новый способ количественного определения и охарактеризования микровезикул в жидкостях организма человека

Формула изобретения

1. Способ количественного и качественного определения экзосом в образцах, полученных из клеток человека, или в жидкости организма, причем указанный способ включает стадии:

a) улавливания экзосом из образца, полученного из клеток человека, или из жидкости организма первичным антителом к Rab 5b;

b) детекции связанных экзосом антителом для детекции, причем указанное антитело для детекции связывается либо с антигеном экзосомы, либо с антигеном, экспрессируемым клеточным источником экзосом;

c) обеспечения возможности реакции связанного с ферментом вторичного антитела с антителом для детекции;

d) добавления субстрата; и

e) детекции реакции путем иммунодетекции.

2. Способ по п.1, в котором антитело для детекции представляет собой антитело к CD63 или антитело к кавеолину-1.

3. Способ по п.1 или 2, где способ включает стадию очистки препарата экзосом из образца, полученного из клеток человека или жидкости организма, и стадию a) проводят на очищенных экзосомах.

4. Способ по п.1 или 2, где жидкость организма представляет собой образец плазмы, асцитической жидкости, жидкостей головного мозга, костного мозга, мочи, кала или бронхо-альвеолярного смыва человека.

5. Способ по п.4, где объем используемой жидкости организма составляет менее 2 мл.

6. Способ по п.1 или 2, где жидкость организма или клеточный образец получают от здорового индивида и от пациента, предположительно имеющего опухоль, и выявленное количество экзосом в образце пациента сравнивают с количеством экзосом в образце здорового индивида, и увеличение количества используют в качестве признака опухоли.

7. Неинвазивный способ мониторинга роста опухоли, причем указанный способ включает стадии:

a) периодического анализа образца жидкости организма пациента;

b) улавливания экзосом из образца, полученного из клеток человека или из жидкости организма, первичным антителом к Rab 5b;

c) детекции связанных экзосом антителом для детекции, причем указанное антитело для детекции представляет собой антитело к CD63 или антитело к кавеолину-1;

d) обеспечения возможности реакции связанного с ферментом антитела с антителом для детекции;

e) добавления субстрата;

f) детекции реакции путем иммунодетекции; и

g) установления корреляции между количеством выявленных экзосом и размером опухоли.

8. Способ по п.7, где способ включает очистку препарата экзосом из образца жидкости организма и стадию c) проводят на очищенном препарате экзосом.

9. Способ по п.7, где образец жидкости организма представляет собой образец плазмы.

10. Способ по п.7, где опухоль представляет собой меланомную опухоль.

11. Способ диагностики опухоли путем детекции содержащих кавеолин-1 экзосом с использованием способа по п.1, где антитело для детекции представляет собой антитело к кавеолину-1.

12. Способ по п.11, где опухоль представляет собой меланомную опухоль.

13. Тестовый набор для количественного и качественного определения экзосом в образцах, полученных из клеток человека, или в жидкости организма, причем указанный набор содержит:

a) препарат первичного антитела для улавливания экзосом из клеток человека, или из жидкости организма, причем указанное первичное антитело представляет собой антитело к Rab 5b;

b) препарат антитела для детекции связанных экзосом, причем указанное антитело для детекции представляет собой антитело к CD63 или антитело к кавеолину-1;

c) препарат связанного с ферментом вторичного антитела для реакции с антителом для детекции; и

d) субстрат для фермента.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится, главным образом, к области диагностики злокачественной опухоли. Более конкретно, изобретение относится к способу количественного и качественного определения экзосом в жидкостях организма человека.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Экзосомы представляют собой микровезикулы размером в диапазоне между 30-120 нм, активно секретируемые через каскад экзоцитоза, обычно используемый для разгрузки рецептора и внутриклеточных перекрестных сигналов. Экзосомы могут быть выявлены в супернатантах клеточных культур и в некоторых жидкостях организма с помощью многостадийного ультрацентрифугирования. В дополнение к белкам главного комплекса гистосовместимости (MHC I, MHC II) и белкам, вовлеченным в представление антигена, экзосомы могут содержать мембранные и цитозольные белки, вовлеченные во множество клеточных функций. Экзосомы секретируются в определенных физиологических условиях из различных типов клеток, таких как дендритные клетки (DC), лимфоциты, тучные клетки и эпителиальные клетки. Этот процесс приводит к образованию подобных контейнеру клеточных резервуаров, которые содержат эти образованные в результате множественного слияния микровезикулы, также называемые мультивезикулярными тельцами (MVB). Этот процесс был выявлен с помощью изучения ультраструктур, в частности, в нормальных клетках. Однако с помощью иммуноэлектронной микроскопии и вестерн-блот-анализа препаратов экзосом было показано, что эти микровезикулы коэкспрессируют маркеры различных внутриклеточных вакуолей, таких как ранние эндосомы (например Rab5), лизосомы (например CD63, CD81, LAMP-1) и поздние фагосомы (Rab7), а также некоторые другие более клеточно-специфичные белки (например антигены MHC класса III).

Высвобождение экзосом из опухолевых клеток значительно превышает высвобождение из нормальных клеток, и часто оно ассоциировано с иммуносупрессивными эффектами. Происходящие из опухоли экзосомы во многих аспектах сравнимы с экзосомами нормальных клеток, за исключением экспрессии некоторых маркеров опухоли, таких как CEA для карциномы толстого кишечника, MART-1 или gp-100 для меланомы. Более того, происхождение экзосом опухоли, по-видимому, отличается во многих аспектах от происхождения нормальных экзосом. Вероятно, это является следствием того, что злокачественные клетки имеют более динамичный транспорт везикул из цитоплазмы во внеклеточное пространство и наоборот.

