устройство для регулируемого по времени определения флуоресценции

Формула изобретения

1. Устройство для регулируемого по времени определения флуоресценции для применения в секвенировании ДНК, содержащее:

- область вмещения для удержания компонентов реакции секвенирования,

- первый источник света, выполненный с возможностью испускать первый световой импульс с первой длиной волны, и второй источник света, выполненный с возможностью испускать второй световой импульс со второй длиной волны, причем первая длина волны отличается от второй длины волны, и сконфигурированы так, что первый и второй световые импульсы поочередно попадают на область вмещения,

- пиксель детектора, выполненный с возможностью взаимодействия с областью вмещения для определения света, исходящего из области вмещения, содержащий:

- детектор,

- вывод, выполненный с возможностью переноса электрического сигнала от пикселя детектора,

- средство стробирования для стробирования детектора, выполненного с возможностью не определять первый и второй световые импульсы, испускаемые первым и вторым источниками света,

отличающееся тем, что

- пиксель детектора дополнительно содержит первый аккумулятор и второй аккумулятор, выполненные с возможностью взаимодействия с детектором и выводом, причем

- первый аккумулятор выполнен с возможностью накопления электрического сигнала от детектора в ответ на первый световой импульс, попадающий на компоненты реакции секвенирования,

- второй аккумулятор выполнен с возможностью накопления электрического сигнала от детектора в ответ на второй световой импульс, попадающий на компоненты реакции секвенирования.

2. Устройство по п.1, в котором вывод выполнен с возможностью предоставления состояния первого и второго аккумуляторов.

3. Устройство по п.1 или 2, в котором содержимое первого и второго аккумуляторов предназначено для периодической передачи через вывод на устройство обработки.

4. Устройство по п.1, причем устройство дополнительно содержит третий источник света, выполненный с возможностью испускать третий световой импульс с третьей длиной волны, и четвертый источник света, выполненный с возможностью испускать четвертый световой импульс с четвертой длиной волны, причем третья длина волны отличается от четвертой длины волны, и сконфигурированы так, что третий и четвертый световые импульсы попадают в область вмещения последовательно относительно друг друга и относительно первого и второго световых импульсов.

5. Устройство по п.4, в котором пиксель детектора дополнительно содержит:

- третий аккумулятор, выполненный с возможностью накопления электрического сигнала от детектора в ответ на третий световой импульс, попадающий на компоненты реакции секвенирования, и

- четвертый аккумулятор, выполненный с возможностью накопления электрического сигнала от детектора в ответ на четвертый световой импульс, попадающий на компоненты реакции секвенирования.

6. Устройство по п.1, в котором первый, второй, третий или четвертый источники света содержат импульсный лазер.

7. Устройство по п.6, в котором импульсный лазер выполнен с возможностью посылать импульсы с периодом в диапазоне от 10 нс до 1 мкс, наиболее предпочтительно посылать импульсы с периодом в диапазоне от 100 нс до 400 нс.

8. Устройство по п.6, причем устройство сконфигурировано так, что разница во времени между двумя последовательными срабатываниями импульсного лазера находится в диапазоне от 10 нс до 1 мкс, наиболее предпочтительно составляет 100 нс.

9. Устройство по п.1, в котором детектор содержит SPAD массив.

10. Устройство по п.1, в котором пиксель детектора дополнительно содержит по меньшей мере одну таблицу соответствия, выполненную в виде памяти на пикселе детектора.

11. Массив, содержащий множество устройств по любому из предыдущих пунктов.

12. Массив, содержащий множество устройств по любому из пп.1-9, при этом в массиве предоставлена по меньшей мере одна таблица соответствия.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к области секвенирования ДНК, в частности к секвенированию ДНК с использованием регулируемого по времени определения флуоресценции для идентификации оснований ДНК.

В частности, изобретение относится к устройству для регулируемого по времени определения флуоресценции для применения в секвенировании ДНК, которое содержит:

- область вмещения для удержания компонентов реакции секвенирования;

- первый источник света, выполненный с возможностью испускать первый световой импульс с первой длиной волны, и второй источник света, выполненный с возможностью испускать второй световой импульс со второй длиной волны, причем первая длина волны отличается от второй длины волны, и первый и второй световые импульсы поочередно попадают на область вмещения;

- пиксель детектора, выполненный с возможностью взаимодействия с областью вмещения для определения света, исходящего из области вмещения, содержащий:

- детектор;

- вывод, выполненный с возможностью переноса электрического сигнала от пикселя детектора;

- средство стробирования для стробирования детектора, выполненного с возможностью не определять первый и второй световые импульсы, испускаемые первым и вторым источниками света.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Секвенирование ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) известно на протяжении многих лет. Основная идея идентификации строительных блоков нуклеиновой кислоты, содержащей генетические инструкции, используемые всеми известными живыми организмами при развитии и жизнедеятельности, развита на основе исследования кодов и обусловлена желанием использовать генетическую информацию для борьбы с заболеванием.

