способ получения средства для лечения заболеваний кожи у животных

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОЖИ У ЖИВОТНЫХ, включающий высушивание на воздухе и последующее измельчение морских водорослей рода Laminaria, отличающийся тем, что, с целью повышения терапевтической эффективности средства и одновременного получения D-маннита, воздушно-сухие измельченные водоросли дважды экстрагируют 96% -ным этанолом при 65 - 75^oС, экстракты объединяют и выдерживают при температуре окружающего воздуха не менее 16 ч, выпавший осадок D-маннита отфильтровывают и перекристаллизовывают из водного этанола, фильтрат упаривают досуха, остаток экстрагируют 96% -ным этанолом, а высушивание осуществляют путем упаривания экстракта досуха.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам получения лекарственных средств для животных.

Заболевания кожных покровов у животных, вызванные травмами, ожогами, патогенными грибами и другими факторами, весьма распространены и приводят к выбраковке значительной части скота и спортивных лошадей, а также являются причиной гибели домашних собак, кошек и других животных. Травмы кожных покровов особенно часто встречаются у спортивных лошадей, причем травмирование происходит не только во время состязаний и тренировок, но и в процессе постоянных перевозок животных. Для лечения таких заболеваний наряду с синтетическими препаратами широко применяются препараты, получаемые из природных источников.

Известны способы получения лекарственных средств из различных водорослей, в том числе способы получения препаратов липидной природы. Способы заключаются в приготовлении паст или водных экстрактов из морских водорослей, либо в извлечении липидов и других липофильных веществ из культивируемых одноклеточных водорослей. Препараты, получаемые этими способами, могут применяться в ветеринарии, однако в цитированных источниках отсутствуют конкретные данные об их эффективности при лечении заболеваний кожи. Кроме того, перечисленные способы имеют недостатки. При экстракции водными растворами не извлекаются высокоактивные каротиноиды и полиненасыщенные липиды. В препаратах, представляющих собой продукты механической обработки водорослей (пасты, кремы и т. п. ), концентрация активных компонентов весьма низка, а использование таких средств для лечения животных ограничено, так как оно связано с наложением повязок. Более того, использование водорослей в натуральном виде неэкономично, поскольку они содержат ряд веществ, которые не оказывают терапевтического эффекта (а иногда оказывают отрицательное действие), но широко применяются в других областях и относятся к разряду дефицитных. Что касается липидных препаратов из одноклеточных водорослей, то процесс их получения сложен. Он включает длительную операцию культивирования, требующую специального оборудования, а экстракция целевого продукта проводится при пониженной температуре (от 0 до +5^оС) с использованием высокотоксичного метанола и крайне нежелательного хлороформа (ПДК - 5 мг/м³ воздуха), который к тому же чрезвычайно трудно удалить из липидов полностью.

Наиболее близок по технической сущности к предлагаемому способ получения средства для лечения заболеваний кожи у человека и животных из морских бурых водорослей рода Laminaria, который состоит в высушивании водорослей на воздухе и последующем измельчении. Применение препарата осуществляется путем обработки его горячей водой и аппликации охлажденной кашицы на пораженные участки кожи.

Однако в получаемом препарате концентрация веществ, оказывающих терапевтическое действие, незначительна, вследствие чего эффективность его невысока. Применение препарата, получаемого этим способом, осложняется тем, что в большинстве случаев оно требует наложения повязки, что далеко не всегда возможно при лечении животных. Кроме того, способ не предусматривает извлечение их водоросли высокоценного D-маннита, который не оказывает терапевтического эффекта при обработке поврежденной кожи, но содержится в ламинарии в весьма большом количестве.

Цель изобретения - повышение терапевтической эффективности средства для лечения заболеваний кожи у животных, получаемого из морских водорослей рода Laminaria, и одновременное получение D-маннита.

Цель достигается тем, что воздушно-сухие измельченные водоросли, получаемые известным способом, дважды экстрагируют 96% -ным этанолом при температуре 65-75^оС, экстракты объединяют и выдерживают при температуре окружающего воздуха не менее 16 ч, выпавший осадок D-маннита отфильтровывают и перекристаллизовывают из водного этанола, фильтрат упаривают досуха, остаток экстрагируют 96% -ным этанолом, а экстракт упаривают досуха.