Роль экзосом в прогрессировании злокачественной опухоли достигла области исследований. Исходные данные указывают на то, что эти органеллы действуют в качестве переносчиков антигенного материала опухоли для опосредуемой DC перекрестной стимуляции T-клеток. Такие результаты дают основу для клинических попыток использовать экзосомы опухоли в качестве вакцин против злокачественной опухоли. Накапливающиеся данные в отношении широкого набора супрессивных эффектов, оказываемых этими микровезикулами на различные компоненты иммунной системы, отчетливо подтверждают участие экзосом опухоли в прогрессирование заболевания. В частности, недавно было показано, что экзосомы, секретируемые опухолевыми клетками человека различного происхождения, способны индуцировать апоптоз в активированных T-клетках, через экспрессию лигандов смерти (например FasL, TRAIL), ингибировать функции NK и запускать образование супрессорных клеток миелоидного происхождения из нормальных моноцитов. Эти данные, вместе с воспроизводимыми данными о том, что экзосомы, вероятно, опухолевого происхождения могут быть в большом количестве обнаружены в плазме и неплазматических выпотах пациентов со злокачественной опухолью, подтверждают роль экзосом опухоли в формировании у хозяина микросреды, позволяющей рост и прогрессирование опухолевых клеток.

С учетом растущего понимания роли экзосом в прогрессировании злокачественной опухоли и того факта, что существует растущая необходимость в выявлении новых способов лечения, улучшения диагностики и контроля злокачественности и роста злокачественных опухолей, соответственно существует потребность в способах и средствах для детекции и количественного определения экзосом в жидкостях человека. Однако фактом является то, что способы, которые в настоящее время используют для детекции экзосом, либо не являются количественными (TEM), либо являются недостаточно количественными (WB). Хотя для количественного определения экзосом используют проточную цитометрию, этот способ не позволяет точно измерить то, что необходимо исследователям. Действительно, хотя FACS-анализ (клеточный сортер для активируемой флуоресценцией сортировки) является пригодным способом для количественного определения клеток даже малых размеров, он не является пригодным для количественного определения настолько малых везикул (т.е. 50-100 нм). Более того, приблизительное измерение общей средней флуоресценции не позволяет точное количественное определение того, сколько везикул присутствует в данном образце. Более того, FACS-анализ не позволяет одновременный анализ различных образцов. Таким образом, существует потребность в способе детекции и количественного определения экзосом из небольших количеств жидкостей организма. Более того, с учетом того факта, что ранняя диагностика злокачественной опухоли необходима для лечения заболевания, существует потребность в потенциальных опухолевых маркерах и прогностических факторах.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Центральной проблемой получения пригодных данных in vivo для экзосом является низкий уровень эффективности доступных в настоящее время способов получения экзосом для количественного определения и охарактеризовывания их из жидкостей организма человека, в частности, из плазмы. Жидкости организма могут представлять собой асцитическую жидкость, жидкости головного мозга, костный мозг, мочу, кал или бронхо-альвеолярные смывы. Для решения этих существующих в настоящее время проблем, в настоящем описании разработан простой и надежный способ детекции и количественного определения экзосом из жидкостей организма, особенно из плазмы человека. Согласно этому описанию тест на основе ELISA (называемый ExoTest) позволяет количественное определение и охарактеризовывание экзосом из плазмы человека как здоровых доноров, так пациентов с опухолью. С помощью этого теста возможна охарактеризовывание подобных экзосомам везикул из плазмы как мышей SCID, которым трансплантированы клетки меланомы или карциномы толстого кишечника человека, так и пациентов с опухолью. В этом описании показано, что уровни экзосом в плазме прямо связаны с размером опухоли, и кавеолин-1 выявляется исключительно в экзосомах, очищенных из плазмы пациентов с опухолью. Согласно этому описанию, детекция экзосом опухоли в плазме пациентов-людей пригодна для диагностики и контроля злокачественных опухолей человека.

Технология, описанная в настоящем описании, позволяет неинвазивный тест, пригодный в клинической практике для диагностики, контроля и скрининга опухолей. Технологию по этому изобретению также можно использовать в клиническом исследовании опухолей. Более того, поскольку известно, что некоторые вирусы (например, HIV и HCV), а также прионы, могут быть выявлены в экзосомах, высвобожденных клетками, или в плазме, технологию по этому изобретению также можно использовать для охарактеризовывания и исследования других заболеваний, таких как вирусные, трансмиссивные и аутоиммунные заболевания. Более того, это изобретение относится к средствам для улучшения существующих клинических тестов на основе белков, которые экспрессируются на экзосомах (например, маркеров опухоли, вирусных белков, прионных белков).

Принцип этого изобретения основан на двух ключевых моментах:

1. Не существует в уровне техники способа, который позволял бы количественное определение и охарактеризовывание экзосом, в частности, в малых объемах, часто доступных в образцах плазмы человека.

2. Существует неудовлетворенная потребность в неинвазивном диагностическом и/или прогностическом тесте при многих болезненных состояниях человека, в частности, при злокачественных опухолях.