Основная роль молекулы ДНК заключается в долгосрочном хранении информации. Помимо других функций, в участках, обозначаемых генами, она содержит инструкции, необходимые для постройки компонентов клеток. Химически ДНК состоит из двух длинных полимеров простых блоков, называемых нуклеотидами, эти две цепи идут в противоположных направлениях относительно друг друга. Остовы двух цепей состоят из сахаров и фосфатных групп, соединенных сложноэфирными связями. К каждому сахару прикреплена молекула, называемая основанием, одного из четырех типов A, C, G или T. Эта последовательность из этих четырех оснований вдоль остова кодирует информацию. Идентифицируя эти основания и их последовательность, можно получить большое количество информации.

В течение многих лет способ Сэнгера представлял собой стандартный способ секвенирования ДНК. Этот способ требует очень больших финансовых и временных затрат. Другие способы разработаны с целью сделать секвенирование более эффективным и доступным.

Многие новые способы основаны на флуоресцентной визуализации для идентификации оснований, известной как обращение к основанию. Флуоресцирующую группу присоединяют к основанию одного конкретного типа. Флуоресценцию в нуклеотиде осуществляют посредством поглощения света известной длины волны. Флуоресценция происходит на другой, слегка отличающейся известной длине волны. Определение света флуоресценции указывает на присутствие конкретного основания. Существуют одноцветные системы флуоресценции, где различные текучие вещества, содержащие реактивы для секвенирования, последовательно пропускают через образец, и флуоресценция указывает на присутствие различных оснований ДНК в образце ДНК. Другой способ флуоресцентной визуализации известен как четырехцветная флуоресценция, поскольку используют свет с четырьмя различными длинами волн, тем самым обеспечивая возможность одновременного присутствия нуклеотидов четырех различных типов (необходимых для реакции секвенирования) в устройстве для секвенирования. Таким образом, смену текучих веществ в устройстве (которая происходит очень медленно) можно снизить или свести к минимуму.

Тип четырехцветной флуоресценции описан в патентной заявке США US 2006/0139634. В другой работе авторов Lewis и др. (PNAS, 2005, том 102, No 15, стр. 5346) подробно описан способ временных цветных вспышек, в котом используют лазеры непрерывного действия, блокирующие фильтры и оптику со сложной юстировкой, чтобы добиться определения заданного основания ДНК. Дальнейшие попытки сконцентрированы на разрешении постоянной времени затухания флуоресценции, например, авторами Zhu и др. (Anal. Chem., 2003, том 75, No 10, стр. 2280). Нужен дальнейший прогресс в секвенировании генов, поскольку секвенирование целого генома или повторное секвенирование для заболеваний, таких как рак, будет иметь огромное медицинское значение.

Проблема, связанная с описанными выше устройствами и способами, заключается в длительном производственном времени, необходимом для получения информации секвенирования.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цель изобретения состоит в том, чтобы усовершенствовать скорость получения результатов секвенирования.

Согласно изобретению эту цель достигают посредством предоставления устройства для регулируемого по времени определения флуоресценции для применения в секвенировании ДНК, содержащего пиксель детектора, которое дополнительно содержит:

- первый аккумулятор и второй аккумулятор, выполненные с возможностью взаимодействия с детектором и выводом,

- первый аккумулятор предназначен для накопления электрического сигнала от детектора в ответ на первый световой импульс, попадающий на компоненты реакции секвенирования;

- второй аккумулятор предназначен для накопления электрического сигнала от детектора в ответ на второй световой импульс, попадающий на компоненты реакции секвенирования.

