способ прогнозирования наследственной предрасположенности к раку молочной железы

Формула изобретения

Способ прогнозирования наследственной предрасположенности к раку молочной железы, характеризующийся тем, что проводят амплификацию коротких фрагментов гена BLM протяженностью до 200 п.о., с последующим высокоразрешающим плавлением, включающим оптимизированный для гена BLM этап формирования гетеродуплексов: быстрый нагрев до 95°С и медленное снижение температуры до 50°С; выбирают один фрагмент с аберрантным профилем плавления для секвенирования, секвенируют выбранный фрагмент и при выявлении мутации гена BLM прогнозируют наследственную предрасположенность к раку молочной железы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности, к клинической онкологии, медицинской генетике, молекулярной диагностике и может быть использовано для прогнозирования наследственной предрасположенности к раку молочной железы (РМЖ).

Известные способы прогнозирования наследственной предрасположенности к РМЖ основаны на использовании молекулярно-генетических методик.

Известен способ прогнозирования наследственной предрасположенности к РМЖ путем выявления мутаций в гене BRCA1 [Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, Futreal PA, Harshman K, Tavtigian S, Liu Q, Cochran C, Bennett LM, Ding W, et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. Science. 1994 Oct 7;266(5182):66-71].

Известен способ прогнозирования наследственной предрасположенности к РМЖ путем выявления мутаций в гене BRCA2 [Wooster R, Bignell G, Lancaster J, Swift S, Seal S, Mangion J, Collins N, Gregory S, Gumbs C, Micklem G. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature. 1995 Dec 21-28;378(6559):789-92].

Известен способ прогнозирования наследственной предрасположенности к РМЖ путем выявления мутаций в гене СНЕК2.[Vahteristo P, Bartkova J, Eerola H, Syrjakoski К, Ojala S, Kilpivaara О, Tamminen A, Kononen J, Aittomaki K, Heikkila P, Holli K, Blomqvist C, Bartek J, Kallioniemi OP, Nevanlinna H. A CHEK2 genetic variant contributing to a substantial fraction of familial breast cancer. Am J Hum Genet. 2002 Aug; 71(2):432-8].

Известен способ прогнозирования наследственной предрасположенности к РМЖ путем выявления мутаций в гене PALB2[Rahman N, Seal S, Thompson D, Kelly P, Renwick A, Elliott A, Reid S, Spanova K, Barfoot R, Chagtai T, Jayatilake H, McGuffog L, Hanks S, Evans DG, Eccles D; Breast Cancer Susceptibility Collaboration (UK), Easton DF, MR. PALB2, which encodes a BRCA2- Stratton interacting protein, is a breast cancer susceptibility gene. Nat Genet. 2007 Feb; 39(2): 165-7].

Перечисленные способы выявляют причины не более 20% случаев семейной агрегации РМЖ. Причины формирования риска РМЖ в оставшихся родословных остаются неизвестными. Поиск новых генов, ассоциированных с РМЖ, представляется достаточно важной задачей. Во-первых, сведения о присутствии РМЖ-предрасполагающих мутаций у той или иной женщины позволяют сформировать индивидуальный комплекс медицинских мероприятий, направленных на профилактику и своевременную диагностику этого заболевания. Во-вторых, данные последних лет свидетельствуют о том, что наследственные раки нуждаются в особых, отличных от «спорадических» карцином, схемах лечебных воздействий.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств, направленных на прогнозирование наследственной предрасположенности к РМЖ, повышение точности и информативности в индивидуальном прогнозе, снижение материальных затрат.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования наследственной предрасположенности к раку молочной железы, согласно изобретению, проводят амплификацию коротких фрагментов гена BLM протяженностью до 200 п.о., с последующим высокоразрешающим плавлением, включающим оптимизированный для гена BLM этап формирования гетеродуплексов: быстрый нагрев до 95°С и медленное снижение температуры до 50°С; выбирают один фрагмент с аберрантным профилем плавления для секвенирования, секвенируют выбранный фрагмент и при выявлении мутации гена BLM прогнозируют наследственную предрасположенность к раку молочной железы.

В результате анализа наследственных мутаций в генах репарации ДНК у 95 пациенток, демонстрирующих характеристики наследственного рака молочной железы; в 2 случаях обнаружена мутация p.Q548X в гене BLM. Расширенное исследование позволило выявить наследуемые дефекты в гене BLM у 17/1,498 (1.1%) больных РМЖ по сравнению с 2/1,093 (0.2%) здоровыми женщинами (р=0.004). Встречаемость мутаций в гене BLM у больных с семейной историей РМЖ достигала 2.4% (6/251). Результаты проделанной работы позволяют заключить, что мутации гена BLM демонстрируют высокую встречаемость в популяции, а их выявление целесообразно для прогнозирования предрасположенности к раку молочной железы.