Таким образом, задачей этого изобретения является разработка способа количественного определения и охарактеризовывания экзосом, в частности, в малых объемах.

Другой задачей этого изобретения является разработка способа для количественного определения и охарактеризовывания экзосом в образцах плазмы.

Другой задачей этого изобретения является разработка способа количественного определения уровня экзосом в менее чем 2 мл жидкостей организма, вместе с преимущественно полной охарактеризацией белкового состава экзосом.

Более того, задачей этого изобретения является разработка способа для одновременного количественного определения экзосом в нескольких образцах.

Более того, тест по изобретению показывает, что количественное определение экзосом в плазме связано с размером опухоли. Таким образом, другой задачей изобретения является обеспечение способа контроля и предоставления прогноза пациентам со злокачественной опухолью.

Более того, задачей изобретения является разработка теста для установления клеточного источника экзосом плазмы и для оценки наличия в них какого-либо инфекционного (HIV, HCV) и/или трансмиссивного агента (например, прионных белков).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг.1 - детекция экзосом, очищенных из супернатантов клеточных культур меланомы человека.

A. Схематичное представление организации ExoTest (ELISA) для детекции и количественного определения экзосом.

B. Анализ с повышением доз очищенных CD63+-экзосом с помощью ExoTest. Исходная концентрация соответствовала 50 мкг экзосом, и экзосомы добавляли в двухкратных разведениях.

C. Вестерн-блот анализ экспрессии CD63, Rab5b и Lamp-1 в различных количествах экзосом, очищенных из культуральных супернатантов клеток меланомы человека (Me501).

D. FACS-анализ экспрессии Rab5b и CD63 на происходящих из меланомы экзосомах, очищенных из супернатанта клеток Me501 и нанесенных на латексные гранулы.

Фиг.2 - детекция экзосом плазмы у мышей SCID, которым трансплантировали меланому человека.

A. Анализ с повышением дозы экзосом опухоли, очищенных из плазмы мышей SCID, которым трансплантировали клетки меланомы человека, с помощью ExoTest.

B. FACS-анализ экспрессии Rab-5b и CD63 в экзосомах, очищенных из плазмы мышей SCID, которым трансплантировали клетки меланомы человека (Me501).

C. Корреляция размера опухоли и уровней экзосом в плазме у мышей SCID, которым трансплантировали Me501, анализированных в различные моменты времени в процессе роста опухоли. Группы мышей состояли из 5 животных для каждого момента времени. Уровни экзосом выражены как OD450×1000.

Фиг.3 - охарактеризовывание экспрессии кавеолина-1 (Cav-1) на экзосомах.

A. Вестерн-блот-анализ Cav-1 в экстрактах клеток и экзосомах из клеток меланомы человека и макрофагов.

B. Вестерн-блот-анализ CD64, Rab-5b и Cav-1 в очищенных экзосомах из клеток Me501, в плазме мышей SCID, которым трансплантировали Me501, и мышей SCID, не имеющих опухоли.

C. FACS-анализ экспрессии Cav-1 на экзосомах, очищенных из плазмы мышей SCID, которым трансплантировали Me501.

D. Уровни CD63+ и Cav1+ экзосом в плазме мышей SCID, имеющих меланому, умерщвленных через 5 недель после трансплантации.

Фиг.4 - количественное определение экзосом в плазме пациентов с меланомой.

Экзосомы, очищенные из плазмы здоровых доноров и пациентов с меланомой, количественно определяли с помощью ExoTest с использованием CD63 (A) или кавеолина-1 (B) в качестве антигенов для детекции. Данные выражены в виде коробчатой диаграммы: горизонтальные и вертикальные линии в каждой коробке соответствуют среднему значению и 25-75 процентилям, соответственно. Черные точки соответствуют отклоняющимся значениям. Уровни экзосом выражены в качестве OD450×10000. Различия между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни.

Фиг.5 - ExoTest (Elisa) на нефракционированных образцах.

A. Количество поддающихся детекции экзосом измеряли в очищенных экзосомах (50 мкг белков) по сравнению с нефракционированными культуральными супернатантами (50 мл) из макрофагов человека, клеток меланомы и плазмы пациентов с меланомой. Данные выражены в качестве средних значений +/-SD.

B. Регрессионный анализ уровней в плазме CD63+ экзосом измеряли в очищенных или нефракционированных образцах плазмы как от пациентов (n=9, черные ромбы), так и от здоровых доноров (n=4, белые ромбы). Уровни экзосом выражены в качестве OD450×1000.

Фиг.6 - количественное определение экзосом в плазме пациентов с меланомой.

