные позволяют утверждать, что концентрация изучаемого соединения 10 и 5 мкг/мл обладают слабым противовирусным действием.

П р и м е р 4. Определение противогерпетической активности 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана в концентрации 2 и 1 мкг/мл изучаемого соединения.

Используют пробирочные культуры фибробластов эмбриона человека. Работа проводится по методике, описанной в примере 1. После определения урожая вирусов в контрольных и опытных культурах, получают данные о противогерпетической активности 2 и 1 мкг/мл изучаемых соединений.

Как видно из таблицы, при внесении в культуру клеток 2 мкг/мл изучаемого соединения титр вируса в опыте снижался на 1lg ТЦД_50/0,2 мл по сравнению с контролем 5,0lg ТЦД_50/0,2 мл, т. е. концентрация соединения 2 мкг/мл обладает слабым противогерпетическим действием. При внесении в культуру клеток 1 мкг/мл титр вируса в опыте равнялся титру вируса в контроле - 5lg ТЦД_50/0,2 мл, т. е. эта концентрация соединения не обладала противогерпетическим действием. Следовательно, минимальная доза ингибирующей активности для 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана является доза 2 мкг/мл, при которой еще происходит уменьшение репродукции вируса герпеса, т. е. химиотерапевтический индекс равен 500 для этого соединения.

П р и м е р 5. Определение ингибирующей активности 3% -ной мази 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана при экспериментальном герпетическом кератите кроликов.

Ингибирующую активность 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана определяют и в опытах на животных. С этой целью берут две группы кроликов - опытную и контрольную. Роговицы обоих глаз всех животных заражают вирусом простого герпеса известным способом. Через 1 сут, когда появляются клинические симптомы кератита в первой группе подопытных животных в конъюнктивальную полость обоих глаз закладывают мазь, содержащую изучаемый ингибитор 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана в 3% -ной концентрации. Мазь закладывают ежедневно 3 раза. Второй группе животных, которая была контрольной, при экспериментальном герпетическом кератите закладывают в конъюнктивальную полость обоих глаз 3 раза в день ланолиново-вазелиновую мазь, не содержащую изучаемый ингибитор. Оценку ингибирующей активности в обеих группах животных проводят на четвертые сутки с помощью биомикроскопа после окраски роговицы 0,5% -ным раствором флюоресцина, по 4-балльной системе, предложенной профессором Ю. Ф. Майчуком. Применение 3% -ной мази 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана приводит к подавлению размножения вируса герпеса на 4-е сутки (тяжесть клинической картины в эксперименте соответствует 1,3 0,13 балл, а в контроле - 1,8 0,13 балл, при p < 0,01).

Проведенные исследования позволяют утверждать, что максимально переносимая для культуры ФЭЧ концентрация 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана 1000 мкг/мл, а минимально ингибирующая репродукция вируса простого герпеса 2 мкг/мл, т. е. химиотерапевтический индекс соединения равен 500.

Таким образом, это соединение имеет в 5 раз более высокий ХТИ по сравнению с производными фосфоновой кислоты, т. е. обладает более широким диапазоном ингибирующего действия при низкой токсичности. Соединение с таким высоким химиотерапевтическим индексом обеспечивает гарантию использования его в нетоксичной дозе с сохранением ингибирующего эффекта.

Ингибирующая активность 2,2,5,5-тетраметил-1,3-диоксана была подтверждена также и в опытах на животных. Высокий химиотерапевтический индекс обеспечивает гарантию использования изучаемого соединения в нетоксичной дозе с сохранением ингибирующего эффекта. (56) Справочник. Физико-химические свойства 1,3-диоксанов. М. : Химия, 1980, с. 237.