Компоненты реакции секвенирования содержат образец секвенируемой ДНК и первый и второй флуоресцентно меченый нуклеотид, которые связаны с конкретными первым и вторым основаниями образца ДНК, соответственно. Первый световой импульс от источника света выполнен так, чтобы соответствовать сильной абсорбции первого флуоресцентно меченого нуклеотида так, что молекула абсорбирует световую энергию, которая затем может быть испущена в виде света флуоресценции с другой длиной волны. Второй световой импульс выполнен так, чтобы взаимодействовать со вторым флуоресцентно меченым нуклеотидом аналогичным образом, вторая флуоресценция происходит при длине волны, отличной от первой флуоресценции. Таким образом, определение света флуоресценции, вызванного первым или вторым световыми импульсами, указывает на присутствие первого или второго основания. Детектор передает информацию определения на аккумулятор.

В дополнительном варианте осуществления изобретения вывод выполнен с возможностью предоставления состояния первого и второго аккумуляторов.

Соединяя конкретный аккумулятор с эмиссией флуоресценции, следующей за попаданием на компоненты реакции секвенирования конкретного светового импульса, аккумулятор становится средством для прямого обращения к определяемому основанию ДНК. Накопление электронных сигналов, превышающих ожидаемый фоновый шум или превышающих заданный пороговый уровень, в аккумуляторе представляет собой признак флуоресцентного ответа на конкретное основание. Таким образом, в отношении присутствия основания аккумулятор предоставляет состояние да/нет или 1/0. Затем это состояние может стать выходом пикселя без необходимости обеспечения дополнительной электронной обработки или медленной передачи информации аналогового сигнала.

В дополнительном варианте осуществления изобретения содержимое первого и второго аккумуляторов выполнено с возможностью периодической передачи через вывод на устройство обработки.

Информацию в аккумуляторах можно считывать как часть передачи информации на внешнюю схему или устройство. Так как обращение к основанию уже облегчено посредством использования аккумуляторов, то скорость, с которой эта информация становится доступной, значительно усовершенствована относительно способов секвенирования в известном уровне техники.

В дополнительном варианте осуществления изобретения устройство дополнительно содержит третий источник света, выполненный с возможностью испускать третий световой импульс с третьей длиной волны, и четвертый источник света, выполненный с возможностью испускать четвертый световой импульс с четвертой длиной волны, причем третья длина волны отличается от четвертой длины волны, и третий и четвертый световые импульсы попадают на область вмещения последовательно относительно друг друга и относительно первого и второго световых импульсов.

В дополнительном варианте осуществления изобретения пиксель детектора дополнительно содержит:

- третий аккумулятор, предназначенный для накопления электрического сигнала от детектора в ответ на третий световой импульс, попадающий на компоненты реакции секвенирования, и

- четвертый аккумулятор, предназначенный для накопления электрического сигнала от детектора в ответ на четвертый световой импульс, попадающий на компоненты реакции секвенирования.

Эти варианты осуществления иллюстрируют оптимальную ситуацию, когда все четыре основания ДНК изучают одновременно, и для каждого основания предназначен источник света и аккумулятор.

В дополнительном варианте осуществления изобретения первый, второй, третий или четвертый источники света содержат импульсный лазер.

Импульсный лазер или импульсный лазерный диод представляет собой источник света, который имеет спектральную линию узкой ширины по сравнению с другими источниками света. Такая узкая ширина линии избегает проблем с взаимной контаминацией спектральных излучений, которые могут происходить при использовании других источников света вследствие спектрального перекрытия различных световых импульсов.

В дополнительном варианте осуществления изобретения импульсный лазер срабатывает с периодом в диапазоне от 10 нс до 1 мкс, наиболее предпочтительно срабатывает с периодом в диапазоне от 100 нс до 400 нс.

В дополнительном варианте осуществления изобретения разница во времени между последовательными срабатываниями первого и второго импульсного лазера находится в диапазоне от 10 нс до 1 мкс, наиболее предпочтительно она составляет 100 нс.

Периоды срабатывания одного лазера или двух лазеров последовательно представляют собой компромисс между желаемой скоростью процесса секвенирования и способностью детектора давать чистый сигнал с хорошей характеристикой отношения сигнала к шуму, который можно преобразовать в надежное обращение к основанию. Частота следования импульсов лазера должна быть как можно выше, чтобы возбуждать максимально возможное количество фотонов флуоресценции, но в устройстве на основе однофотонного полупроводникового стабилитрона с лавинным пробоем (SPAD) шум обусловлен эффектом, известным как постимпульсный эффект, который ослабевает со временем (т.е. чем дольше пауза, тем меньшее количество шума воздействует на сигнал). Уровень шума зависит от качества кремния детектора, но как правило пауза 100 нс между импульсами является эффективной.