Использование сырой или недостаточно высушенной водоросли влечет за собой необходимость увеличения кратности экстракции, связанное с этим значительное повышение расхода растворителя, а главное, приводит к загрязнению целевого продукта балластными и нежелательными веществами. Применение 96% -ного этанола в качестве экстрагента обусловлено тем, что он малотоксичен, достаточно хорошо растворяет липофильные биоактивные компоненты водоросли, удовлетворительно извлекает D-маннит, но слабо растворяет неорганические соли, присутствующие в сырье в большом количестве. При одноразовой экстракции указанные биоактивные соединения извлекаются не более чем на 65% , при двукратной экстракции степень их извлечения не менее 92% . Хотя при дальнейшей экстракции степень извлечения липидов несколько повышается, экстракт загрязняется неорганическими солями и неидентифицированными органическими веществами, которые не удаляются при последующей реэкстракции; присутствие этих веществ в целевом продукте вызывает отрицательные эффекты при его применении - раздражение кожи, зуд и др.

Проведение экстракции при повышенной температуре увеличивает степень извлечения активных соединений. Однако при температуре выше 75^оС становится весьма заметным окисление и разложение каротиноидов и полиненасыщенных липидов. При температуре ниже 65^оС эффективность извлечения резко снижается и возникает необходимость в увеличении кратности экстракции.

Выдерживание экстракта при температуре окружающего воздуха имеет целью осаждение основной массы извлеченного D-маннита. Максимальное осаждение достигается не менее чем за 16 ч. При более продолжительной выдержке количество осадка не увеличивается. Осаждение D-маннита при пониженной температуре нецелесообразно, поскольку из раствора выпадает часть активных липидных компонентов. Для дальнейшего концентрирования активных веществ фильтрат, полученный после отделения осадка "сырого" маннита, упаривают досуха, а остаток экстрагируют 96% -ным этанолом. После полной отгонки этанола из экстракта получают целевой продукт. В результате перекристаллизации "сырого" маннита из водного этанола получают препарат D-маннита с содержанием основного вещества 98,8-99,3% .

Вышеописанным способом из 1,0 кг воздушно-сухой водоросли L. saccharina или L. digitata получают 20,0-22,5 г целевого продукта и 37-42 г D-маннита. Целевой продукт, получаемый из того и другого вида ламинарии, практически одинаков в отношении физико-химических и лечебных свойств. Продукт представляет собой мазеобразное вещество зеленовато-бурого цвета в тонком слое с характерным запахом водоровлей, состоит из липидов (82-86% общей массы), каротиноидов (3,8-4,2% ), аминокислот и дипептидов (3,5-4,5% ), порфириновых производных (3-4% ), неорганических солей (1,2-1,4% ), флавоноидов (0,09-0,12% ). В состав липидов входят нейтральные глицериды (60-64% ), фосфо- и гликолипиды (27-29% ).

Целевой продукт характеризуется следующими физико-химическими параметрами:

плотность 50% -ного раствора в 96% -ном этаноле 0,9090,001 г/см³ при 20^оС;

температура затвердевания 12,5 0,2^оС;

относительная вязкость 50% -ного раствора в 96% -ном этаноле при 20^оС 6,00,1 относительно 96% -ного этанола;

показатель преломления 50% -ного раствора в -бромнафталине n_D²⁰ 1,6802 0,0004;

оптическое поглощение 0,1% -ного раствора в 96% -ном этаноле _макс. (Е): 407 (1,430,02), 505 (0,400,02), 538 (0,33 0,01), 607 (0,270,02), 666 (0,910,02) нм;

массовая доля связанных углеводов (свободные углеводы отсутствуют) 0,3 0,1% ;

массовая доля липидного фосфора 0,85 0,15% ;

зольность 1,60,2% ;

кислотное число 18,10,5 мг едкого натра (0,4520,012 мг-экв) на 1,0 г препарата;

число омыления 86,50,6 мг едкого кали (1,5450,011 мг-экв) на 1,0 г препарата;

иодное число 54210 мг иода, связываемого 1,0 г препарата.

Каждый из приведенных параметров определяли не менее чем на 10 образцах, отобранных из различных партий целевого продукта. Получаемый одновременно препарат D-маннита содержит 98,8-99,3% основного вещества, имеет температуру плавления 167-168^оС и удельное оптическое вращение [ ] _D²⁰ - 0,550,15^о (вода; с 6).