Экзосомы, очищенные из плазмы пациентов с меланомой (MEL) и здоровых доноров (HD), количественно определяли с помощью Exotest с использованием в качестве антигена для детекции CD63 или типичных белков меланомы, таких как gp100 и MART-1. Данные выражены в качестве средних значений ±SD. Уровни экзосом выражены в качестве OD450×1000.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Экзосомы представляют собой микровезикулы с размером в диапазоне 30-120 нм, активно секретируемые во внеклеточную среду нормальными, а также опухолевыми клетками. С учетом растущего понимания роли экзосом в прогрессировании злокачественной опухоли и того факта, что существует растущая необходимость в выявлении новых способов лечения, улучшения диагностики и контроля злокачественности и роста опухолей, соответственно существует необходимость в способах и средствах для детекции и количественного определения экзосом в жидкостях человека. Вследствие потенциального вовлечения экзосом в обеспечение прогрессирования заболевания с помощью серии эффектов разрушения на микроокружение опухоли, возможность количественного определения экзосом в плазме или сыворотке человека, с помощью чувствительного, специфичного и выполнимого анализа становится важной проблемой. Если такой анализ был бы доступен, он мог бы стать фундаментальным средством для оценки потенциальной роли этих микровезикул в прогнозе злокачественной опухоли и в качестве нового прогностического фактора или маркера для детекции или мониторинга неопластического заболевания. Однако используемые в настоящее время способы, например TEM и WB, не являются количественными или являются недостаточно количественными, таким образом, существует очевидная потребность в способе детекции и количественного определения экзосом в жидкостях организма. Таким образом, целью этого описания является разработка нового средства для клинических онкологов для диагностики и дальнейшего исследования пациентов со злокачественной опухолью. Более того, целью этого изобретения является разработка нового способа для применения в целях диагностики других заболеваний человека, таких как вирусные или прионные заболевания, где частицы передаются в микровезикулах.

Новый количественный тест, описанный в настоящем документе, основан на опосредуемой ELISA детекции экзосом и он является первым простым, чувствительным и надежным тестом для количественного определения экзосом. Белки, выявляемые этим способом, не являются специфическими для экзосом, однако они являются общими исключительно для таких цитоплазматических органелл, как эндосомы и лизосомы, мембраны которых не используются повторно, как структуры плазматической мембраны. Этот признак исключает возможность детекции этих белков на дебрисе, происходящем из некротических опухолевых клеток или их растворимой формы.

Анализ по этому изобретению предпочтительно включает универсальный опухолевый маркер (кавеолин-1), который позволяет преимущественную детекцию секретируемых опухолью экзосом. В серии всесторонних исследований, проведенных с помощью различных сравнительных способов (вестерн-блоттинг и проточная цитометрия) и различных экспериментальных условий, описанных ниже в примерах, доказана надежность нового теста по этому изобретению.

Новый способ по этому изобретению основан на тесте сэндвич-ELISA, который авторы настоящего изобретения называют ExoTest, для улавливания и количественного определения экзосом плазмы на основе экспрессии белков домашнего хозяйства (CD63 и Rab-5) и ассоциированного с опухолью маркера кавеолина-1. В ExoTest используется антитело против Rab5 для улавливания экзосом, присутствующих в очищенных препаратах экзосом. В качестве антитела для детекции, в ExoTest используется антитело, распознающее либо антиген экзосом (CD63), либо другие антигены, экспрессируемые клеточным источником экзосом, такие как кавеолин-1 - белок, ассоциированный с метастазирующим поведением опухолей. В первой группе экспериментов, авторы настоящего изобретения использовали препарат экзосом из культуральных сред опухолевых клеточных линий человека, сравнивая результаты ExoTest с результатами, полученными вестерн-блоттингом и FACS. Результаты показали, что типичные антигены экзосом выявлялись в препаратах экзосом с использованием всех трех способов. Однако ExoTest позволял количественный анализ экзосом и более широкой панели белков в том же препарате с меньшими количествами исходного материала по сравнению с FACS- или WB-анализами. Этот технический признак имеет огромное значение, когда анализ проводят на образцах плазмы. Действительно, анализ пулов плазмы мышей SCID, которым трансплантировали клетки меланомы или карциномы толстого кишечника человека, часто не был воспроизводимым или был по крайней мере очень трудным, когда использовали WB, в то время как ExoTest показал количественный анализ уровней экзосом в плазме мышей SCID с опухолью человека. Новое и важное открытие состоит в том, что на основе результатов ExoTest, уровни экзосом в плазме в значительной степени коррелировали с размером опухоли и возрастали с течением времени после трансплантации. Более того, циркулирующие экзосомы, вместе с типичными белками, представляли собой маркеры опухоли, экспрессируемые опухолями человека, растущими у мышей (не показано). Таким образом, ExoTest с использованием CD63 в качестве антигена для детекции был способен количественно определить экзосомы в плазме пациентов с меланомой и здоровых субъектов. Поскольку клетки опухоли секретируют большое количество экзосом, авторы были по-настоящему удивлены, не найдя отличий между уровнями CD63-положительных экзосом в плазме пациентов с меланомой и здоровых контрольных индивидов. Для идентификации возможных опухолеспецифических экзосом, авторы настоящего изобретения провели ExoTest с использованием кавеолина-1 в качестве антигена для детекции. В недавних публикациях описано, что уровни циркулирующего кавеолина-1 в плазме в значительной степени коррелируют с метастазирующей аденокарциномой предстательной железы. Интересно, что кавеолин-1 вовлечен в патогенез трансформации онкогенных клеток, образование опухоли и метастазирование. Сначала авторы настоящего изобретения продемонстрировали с помощью FACS и WB, что кавеолин-1 присутствует на происходящих из опухоли экзосомах человека, очищенных из плазмы мышей SCID, которым пересадили опухоль, и пациентов с опухолью. Затем, с использованием ExoTest авторы смогли выявить значительное повышение уровней положительных по кавеолину-1 экзосом в плазме пациентов с опухолью по сравнению с плазмой здоровых индивидов, подтверждая, что кавеолин-1 может представлять собой специфический маркер опухоли, и что ExoTest является удачным тестом для количественного определения такого повышения.