Разработанный способ прогнозирования наследственной предрасположенности к РМЖ включает два последовательных этапа: анализ всех возможных мутаций гена BLM (см. табл.) методом ПЦР с последующим высокоразрешающим плавлением, оптимизированным для гена BLM, и секвенирование только одного из аберрантных фрагментов. Подобный подход позволяет значительно удешевить и ускорить процедуру анализа.

Аберрантный характер кривой плавления устанавливается по отличию от кривых плавления контрольных образцов без мутации. Выбранный фрагмент подвергается секвенированию по стандартным протоколам. В случае если ни один из анализируемых фрагментов не отличается от контрольных образцов, дают заключение об отсутствии мутаций без дополнительного секвенирования.

Точность детекции мутаций была улучшена за счет выбора ампликонов около 200 п.о. и включения этапа формирования гетеродуплексов (быстрый нагрев амплификата до 95°С и медленное охлаждение до 50°С).

Таблица
Праймер	Последовательность 5 3	Длина ампликона
BLM-ex2-F	TGTGATTAATGCAAAGTACCTA	189
BLM-ex2-R	CTATGTGACAGCAAACCAGT
BLM-ex3_1-F	GATTCTTTGCTCAGTTGGGA	187
BLM-ex3_1-R	TGACACATTAGTTACAGATACA
BLM-ex3_2-F	TGTATCTGTAACTAATGTGTCA	200
BLM-ex3_2-R	GCAAGAAATCTGGCAATAATG
BLM-ex3_3-F	TCATTATTGCCAGATTTCTTGC	175
BLM-ex3_3-R	CAGAAGTATCAAAGTCATCCA
BLM-ex3_4-F	TGGATGACTTTGATACTTCTG	212
BLM-ex3_4-R	AGTCATCCTTCTGTTCCTCA
BLM-ex3_5-F	TGAGGAACAGAAGGATGACT	142
BLM-ex3_5-R	GTTACCTCTTTCATCTTCCAA
BLM-ex4-F	CTGTAGATAATAGCGAAAAGAA	173

BLM-ex4-R	AGTTTACCTAAGGCATTTTGAA
BLM-ex5-F	TGCAGTACGTTAAAGGACC	228
BLM-ex5-R	CATACAGCCACAGGTTCAA
BLM-ex6-F	TAGACAGATAAGTTTACAGCA	133
BLM-ex6-R	CCTTATGTTCCGCTGCTGA
BLM-ex7_1-F	ACGTTGTTCTCTTTTCTCTCT	223
BLM-ex7_1-R	GTGGTAGTCAGTAAACAGTC
BLM-ex7_2-F	GACTGTTTACTGACTACCAC	190
BLM-ex7_2-R	CAGCAGTGCTTGTGAGAACA
BLM-ex7_3-F	TGTTCTCACAAGCACTGCTG	222
BLM-ex7_3-R	GATACTGATTTAATTGGCCGA
BLM-ex7_4-F	TCGGCCAATTAAATCAGTATC	200
BLM-ex7_4-R	TGATGATTTGCTATGGTTTTTC
BLM-ex8-F	TCCTAGACAAGTCAGCACAA	229
BLM-ex8-R	TTCCTGCCAATTCACTTCTAA
BLM-ex9-F	AACTTTTACATTCATGCTCTG	186
BLM-ex9-R	TTACATCCAAGGAAGTCAGC
BLM-ex10-F	ATACTTAGATTCCAGCTACATA	125
BLM-ex10-R	AACCTTTTCTGGAGTGACATA
BLM-ex11-F	CCTAGATCTGTGCAAGTAAC
BLM-ex11-R	TAGTATGTATTTATCGGTATTTC
BLM-ex12-F	CTCCAAGTAGTCTGAAAAGCA
BLM-ex12-R	GTGACGTGCAACAACTTACA