Частоту следования импульсов лазера можно определять с учетом разности частоты следования импульсов нескольких лазеров.

В дополнительном варианте осуществления изобретения детектор содержит SPAD массив.

SPAD массив чувствителен к испусканию отдельных фотонов, имеет низкую шумовую характеристику и его можно использовать в сочетании с цепями на КМОП-транзисторах для обработки сигнала от SPAD, тем самым преобразуя отдельный фотон в цифровой бит. Это дает SPAD детектору преимущества над более медленными и более шумными детекторами, такими как CCD или (независимый) КМОП.

В дополнительном варианте осуществления изобретения пиксель детектора дополнительно содержит по меньшей мере одну таблицу соответствия, выполненную в виде памяти на пикселе детектора.

Таблицу соответствия можно использовать для коррекции смещений значений аккумулятора, которые могут происходить вследствие, например, различий квантовой эффективности детектора в зависимости от цвета или длины волны определяемого света. Чтобы гарантировать точность результатов обращения к основанию, информацию таблицы соответствия предпочтительно следует реализовать перед осуществлением обращения к основанию.

В дополнительном варианте осуществления изобретения устройство согласно изобретению входит в массив, содержащий множество таких устройств.

Таким образом, пиксели детектора, составляющие пару с областями вмещения, вмещающими компоненты реакции секвенирования, размещаются в виде массива. Массив может быть, например, одно- или двухмерным. Далее такой массив обеспечивает индивидуальное определение реакций секвенирования и оснований, сравнимое с секвенированием высокой или умеренной плотности. Примером секвенирования высокой плотности является секвенирование SOLID, где используют случайные массивы с миллионами образцов. Типичным представителем секвенирования средней плотности является подход компании Roche/454 Life Sciences, в котором используют приблизительно 1,6 миллиона лунок для образцов.

В дополнительном варианте осуществления изобретения устройство по изобретению входит в массив, содержащий множество устройств, в массиве предусмотрена по меньшей мере одна таблица соответствия.

Таблицу соответствия можно использовать для коррекции смещений значений аккумулятора, которые могут происходить, например, вследствие различий квантовой эффективности детектора в зависимости от цвета или длины волны определяемого света. Чтобы гарантировать точность результатов обращения к основанию, информацию таблицы соответствия предпочтительно следует реализовать перед осуществлением обращения к основанию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Далее изобретение дополнительно описано со ссылкой на фигуры:

Фиг. 1: схематическое изображение устройства согласно изобретению.

Фиг. 2: представлена часть варианта осуществления изобретения, содержащая SPAD детектор и четыре аккумулятора.

Фиг. 3: представлена часть варианта осуществления изобретения, содержащая таблицы соответствия.

Фиг. 4: показано последовательное срабатывание импульсных лазерных источников света согласно изобретению.

Фиг. 5: показано стробирование детектора во время срабатывания лазера согласно изобретению.

Фиг. 6: показан массив устройств согласно изобретению.

Фиг. 7: показан дополнительный вариант осуществления изобретения для массива устройств.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Секвенирование в контексте настоящего изобретения и его варианты осуществления не ограничены ДНК и также относятся к секвенированию, где конечной целью является определение пар оснований нуклеиновой кислоты, например RNA, PNA, LNA.

На фиг. 1 представлено устройство 10 для регулируемого по времени определения флуоресценции для применения в секвенировании ДНК согласно изобретению. Предусмотрена область 11 вмещения, в которой можно расположить образцы секвенируемой ДНК, флуоресцентно меченые нуклеотиды и другие компоненты, необходимые для реакций секвенирования (не показаны). Область 11 вмещения может содержать, например, плоскую поверхность или полость в подложке или лунку. Эта область 11 вмещения образует пару с пикселем 12 детектора. Здесь термин «пиксель» определен как область устройства, предназначенная для определения и обработки света, исходящего из области 11 вмещения. В устройстве предусмотрен первый источник 13 света и второй источник 14 света, которые испускают первый световой импульс 15 с первой длиной волны и второй световой импульс 16 со второй длиной волны соответственно. Первая длина волны отличается от второй длины волны, и их обе выбирают для оптимального взаимодействия с конкретными флуорофорами, связанными с конкретными основаниями ДНК, A, C, G или T, в образце секвенируемой ДНК.