Взятые вместе, результаты показывают, что ExoTest для детекции экзосом является действующим и пригодным для детекции и количественного определения циркулирующих экзосом у человека. Более того, тест обеспечивает возможность детекции различных белков в препаратах экзосом плазмы, с потенциальным применением у определенного типа пациентов с опухолью. Также в этом описании предоставлено новое прогностическое/диагностическое средство для пациентов с опухолью, основанное на количественном определении и охарактеризовывании экзосом плазмы. Это имеет особое значение для пациентов с меланомой, поскольку чувствительные и надежные сывороточные маркеры все еще ограничены и уровни LDH (лактатдегидрогеназы) остаются единственным прогностическим сывороточным фактором для оценки течения и прогноза заболевания.

Изобретение подробно описано ниже. Примеры и экспериментальные детали описаны для обеспечения лучшего понимания и руководства для специалистов в данной области. Объем изобретения определен прилагаемой формулой изобретения.

ПРИМЕР 1

1. Источники экзосом

A. Супернатанты клеточных культур

Авторы настоящего изобретения использовали два типа опухолевых клеточных линий человека, т.е. меланому и карциному толстого кишечника. Mel 501 и Mel BS представляют собой две клеточных линии метастазирующей меланомы, полученные из меланомных очагов повреждения пациентов, подвергнутых хирургической резекции (Istituto Nazionale dei Tumori, Milan, Italy). Также авторы настоящего изобретения использовали две клеточные линии карциномы ободочной и прямой кишки Colo206 (полученные из метастазов в печени рака ободочной и прямой кишки пациента) и 1869 col (предоставленные Dr. Maccalli, Istituto Superiore di Sanita ). Все клеточные линии культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco), 2 мМ глутамином I(Gibco) и 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FCS) (Invitrogen, Milan, Italy). Происходящие из моноцитов человека макрофаги (MDM) получали из лейкоцитарных пленок здоровых доноров крови с использованием магнитных гранул с CD14 (Milteny Biotec, Germany) и GM-CSF (500 Е/мл) в течение 5 суток в культуре.

B. Плазма мышей SCID с опухолью человека

Самок мышей CB.17 SCID/SCID (Harlan, S. Pietro al Natisone, Italy) использовали в возрасте 4-5 недель и держали в определенных не содержащих патогена условиях. Все процедуры на животных проводили согласно руководствам UKCCR. Мышей SCID содержали в микроизолирующих клетках и все питание, воду и подстилку перед применением автоклавировали. Мышам инъецировали подкожно в правый бок 2,5×10⁶ клеток/мышь клеток меланомы или карциномы толстого кишечника человека. Рост опухоли измеряли с помощью штангенциркуля и массу опухоли оценивали по формуле: Масса опухоли (мг) = длина (мм) × ширина² (мм)/2, как описано ранее (Luciani L et al., J. Natl. Cancer Inst., 2004). Трансплантированным опухолям позволяли вырастать до массы 500 мг, и 500 мкл плазмы мышей, которым трансплантировали опухоль, получали от разных животных, умерщвленных в различные моменты времени в процессе роста опухоли.

C. Плазма доноров-людей и пациентов с опухолью

Образцы плазмы человека получали из обработанной ЭДТА цельной крови от пациентов с первичной или метастазирующей меланомой и от совпадающих по возрасту и полу здоровых доноров. Образцы хранили при -70°C до анализа.

2. Препараты экзосом in vitro и in vivo

Супернатанты клеточных линий меланомы и карциномы толстого кишечника человека собирали из сплошных клеточных культур, культивированных в течение 72 ч, во флаконы T-175, и выделяли микровезикулы, как описано ранее (Andreola et al., J. Exp. Med. 2002) с небольшими модификациями. В кратком изложении, после центрифугирования при 300×g в течение 10 минут для осаждения клеток, супернатант центрифугировали при 1200×g в течение 20 минут, а затем при 10000×g в течение 30 минут. Супернатант фильтровали с использованием 0,22-мкм фильтра (Stericup , Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA), а затем центрифугировали при 100000 g в течение 1 ч в ультрацентрифуге Beckman (Beckman Coulter) для осаждения экзосом. После однократного промывания в большом объеме фосфатно-солевого буфера (PBS), экзосомы суспендировали в небольшом объеме PBS или в пригодном лизирующем буфере, и хранили при -80°C для последующего экспериментального анализа.

Для получения экзосом из образцов плазмы, гепаринизированную кровь от мышей SCID, которым трансплантировали опухоли человека, или от пациентов со злокачественной опухолью и здоровых контролей, центрифугировали при 400×g в течение 20 минут. Затем плазму собирали, разделяли на аликвоты и хранили при -70°C до анализа. Образцы плазмы подвергали процедуре центрифугирования, описанной выше для выделения экзосом, с использованием Beckman TL100 для ультрацентрифугирования малых объемов.

3. Анализ экзосом с помощью проточной цитометрии

Определение экспрессии антигена на экзосомах проводили анализом проточной цитометрии на очищенных экзосомах, связанных с латексными гранулами. Препараты экзосом (5-10 мкг) инкубировали с 5 мкл латексных альдегид/сульфатных гранул диаметром 4 мкм (Interfacial Dynamics, Portland, OR) и ресуспендировали в 400 мкл PBS, содержащего 2% FCS. Покрытые экзосомами гранулы (20 мкл) инкубировали со следующими антителами: антитело против Rab5 (Santa Cruz), антитело против CD63-FITC (Pharmigen), антитело против CD81-PE (Pharmingen), антитело против кавелолина-1 (клон N-20, Santa Cruz) в течение 30 минут при 4°C, с последующей, при необходимости, инкубацией с конъюгированным с PE или FITC вторичным антителом и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences).