BLM-ex13-F	GGACTTTTTTAGGTTTAGCAT
BLM-ex13-R	AGACAGCTAATCACATGGC
BLM-ex14-F	GTACTCTTGGTTTCTTGGCA
BLM-ex14-R	GTTACCTGACAGCCATCCT
BLM-ex15_1-F	GTCTGTGCCTTATGAATCTA
BLM-ex15_1-R	GCAGTGAGATATTTCCCCA
BLM-ex15_2-F	GCATCTCTCCCTAAATCTGT
BLM-ex15_2-R	CCACAATAGCAGGAGTAGA
BLM-ex16_1-F	GTCTTACTATAGTCTTCATCTCT
BLM-ex16_1-R	CACCAAAGTAGGCCAAAAGCT
BLM-ex16_2-F	GAATGCAGGAGAATACAGCTT
BLM-ex16_2-R	CGGAGACCACCTTTTGCAAT
BLM-ex17-F	GGGTTATGATGAATCTACTAT
BLM-ex17-R	ACCCAAGAAAATGTCGACCA
BLM-ex18_1-F	CTTCTATTTGAGGGTGATGAT
BLM-ex18_1-R	CATAAGCGATCGCCTGGTCA
BLM-ex18_2-F	GATTTTGGATGAAGACTTATATAT
BLM-ex18_2-R	CAGTATCTATAAGCTTGGACAA
BLM-ex19-F	CTCCTATGATTTGTTTCTCTCT
BLM-ex19-R	GTGCCACGTAACAAAGGATA
BLM-ex20-F	GTGGGTTTTCTATGGGTGAT
BLM-ex20-R	CATGGCTGTGTACTAACCT
BLM-ex21_1-F	CGTGGACCAGTGCGACAT

BLM-ex21_1-R	CTTTGGGAGGCTGGCATCT
BLM-ex21_2-F	GAAGAAGTGCCGCTGAGGA
BLM-ex21_2-R	CAGAGCTGTTGCACTTTTGT
BLM-ex22-F	GGGGGTCTGCCACATGTA
BLM-ex22-R	CTATGTACATTGAGATTCGGTT

Сущность изобретения иллюстрируется графическими изображениями на фиг.1, 2, где:

На фиг.1 представлена схема протокола № 1 для скрининга мутаций в гене BLM: Case - исследуемый образец, hd1 и hd2 - контрольные образцы без мутации, К- контроль ПЦР без матрицы.

На фиг.2 представлена схема протокола № 2 для скрининга мутаций в гене BLM: Case - исследуемый образец, hd1 и hd2 - контрольные образцы без мутации, К- контроль ПЦР без матрицы.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК лейкоцитов периферической крови, полученной от тестируемых лиц, выделяют стандартным соль-хлороформным методом. Праймеры для амплификации 32 фрагментов кодирующей последовательности гена и экзон-интронных границ, представлены в табл.При использовании 96-луночного формата для скрининга всей последовательности требуется 2 раунда ПЦР по 1,5 часа. В протокол реакции включают исследуемый образец, два контрольных образца без мутаций и один контроль реакционной смеси без матрицы. Схема протоколов представлена на фиг.1,2.

Реакционная смесь состоит из 1 мкл раствора ДНК (все образцы в реакции подводят к одной концентрации - 20 нг/мкл) и 9 мкл смеси для ПЦР. Смесь для ПЦР содержит 1-кратный ПЦР-буфер, 2.5 мМ MgCl₂, 200 мкМ дЦТФ, 200 мкМ дТТФ, 200 мкМ дГТФ, 200 мкМ дАТФ, 1 мкМ каждого праймера (конечная концентрация - 0,1 ОЕ/л) и 0,5 ед "hot-start" ДНК-полимеразы. Дополнительно в реакцию включают интеркалирующий краситель EvaGreen (Biotium, Hayward, CA) в концентрации, рекомендованной производителем. ПЦР-реакция начинается с 10-минутной активации ДНК-полимеразы при 95°С; для накопления ПЦР-продукта проводится 40 циклов амплификации (денатурация: 10 сек при 95°С; отжиг: 15 сек при 58°С; синтез: 20 сек при 72°С). После завершения ПЦР следует этап высокоразрешающего плавления ампликонов. Программа плавления заключается в увеличении температуры на 0,2°С в каждом цикле продолжительностью 10 с, температурный интервал плавления составлял от 75 до 92°. Точность детекции мутаций повышается за счет выбора ампликонов около 200 п.о. и включения этапа формирования гетеродуплексов (быстрый нагрев амплификата до 95°С и медленное охлаждение до 50°С).

Анализ профилей плавления производят с использованием соответствующего программного обеспечения, прилагаемого к используемому в лаборатории оборудованию.

При выявлении, по меньшей мере, одной мутации гена BLM прогнозируют наследственную предрасположенность к РМЖ.

Предлагаемый способ является простым в исполнении и высокоинформативным: позволяет выявлять до 100% мутаций в гене BLM. Популяционная частота носительства мутаций в данном гене составляет 0.2%. Наследственные дефекты гена BLM отвечают примерно за 1.1% общей заболеваемости РМЖ, причем этот показатель достигает 2.4% у больных с семейной формой РМЖ. Способ рекомендован пациенткам с BRCA-негативным, пациенткам с клиническими признаками наследственного РМЖ и, в случае обнаружения мутации, их здоровым родственницам.