Первый световой импульс 15 попадает на компоненты реакции секвенирования (не показаны). Абсорбция света первого светового импульса 15 флуоресцентно меченым нуклеотидом (не показан) приводит к испусканию флуоресценции, свет 17 флуоресценции можно определить посредством детектора 18, расположенного в или на пикселе 12 детектора. Свет 17 флуоресценции указывает на присутствие конкретного основания ДНК. Второй световой импульс 16, попадающий на компоненты реакции секвенирования последовательно за первым световым импульсом или поочередно с ним, взаимодействует с другим флуоресцентным нуклеотидом схожим образом, чтобы указать на присутствие другого конкретного основания ДНК. В устройстве предусмотрено средство 19 стробирования, которое предотвращает непосредственное определение первого 15 и второго 16 световых импульсов посредством детектора 18, и поэтому определяется только свет 17 флуоресценции. Фактически это обозначает, что существует период определения после испускания первого светового импульса 15, после которого детектор переводится в неактивное состояние с помощью средства 19 стробирования во время срабатывания второго светового импульса 16 и его попадания на компоненты реакции секвенирования, детектор активируется в течение периода определения после испускания второго светового импульса 16 и снова переводится в неактивное состояние под действием средства 19 стробирования перед генерацией другого светового импульса первым источником 13 света. Этот цикл продолжается поочередными срабатываниями первого 13 и второго 14 источников света.

Пиксель 12 детектора дополнительно содержит первый аккумулятор 20 и второй аккумулятор 21. Первый аккумулятор 20 предназначен для накопления информации определения от детектора 18 во время интервала определения после попадания первого светового импульса 15 на компоненты реакции секвенирования. Таким образом, первый аккумулятор 20 эффективно предназначен для определения конкретного основания ДНК. Второй аккумулятор 21 предназначен для накопления информации определения от детектора 18 во время интервала определения после попадания второго светового импульса 16 на компоненты реакции секвенирования. Таким образом, второй аккумулятор 21 схожим образом предназначен для определения (другого) конкретного основания ДНК. При определении основания доступ к информации от аккумуляторов получают через вывод 22 из пикселя детектора.

На фиг. 2 схематически изображена часть варианта осуществления согласно настоящему изобретению, где детектор 18 представляет собой детектор 23 на основе однофотонного полупроводникового стабилитрона с лавинным пробоем (SPAD), выполненный с возможностью определения света 17 флуоресценции, испускаемого компонентами реакции секвенирования (не показаны). Вариант осуществления содержит четыре импульсных источника света (не показаны), устройство выполнено с возможностью определения четырех оснований ДНК, A, C, G и T, и работает, как описано выше. Вариант осуществления дополнительно содержит четыре аккумулятора 25, 26, 27 и 28, предназначенные для оснований A, C, G и T соответственно, которые подают сигнальную информацию 24, относящуюся к определяемой флуоресценции, от детектора 23 SPAD, в соответствии с чем срабатывают четыре световых импульса. Переключатель 29 направляет информацию детектора SPAD на надлежащий аккумулятор 25, 26, 27 или 28, сигнальная информация от детектора 23 SPAD доступна только одному аккумулятору одновременно. Можно добавить средство определения порога (не показано) для оценки содержимого аккумулятора или сравнения с желаемыми уровнями сигнала, чтобы усовершенствовать достоверность данных для обращения к основанию ДНК.

Вариант осуществления описан в отношении аккумуляторов, но для того чтобы упростить конструкцию пикселя, также можно использовать память объемом 1 бит в качестве альтернативы аккумулятору.

Вариант осуществления описан в отношении детекторов SPAD, но можно использовать другие детекторы, в частности однофотонные детекторы. Однако SPAD обладает существенными преимуществами.

На схеме, предложенной на фиг. 2, детектор деактивирован, когда импульсный источник света, например импульсный лазер, включен, и активирован, когда лазер выключен. Для случая, в котором срабатывает свет четырех цветов с интервалом в 10 нс, нельзя гарантировать достоверность одного времени определения длительностью 10 нс, но 1000 таких событий позволяет определить основание с очень высокой точностью. В общем, для этого примера необходимо 40 мкс. Это на порядки выше скорости, с которой может работать схема секвенирования известного уровня техники.