4. Вестерн-блот-анализ экзосом

Очищенные экзосомы лизировали в лизирующем буфере, содержащем 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl (pH 7) и ингибиторы протеаз (10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл леупептина и 2 мМ фенилметилсульфонилфторид) (Sigma). Концентрацию белка в экзосомах определяли способом микроанализа Брэдфорд (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Всего 50 мкг белков ресуспендировали в буфере для образца с SDS, кипятили в течение 5 мин, разделяли на 10% SDS-PAGE-геле и подвергали электроблоттингу на нитроцеллюлозу (Protran BA85, Schleicher and Schuell). Проводили блоттинг мембран с помощью антител к CD63 (разведенных 1:50) и Rab-5b (разведенных 1:50), инкубацию с соответствующими конъюгированными с HRP вторичными антителами (Amersham Pharmacia) и визуализацию с помощью усиленной хемилюминесцеции (ECL, Pierce).

5. Разработка теста ELISA для экзосом (ExoTest)

Новый тест ELISA (ExoTest) по этому изобретению основан на наличии в экзосомах определенных белков. Эти белки являются общими для таких цитоплазматических органелл, как эндосомы и лизосомы (Rab-5 и CD63, соответственно), мембраны которых не утрачиваются или не используются повторно, как в случае структур плазматической мембраны, таким образом, исключая возможное присутствие структур, образованных при разрушении мембраны.

Девяносто-шести-луночные планшеты (Nunc, Milan, Italy) покрывали поликлональным антителом против Rab-5b (клон A-20 Santa Cruz) в объеме 100 мкл/лунка карбонатного буфера pH 9,6 в конечной концентрации 4 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при 4°C. После 3 промываний посредством PBS добавляли 100 мкл/лунка блокирующего раствора (PBS, содержащий 0,5% BSA) и оставляли при комнатной температуре на 1 час. После трех промываний в PBS добавляли 50 мкг очищенных экзосом (в конечном объеме 100 мкл/лунка) и инкубировали в течение ночи при 37°C. После трех промываний в PBS соответствующее антитело для детекции (Mab против CD63 (клон H5C6 Pharmingen) или Mab против кавеолина-1 (клон 2297, Pharmingen)) разбавляли до концентрации 4 мкг/мл в блокирующем растворе, и 100 мкл/лунка инкубировали в течение 1 часа при 37°C. После трех промываний с PBS, планшет инкубировали с 100 мкл конъюгированного с HRP вторичного антитела против пероксидазы мыши (Pierce, Milan, Italy), разбавленного 1:50000 в блокирующем растворе, в течение 1 часа при комнатной температуре. После конечных трех промываний в PBS, реакцию проявляли с помощью POD (Roche Applied Science, Milan, Italy), блокировали 1 H H₂ SO₄ и регистрировали оптическую плотность с помощью устройства для считывания данных ELISA с использованием 450-нм фильтра (Biorad).

ПРИМЕР 2

ExoTest обеспечивает количественное определение экзосом, присутствующих в препаратах клеточных культур и имеет более высокую чувствительность в отношении детекции белков экзосом, чем вестерн-блот-анализ.

Культуральные супернатанты клеточных линий меланомы и карциномы толстого кишечника обрабатывали согласно стандартной процедуре для получения очищенных экзосом, как описано выше. На препаратах экзосом, полученных из супернатантов клеточных культур дифференциальным центрифугированием, проводили сэндвич-ELISA, разработанный для детекции экзосом (ExoTest, см. фиг.1A). ExoTest был способен обеспечить количественное определение экзосом, присутствующих в супернатантах клеточных культур, представляющих собой CD63+ экзосомы, поддающиеся детекции дозозависимым образом (фиг.1B). Отрицательные контроли, представляющие собой фракции, образованные осадком, полученным после центрифугирования при 10000 g, экзосомы, очищенные из клеточной культуральной среды отдельно и с помощью только вторичного антитела дали плохо поддающуюся измерению оптическую плотность (OD=0,07+/-0,01). Вариабельность между тестами и внутри тестов вычисляли для шести повторений анализа одного и того же препарата на трех различных планшетах, и она составила 30% и 35%, соответственно.

Вестерн-блот-анализ и FACS-анализ тех же очищенных препаратов экзосом подтвердили качественные данные, полученные с помощью ExoTest. Действительно, белки Rab-5b, Lamp-1 и в меньшей степени CD63 выявлялись в различных препаратах экзосом при WB в лизатах экзосом (фиг.1C) и оба из Rab-5b и CD63 выявлялись FACS на экзосомах, связанных с латексными гранулами (фиг.1D). Однако детекция и количественное определение экзосом с помощью ExoTest показали большую чувствительность в отношении детекции белка CD63 относительно WB-анализа (фиг.1C). Действительно, в то время как для надлежащей детекции либо CD63, либо Rab-5b с помощью WB было необходимо по меньшей мере 12,5 мкг экзосомельных белков, ExoTest был способен отчетливо выявлять экзосомы, начиная с минимального количества, составляющего 3 мкг очищенных препаратов экзосом.