Несмотря на высокую степень ненасыщенности, препарат устойчив при комнатной температуре и хранится без заметного изменения физико-химических и терапевтических свойств не менее 1 года при температуре 15-25^оС. Это обусловлено присутствием в нем природных антиоксидантов - диосметина и лютеолина.

П р и м е р 1. В стеклянный реактор емкостью 15 л загружают 1,0 кг воздушно-сухой (остаточная влажность 25% ) и измельченной в порошок водоросли L. saccharina, собранной на Белом море, и 8,0 л 96% -ного этанола. Смесь перемешивают 2 ч при 65^оС и сразу же без охлаждения фильтруют через стеклянный пористый фильтр (здесь и далее фильтр N 2) с отсасыванием. Отфильтрованный биоматериал загружают в тот же реактор и экстрагируют 96% -ным этанолом в указанных условиях. Полученные экстракты объединяют и выдерживают 16 ч при 20^оС. Выпавший белый кристаллический осадок, состоящий, в основном, из D-маннита, отфильтровывают, а фильтрат упаривают досуха (здесь и далее отгонку этанола осуществляют на ротационном испарителе при температуре водяной бани 35-40^оС и остаточном давлении 20-25 мм рт. ст. ). К остатку (54 г) добавляют 600 мл 96% -ного этанола и смесь перемешивают 1 ч при 20^оС, после чего фильтруют и фильтрат упаривают досуха. Остаток сушат 4 ч при 40^оС и остаточном давлении 0,2 мм рт. ст. Получают 20,0 г целевого продукта.

Отфильтрованный осадок "сырого" маннита (сухой вес 42,8 г) заливают 300 мл 80% -ного этанола, смесь перемешивают при умеренном кипении до прекращения растворения осадка (10 мин), после чего фильтруют в горячем состоянии. Фильтрат выдерживают 2 ч при 20^оС и 6 ч при 10^оС. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывают и сушат 4 ч при 50^оС и давлении 20 мм рт. ст. Получают 37,1 г D-маннита с содержанием основного вещества 99,3% по данным газовой хроматографии соответствующего триметилсилильного производного.

П р и м е р 2. Воздушно-сухую и измельченную в порошок водоросль L. saccharina (1,0 кг) дважды экстрагируют 96% -ным этанолом в условиях примера 1, за исключением того, что экстракцию проводят при 75^оС. Дальнейшую обработку экстракта осуществляют, как описано в примере 1. Получают 22,1 г целевого продукта и 41,9 г D-маннита с содержанием основного вещества 98,8% .

П р и м е р 3. Воздушно-сухую и измельченную в порошок водоросль L. saccharina (1,0 кг) дважды экстрагируют 96% -ным этанолом в условиях примера 1, за исключением того, что экстракцию проводят при 71^оС. Дальнейшую обработку экстракта осуществляют, как описано в примере 1. Получают 22,0 г целевого продукта и 42,0 г D-маннита с содержанием основного вещества 99,3% .

П р и м е р 4. Воздушно-сухую и измельченную в порошок водоросль L. digitata (1,0 кг) дважды экстрагируют 96% -ным этанолом в условиях примера 1, за исключением того, что экстракцию проводят при 72^оС. Обработку экстракта осуществляют, как указано в примере 1. Получают 20,2 г целевого продукта и 37,4 г D-маннита с содержанием основного вещества 99,1% .

Вышеописанный способ представляет собой принципиально новый технологический процесс, который имеет следующие главные преимущества по сравнению с известным способом:

целевой продукт, получаемый предложенным способом, в значительно большей степени обогащен биологически активными веществами липидной природы (каротиноиды, липиды, включающие полиненасыщенные жирные кислоты, и другие), что резко повышает терапевтический эффект препарата;

целевой продукт представляет собой мазеобразное вещество, которое хорошо удерживается на поверхности кожи, что позволяет успешно применять его для лечения животных;

способ позволяет одновременно получать препарат D-маннита высокой степени очистки; D-маннит широко применяется в фармацевтической и пищевой промышленности, при производстве поверхностно-активных веществ, смол, лаков, а кроме того, используется в научно-исследовательских работах.