SPAD имеют субнаносекундные скорости ответа и их можно эффективно обнулять в течение наносекунды с использованием КМОП схемы, которая расположена на той же кремниевую подложку, что и детектор SPAD. Однофотонное свойство детектора SPAD обозначает, что значительное число интервалов определения не определяют фотон, например, что обусловлено направлением испускания фотона от детектора, несовершенной квантовой эффективностью детектора или шумом, вызывающим срабатывание детектора. Возможно, определяют только 10% фотонов. Однако даже за период 40 нс (нижний предел) можно определить приблизительно 100 фотонов. Тепловой шум для устройства SPAD 2 мкм × 2 мкм при комнатной температуре составляет приблизительно 5 счетов/с и, следовательно, почти не имеет значения в пределах 40 мкс. Предположим, что 80% фотонов возникают в результате правильной флуоресценции конкретного основания. (Хотя это может меняться - некоторые приборы известного уровня техники достигают только от 40 до 60% вследствие перекрестных помех, возникающих из-за перекрытия спектров.) Предположим, что максимальная скорость оснований, встроенных в цепь ДНК для секвенирования, составляет приблизительно 1 кГц. Возможно несколько порядков величины интервалов определения, например, ×250, что дает 25000 фотонов, уменьшает ошибки счета с приблизительно 10% до 0,6% и тем самым делает возможной высокую надежность даже в присутствие значительных перекрестных помех.

На фиг. 3 изображена часть варианта осуществления изобретения 30, содержащая таблицы соответствия. Значения аккумулятора передаются в таблицу соответствия перед обращением к основанию, как показано стрелками 36. В представленном варианте осуществления предусмотрены четыре таблицы 31, 32, 33, и 34 соответствия, но не всегда может требоваться четыре. В некоторых случаях может требоваться только одна, например, используемая либо отдельно для одного аккумулятора, либо одна для всех аккумуляторов 25, 26, 27 и 28. Необходимость предусмотреть таблицы 31, 32, 33 и 34 соответствия зависит от эффективности устройства в отношении определения испускаемого света флуоресценции. Эффективность детектора зависит от цвета или длины волны и это может вносить смещение в значения подсчета. Задача таблиц 31, 32, 33 и 34 соответствия состоит в том, чтобы корректировать смещение перед обращением к любым основаниям, тем самым, повышая качество и надежность результата. Точность данных является очень точным вопросом, в частности, имеющим отношение к использованию информации секвенирования в клинических применениях. Максимальный счет можно передать (показано стрелками 37) на дополнительные средства обработки 35 и использовать в них, чтобы обратиться к основанию посредством сравнения с другими аккумуляторами или посредством сравнения с известным пороговым значением для вывода 22.

В качестве примера пиксель детектора, который осуществит максимальный подсчет фотонов, чтобы добиться обращения к основанию, может содержать кремниевую подложку, допускающую реализацию устройств SPAD (предпочтительно чувствительных к длинам волн от синей до красной и ближней инфракрасной части спектра) с КМОП транзисторными устройствами размерами значительно меньше микрона. SPAD можно буферизовать с использованием инвертора, с использованием любого вывода, являющегося обратной связью с SPAD, для создания активного сброса известным образом. Переключение аккумуляторов, чтобы сделать возможным обращение к основанию на уровне пикселя, требует синхронизации с подходящим интервалом определения, как указано выше.

Аккумуляторы можно реализовать, например, цифровым образом, используя счетчик и считывающий триггер-защелку, или аналоговым образом, используя, например, генератор подкачки заряда, который перекачивает небольшой сохраненный заряд от однократного срабатывания SPAD на запоминающий конденсатор большего размера, напряжение на котором постепенно увеличивается по мере накопления срабатываний SPAD в нескольких интервалах определения. Связанные пиксели должны иметь минимально возможные размеры, чтобы допустить максимальную плотность сайтов секвенирования. При использовании КМОП c размерами значительно меньше микрона в определяющем аппаратном обеспечении предусмотрен пиксель 50 мкм на 50 мкм.

На фиг. 4 дополнительно изображено последовательное срабатывание импульсных лазерных источников света согласно изобретению. Этот вариант осуществления иллюстрирует временные промежутки, которые считают возможным оптимальным набором временных промежутков, но их не следует рассматривать в качестве ограничения.