ПРИМЕР 3

Сравнение результатов количественного и качественного определения препарата экзосом in vivo у мышей SCID, которым трансплантировали опухоли человека, с помощью FACS, WB и ExoTest

Для проверки возможности детекции происходящих из опухоли человека экзосом in vivo с использованием ExoTest, авторы настоящего изобретения сначала провели эксперименты, в которых мышам SCID подкожно инъецировали клеточные линии меланомы (Me501) и карциномы толстого кишечника человека. В первых экспериментах, образцы плазмы, полученные при умерщвлении мышей SCID, имеющих трансплантированные опухоли (100-500 мг), подвергали процедуре очистке экзосом. Как и в случае экзосом, очищенных из супернатантов клеточных культур, экзосомы, очищенные из плазмы мышей, также отчетливо и специфично выявлялись с помощью ExoTest (фиг.2A) и FACS (фиг.2B). Препараты экзосом, полученные из плазмы контрольных мышей SCID (которым не трансплантировали опухоли человека) привели к фоновой оптической плотности, сравнимой с пустыми образцами (OD=0,08±0,03), таким образом, подтверждая отсутствие экзосом у животных с иммунодефицитом или отсутствие перекрестной реакции экзосом мыши с CD63 и Rab-5b человека. Снова, ExoTest потребовал значительно меньшее количество препаратов экзосом для получения результатов, сравнимых с результатов, полученными с использованием WB-анализа.

После демонстрации того, что экзосомы человека можно выделять и выявлять с помощью ExoTest, авторы настоящего изобретения провели эксперименты с различными периодами времени с целью оценки того, коррелирует ли количество экзосом в плазме у мышей SCID с опухолью человека с массой опухоли. В этих экспериментах, меланомным опухолям позволяли расти вплоть до пяти недель после ранней трансплантации, и из плазмы отдельных животных очищали и количественно определяли экзосомы, начиная на 14 сутки после трансплантации, в течение последующих трех недель. Результаты показали, что количество экзосом человека, выявленных с помощью ExoTest, возрастало с течением времени, параллельно увеличению размера опухоли (фиг.2C); указывая на то, что количественное определение экзосом в плазме представляет собой пригодный способ для мониторинга роста опухолей. Сходные результаты были получены для клеток MeBS (не представлено).

ПРИМЕР 4

Экзосомы опухоли экспрессируют кавеолин-1

Поскольку известно, что экзосомы представляют собой важный и специфичный путь внутриклеточного обмена информацией, авторы настоящего изобретения предположили, что происходящие из опухоли экзосомы могут отличаться от циркулирующих экзосом в нормальных физиологических условиях. Недавно было описано, что простасомы (мембранные везикулы, секретируемые клетками рака предстательной железы), выделенные из клеточной линии карциномы предстательной железы PC-3, содержат белок кавеолин-1, основной компонент кавеол. Также известно, что сывороточные уровни кавеолина-1 повышены у пациентов с раком предстательной железы по сравнению со здоровыми субъектами (Tahir, 2003 #21). Однако на известном уровне технике отсутствуют предположения об ассоциации этого белка с мембранными везикулами в крови. Таким образом, авторы настоящего изобретения оценили присутствие кавеолина-1 на экзосомах, полученных из плазмы мышей SCID, которым трансплантировали меланомные опухоли. Как видно из результатов на фиг.3A, Cav1 высоко экспрессируется на экзосомах, секретируемых клетками меланомы человека in vitro, и не выявляется как в клеточных экстрактах, так и в экзосомах из нормальных клеток человека, например, таких как первичные происходящие из моноцитов макрофаги (MDM). Эти результаты указывают на то, что Ca1, секретируемый в погруженной в экзосому форме, может быть специфичным признаком клеток меланомы, таким образом, являясь потенциальным маркером для анализа происходящих из опухоли экзосом ex-vivo. Таким образом, авторы настоящего изобретения исследовали присутствие Cav1 на экзосомах, полученных из плазмы мышей SCID, которым трансплантировали меланомные опухоли. Cav1 выявлялся в препаратах экзосом, полученных из плазмы мышей SCID, которым трансплантировали меланомные опухоли, с помощью вестерн-блоттинга (фиг.3B), проточной цитометрии (фиг.3C) и ExoTest (фиг.3D), в то время как Cav1 не выявлялся в происходящих из плазмы экзосомах контрольных животных (фиг.3B, 3D). В соответствии с результатами от пациентов с меланомой и карциномой толстого и прямого кишечника (CRC), для детекции с помощью ExoTest высвобождения in vivo экзосом опухоли у мышей SCID, имеющих опухоль, можно использовать другие маркеры опухоли, такие как MelanA/Mart-1 для меланомы и CEA для CRC, с результатами, сопоставимыми с результатами, полученными для Cav1. Однако поскольку меланома может экспрессировать гетерогенный MelanA/MART-1 или его низкое количество, особенно на уровне метастазов, и CEA присутствует в сыворотке пациентов с CRC, главным образом, в растворимой форме, Cav1 является более надежным и воспроизводимым маркером опухоли. Таким образом, ExoTest далее разрабатывали, включая в него специфические антитела против Cav1.