Токсикологические исследования целевого продукта, которому присвоено название "Альгалипин", проведены на 256 нелинейных белых мышах. Дозы препарата для подопытных животных рассчитывали на 1 кг массы тела и вводили внутрижелудочно. Альгалипин испытывали, начиная с дозы, не вызывающей учитываемой реакции ни у одного из животных, до дозы, вызывающей 100% -ную гибель. Клинические наблюдения за подопытными животными велись в течение семи дней. Величину LD₅₀ рассчитывали по методу Кербера. Для Альгалипина LD₅₀ составляет 27,0-34,0 мл/кг, а для его 50% -ного раствора в 60% -ном этаноле 19,5-21,0 мл/кг. Согласно ГОСТ 12.1.07.76 препарат относится к малотоксичным веществам.

Раздражающее действие Альгалипина изучалось на 21 кролике породы шиншилла с массой тела 2-3 кг. В конъюнктивный мешок правого глаза каждого животного глазной пипеткой вносили 2 капли Альгалипина; состояние левого глаза служило контролем. Для сравнения отдельной группе кроликов вводили тем же способом бальзамический линимент Вишневского. Визуальную оценку раздражающего действия препаратов производили через 1, 2, 3, 4 и 24 ч, отмечая изменения в кровенаполнении конъюнктивы, наличие лакримации и состояние роговицы. Признаки раздражения глаза после введения Альгалипина полностью исчезали через 1 ч, что свидетельствует, скорее, о механической причине раздражения. Точно такой же эффект оказывал линимент Вишневского. Раздражение конъюнктивы вышеуказанным спиртовым раствором Альгалипина было более продолжительным (2 ч). Таким образом, Альгалипин дает слабо выраженный раздражающий эффект.

Раздражающее действие Альгалипина на кожу оценивали на белых мышах, крысах, кроликах и морских свинках. На спине животного выбривали участок размером : 1 х 1 см у мышей, 2 х 2 см у крыс и морских свинок, 4 х 5 см у кроликов, и через сутки после снятия шерсти втирали Альгалипин или его спиртовый раствор в количестве 0,2 мл на 1 кг массы животных в течение 5 мин. Каждую партию препарата (всего 6 партий) испытывали на 10 мышах, 5 крысах, 3 морских свинках и 3 кроликах. Контрольным группам животных (такой же численности) втирали линимент Вишневского. Установлено, что втирание препаратов в течение 7 сут по одному разу в сутки не вызывает изменения в поведении животных, на участках нанесения препаратов не отмечено покраснения кожи, расчесов, утолщения кожной складки.

Таким образом, комплекс проведенных испытаний свидетельствует о том, что Альгалипин и его спиртовой 50% -ный раствор малотоксичны и не вызывают побочного действия при многократном применении. Репаративные свойства Альгалипина и его спиртового раствора исследовали на 12 овцах романовской породы в возрасте 1 год и на 9 собаках. Для сравнения использовали бальзамический линимент Вишневского. До начала эксперимента, через 24 ч после нанесения ран, а также на 3-, 5-, 10-, 15-, 20- и 23-й день определяли по общепринятым методикам клинико-гематологические показатели (концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов и лейкоцитов в крови, содержание белка в сыворотке крови), проводили гистологические исследования и определяли уровень АТФ.

Констатировано явное противовоспалительное и противоотечное действие Альгалипина и его спиртового раствора, а также его способность стимулировать регенеративные процессы. Так, через три дня после начала лечения в лейкоцитарном инфильтрате преобладали мононуклеарные формы, а в глубоких слоях с более зрелой грануляционной тканью появились признаки фиброплазии. В случае применения линимента Вишневского подобная гистологическая картина наблюдалась, в основном, лишь на 5-6 день, у нелеченных животных - на 7-10 день, а при использовании препарата ламинарии, полученного в соответствии со способом-прототипом, - на 7-8 день. Альгалипин и его спиртовой раствор ощелачивают раневую среду в первой фазе раневого процесса, что способствует росту и развитию полноценной грануляционной ткани. Линимент Вишневского стимулирует регенерацию во второй фазе раневого процесса. Полное заживление ран под действием Альгалипина наступает у животных быстрее, чем в случае применения линимента Вишневского, и значительно быстрее, чем при использовании препарата сухой ламинарии. (56) Кизеветтер И. В. и др. Переработка морских водорослей и других промысловых водных растений. М. : Пищевая промышленность, 1967.