Импульсный источник света, здесь изображенный в виде импульсного лазера, предназначен для определения каждого из четырех оснований ДНК, A, C, G и T. Режимы срабатывания 38, 39, 40 и 41 для каждого лазера показаны на фигуре вместе со связанным основанием ДНК. Каждый лазер (не показан) обозначен в виде срабатывания с периодом, обозначенным стрелкой 42. Оптимальный период для этого периода времени составляет приблизительно 400 нс, в частности между 100 нс и 400 нс, но он может находиться в диапазоне между 10 нс и 1 мкс. Представлен период задержки между последующими срабатываниями различных лазеров, как показано стрелками 43, который также может находиться в диапазоне между 10 нс и 1 мкс, но предпочтительно в диапазоне между 100 нс и 400 нс. Здесь все периоды задержки изображены одинаковыми, но это не следует рассматривать в качестве ограничения. Период задержки между последовательными срабатываниями 43, как показано здесь, составляет 100 нс по отношению к периоду импульса 42, составляющему 400 нс.

Как можно видеть на фигуре, первый лазер срабатывает 38 и в течение периода времени 43 второй лазер срабатывает. Между этими двумя срабатываниями можно настроить детектор (не показан) на регистрацию любого света флуоресценции, поступающего из компонентов реакции секвенирования (не показан), который затем будет присвоен в качестве указания на присутствие основания ДНК A. Между последовательными срабатываниями 39, 40 второго и третьего лазеров, определяемую флуоресценцию припишут основанию ДНК C, и так далее.

На фиг. 5 изображено стробирование детектора во время срабатывания лазера согласно изобретению. Последовательность 44 срабатывания лазера изображена на фигуре. Для ясности здесь рассмотрен только один лазер (не показан), но стробирование детектора применяют к срабатыванию любого лазера или другого импульсного источника света. Сигнал 45 стробирования лазера также изображен на фигуре. Стробирование детектора (не показан) осуществляют во время срабатываний лазера так, что не происходит определения света лазера. Тем самым, детектор предназначен получать свет флуоресценции от реактивов реакции секвенирования (не показаны), которую запускают посредством начального попадания света лазера на образец. На фигуре изображены две задержки, как показано стрелками 46 и 47. Первая задержка 46 вызвана первым импульсом лазера (синхронизированным) и затем сигнал стробирования увеличивается непосредственно перед тем, как должно произойти следующее срабатывание лазера. Затем генерируют вторую задержку 47, чтобы поддержать функционирование сигнала стробирования до тех пор, пока не пройдет лазерный импульс. Это обозначает, что первый лазерный импульс не стробирован и любой определяемый сигнал можно игнорировать.

На фиг. 6 представлен массив 48 устройств согласно изобретению. Предусмотрено, что последовательность секвенируемых образцов или фрагментов ДНК можно поместить во множество областей вмещения согласно изобретению, причем каждая область вмещения образует пару с детекторами, аккумуляторами и т.п. (не показаны), как описано выше, чтобы обращение к основанию для каждого образца или фрагмента ДНК происходило внутри каждого пикселя 12 детектора. В одном устройстве 10 каждый импульсный источник света может предоставить свет для всех областей вмещения. Таким образом, области 11 вмещения, пиксели 12 детектора и выводы 22 можно предоставить во множестве, но предоставление во множестве также источников света 13 или 14 или средства 19 стробирования не является предпочтительным. Затем можно получить доступ к информации в виде результата, а не в виде вывода электронного детектора, который еще подлежит обработке. Это снижает нагрузку передачи информации и ускоряет процесс секвенирования. Дополнительно предусмотрено, что вывод из пикселей 12 детектора можно периодически собирать ряд за рядом, например, чтобы дополнительно ускорить обработку. Также предусмотрена одна или несколько таблиц соответствия, которые служат более чем одному или одному набору аккумуляторов. Таблицы соответствия можно удалить из пикселя детектора, чтобы расположить в другом месте в конструкции массива или за пределами массива. Направляя вывод нескольких пикселей детектора на одну или уменьшенное число таблиц соответствия, выигрывают в скорости обработки информации секвенирования. Например, к таблице соответствия, относящейся к определению основания A ДНК, может получить доступ один ряд пикселей детектора в массиве и так далее.

Массив устройств облегчает секвенирование, как описано выше. Однако поскольку лазеры и детекторы можно разделить некоторым расстоянием, синхронизация этих двух может быть затруднительной вследствие задержек электронных сигналов. Лазеры должны освещать более обширные области одновременно. Это можно дополнительно усовершенствовать. Поскольку лазерный импульс является субнаносекундным, временные задержки в детекторе становятся слишком большими, чтобы точно стробировать все пиксели. Таким образом, дополнительный вариант осуществления изобретения содержит эффект синхронизации, который определяет лазерный импульс в каждом пикселе 12 детектора или для малого числа пикселей детектора, определяемого в виде группы. Можно создавать локальный сигнал для стробирования определяющих флуоресценцию детекторов в зависимости от лазера. Локальный сигнал следует генерировать внутри устройств или рядом с ними с тем, чтобы сохранить задержки минимальными и относительно постоянными среди различных участков массива. Другими словами, в массиве 48 расстояние между определением лазера и определением флуоресценции следует стандартизировать, насколько это возможно.

На фиг. 7 дополнительно проиллюстрирована эта идея в отношении дополнительного варианта осуществления для массива устройств согласно изобретению, предпочтительный выбор представлен на фигуре. Определяющие лазер и флуоресценцию субпиксели определены в массиве 48, здесь термин субпиксель указывает на то, что каждая образующая пару область 11 вмещения и пиксель детектора 12 теперь образуют часть большей группы, детектор из каждой пары имеет точно определенную функцию в отношении лазерного света или света флуоресценции. На фиг. 7 центральный субпиксель 49 выполнен с возможностью определения лазерного светового импульса, тем самым, запуская генерацию генератора импульсов стробирования для близко расположенных пикселей 50 флуоресценции. Возможны другие формы и компоновки лазерного субпикселя и субпикселя флуоресценции, и больше или меньшей определяющих флуоресценцию субпикселей 50 можно соединить с определяющим лазер субпикселем 49.

Для облегчения этой компоновки секвенирующий массив должен совпадать с детектором. Для варианта осуществления, представленного на фиг. 7, это обозначает, что внутри каждого сайта секвенирования 3×3 или области 11 вмещения, центральный сайт или область 11 вмещения должны быть нефункциональными и предпочтительно рассеивающими. Предпочтение рассеивающему сайту обусловлено тем, чтобы лазерные фотоны направить строго в направлении детектора с тем, чтобы определяющий лазер субпиксель определял начало лазерного импульса как можно раньше, тем самым снижая вероятность того, что произойдет определение флуоресценции. Центральный сайт или область 11 вмещения предпочтительно должны быть нефункциональными, т.е. не способными к образованию флуоресценции. Стробирование субпикселей флуоресценции можно осуществлять, как описано выше, для одного устройства.

Изобретение описано выше в отношении одной эмиссии флуоресценции, которая берет начало в одном основании ДНК. Однако это не следует толковать в качестве ограничения, поскольку процесс секвенирования можно выполнить так, что эмиссия флуоресценции будет указывать на два или более соседних основания ДНК в последовательности. Например, флуоресцентную группу можно соединить с двумя связанными основаниями ДНК, расположенными на последовательности, а реакция секвенирования должна быть предназначена для одновременного определения присутствия двух связанных оснований ДНК. Примером является секвенирование посредством лигирования. Изобретение можно применять тем же образом, что и для отдельных оснований, в зависимости от того, как определяют и используют флуоресценцию.

СПИСОК НОМЕРОВ ПОЗИЦИЙ

10 Устройство

11 область вмещения

12 Пиксель детектора

13 Первый источник света

14 Второй источник света

15 Первый световой импульс

16 Второй световой импульс

17 Свет флуоресценции

18 Детектор

19 Средство стробирования

20 Первый аккумулятор

21 Второй аккумулятор

22 Вывод

23 детектор SPAD

24 Индикация сигнальной информации

25 Аккумулятор

26 Аккумулятор

27 Аккумулятор

28 Аккумулятор

29 Переключатель

30 Вариант осуществления изобретения, содержащий таблицы соответствия

31 Таблица соответствия

32 Таблица соответствия

33 Таблица соответствия

34 Таблица соответствия

35 Средство обработки

36 Стрелка, указывающая передачу информации от аккумулятора в таблицу соответствия

37 Стрелка, указывающая передачу информации из таблицы соответствия в средство обработки

38 Режим срабатывания лазера для основания A ДНК

39 Режим срабатывания лазера для основания C ДНК

40 Режим срабатывания лазера для основания G ДНК

41 Режим срабатывания лазера для основания T ДНК

42 Стрелка, которая обозначает период срабатывания для одного лазера

43 Стрелка, указывающая период срабатывания между последовательно срабатывающими лазерами

44 Последовательность срабатывания лазера

45 Сигнал стробирования лазера

46 Задержка 1

47 Задержка 2

48 Массив

49 Определяющий лазер субпиксель

50 Определяющий флуоресценцию субпиксель