ПРИМЕР 5

Количественное определение препарата экзосом in vivo в плазме пациентов с опухолью с помощью ExoTest: количество экзосом в плазме в качестве инструмента для прогноза

Данные, полученные в модели на мышах SCID с опухолью человека, побудили авторов настоящего изобретения к исследованию того, позволяет ли ExoTest детекцию и охарактеризовывание экзосом, очищенных также из плазмы человека. Если количественное определение было бы возможным, авторы настоящего изобретения поставили бы цель проверить, могут ли пациенты с опухолью иметь циркулирующие экзосомы в плазме, которые отличаются количественно и/или качественно от экзосом, присутствующих в плазме здоровых доноров. Экзосомы очищали из плазмы пациентов со злокачественной опухолью (n=62) и здоровых контролей (n=37), а затем подвергали ExoTest и вестерн-блот-анализу в отношении присутствия Rab5 и CD63. Количественное определение экзосом на основе экспрессии CD63 и Cav1 с помощью ExoTest представлено в таблице 1.

Таблица 1 Уровни экзосом и LDH в плазме в исследуемой популяции. CD63+ и Cav1+ exo представляют собой уровни экзосом в плазме, выраженные в качестве OD450 × 1000. Величины LDH в плазме выражены в качестве МЕ/л. Данные представлены в качестве средних значений (95% C.I.)
	CD63+	Cav1+exo	LDH
Пациенты с меланомой	478 (390-566)	524 (458-590)	438 (321-555)
Здоровые доноры	236 (188-285)	213 (180-246)	360 (240-480)

ExoTest позволял детекцию белков экзосом в очищенных из плазмы экзосомах от пациентов с меланомой и здоровых доноров (фиг.4A), причем уровни экзосом в плазме пациентов с меланомой вплоть до 4 раз превышали уровни у здоровых доноров (p<0,001). Для определения чувствительности и специфичности ExoTest, исходя из детекции двух белковых маркеров экзосом, авторы настоящего изобретения вычислили пределы (среднее значение +/- 2SD в образцах здоровых доноров) для экзосом плазмы, экспрессирующих как CD63, так и Cav1, который составил 526 и 411 (OD450×1000), соответственно. Детекция с помощью ExoTest CD63+ экзосом показала низкую чувствительность (36%) и хорошую специфичность (97,3%), а ExoTest для Cav1+ экзосом имел более высокую чувствительность (62%) и сходную специфичность (97,3%). В соответствии с этим наблюдением, уровни в Cav1+ экзосом в плазме значительно превышали уровни CD63+ экзосом у пациентов с меланомой (P=0,04). Эти результаты указывают на то, что:

i) циркулирующий Cav1 может быть ассоциирован с экзосомами у пациентов с меланомой, и ii) количественное определение экзосом, имеющих Cal, можно считать пригодным маркером опухоли.

Кроме того, авторы настоящего изобретения выявили, что LDH в плазме не коррелировала ни с CD63+, ни с Cav1+ экзосомами в плазме, в то время как значительная корреляция была выявлена между CD63+ и Cal+ экзосомами плазмы (коэффициент Спирмана 0,25, P=0,04) (фиг.4C). Более того, ExoTest выявил наличие опухолевых антигенов, таких как MART-1 или CEA, в плазме пациентов с карциномой или меланомой (фиг.6).

Большинство пациентов, включенных в анализ (57/62) страдали развернутым заболеванием (стадия III-IV). На всех стадиях заболевания с помощью ExoTest было выявлено широкое распределение уровней экзосом в плазме, что указывает на то, что вариабельность в количестве экзосом, присутствующих в периферическом кровотоке различных пациентов, может отражать различные уровни агрессивности опухоли и, таким образом, может стать новым независимым прогностическим фактором для меланомы. Другие прогностические факторы, представленные American Joint Committee on Cancer (AJCC), включая толщину и изъязвление первичной меланомы, количество метастатических лимфатических узлов, и область и число отдаленных метастазов, также могут коррелировать с содержанием экзосом в сыворотке, на что указывают результаты этого описания.

ПРИМЕР 6

Для количественного определения экзосом можно использовать цельную плазму

Потенциальное применение ExoTest для клинических целей побудило авторов настоящего изобретения проверить, можно ли использовать ExoTest для детекции экзосом в нефракционированных биологических жидкостях, что может позволить простой и воспроизводимый анализ, избегая стадий ультрацентрифугирования. Таким образом, авторы настоящего изобретения сравнили детекцию и количественное определение CD63+ экзосом из нефракционированных образцов (супернатанты клеточных культур макрофагов и клеток меланомы, и плазма человека) и экзосом, очищенных из тех же образцов. Для повышения чувствительности теста, для этих специальных экспериментов конъюгированное с HRP Mab инкубировали в течение 30 минут вместо 15 минут. Как представлено на фиг.5A, наличие экзосом с помощью ExoTest выявлялось из нефракционированных культуральных супернатантов макрофагов и клеток меланомы и плазмы девяти пациентов с меланомой. Кроме того, авторы настоящего изобретения провели тот же анализ плазмы от 4 здоровых доноров, и регрессионный анализ общего количества проанализированных образцов (9 пациентов + 4 здоровых донора) показал значительную корреляцию между количественными определениями двух типов (фиг.5B). Эти результаты подтверждают возможное применение ExoTest в клинических условиях с использованием цельной плазмы и устранение сложных и длительных процедур очистки экзосом.

ССЫЛКИ: