способ диагностики вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых методом полимеразной цепной реакции

Формула изобретения

Способ диагностики вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых методом полимеразной цепной реакции, при котором используют два прямых и два обратных олигонуклеотидных праймера для выявления фрагмента сегмента B, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса инфекционного некроза поджелудочной железы следующей структуры - B37: ACGTTGGTGGCACCCGACATAC, B123: TGTCGGACATCTTCAACTCACC, B320r: CAGTCGAGGCAGAGCGGCATC, B853r: GTGTCTCCTTTGGTTTTGCCTATG, с электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, где по наличию на электрофореграмме фрагментов длиной 860 и/или 240 пн в исследуемом образце диагностируют вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики вирусных болезней животных, научных исследований в ветеринарии и молекулярной биологии.

Инфекционный некроз поджелудочной железы (Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV) - высококонтагиозная вирусная болезнь, поражающая молодь культивируемых лососевых и некоторых видов рыб других семейств, обитающих как в пресной, так и в морской воде. Вирус инфекционного некроза поджелудочной железы наносит существенный экономический ущерб рыбоводческим хозяйствам РФ.

В комплексе мероприятий по оздоровлению хозяйств от вируса инфекционного некроза поджелудочной железы ведущее место принадлежит диагностике. Отсутствие коммерчески доступных диагностикумов на отечественном рынке вызвало необходимость создания тест - системы для идентификации IPNV методом полимеразной цепной реакции.

В настоящее время совершенствование методов диагностики IPNV крайне необходимо поскольку традиционные методы выделения вируса в культурах клеток не всегда позволяют идентифицировать вирус и занимают длительное время.

Принцип ПЦР заключается в многократном увеличении (амплификации) определенного участка ДНК выявляемого объекта путем его копирования с помощью фермента ДНК-полимеразы и специфических праймеров. Поскольку геном IPNV представлен двухцепочечной молекулой РНК в виде двух сегментов А и В, предварительно - перед постановкой ПЦР-РНК переводят в кДНК благодаря ферменту обратной транскриптазе. Специфические праймеры (прямой и обратный) ограничивают определенный фрагмент нуклеотидной последовательности таким образом, что элонгация новой цепи кДНК при обратной транскрипции и последующей амплификации в ПЦР происходит только между ними. Основными параметрами эффективного прохождения реакции амплификации, обеспечивающими специфичность и чувствительность, являются правильный выбор области генома идентифицируемого агента, структура и температурный режим отжига олигонуклеотидных праймеров.

Известны способы выявления фрагмента генома вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых методом ПЦР с использованием праймеров к сегменту А [1].

Также описан способ выявления РНК вируса инфекционного некроза поджелудочной железы методом «гнездовой» ПЦР (nested-PCR) с праймерами к сегменту А, которые имеют следующую структуру:

1 5'-CCAAACCAACAGGTCCTATCCTAC-3' (внешний прямой)

2 5'-TGATGCCGTTGTTCTCATCAGCTG-3' (внешний обратный)

3 5'-GAAGGAGATGACATGTGCTACACC-3' (внутренний прямой праймер с биотинилированной меткой на 5'-конце)

4 5'-GAGAGATGTGTTTGCCACCATCTC-3' (внутренний обратный)

Фрагмент, полученный в первом раунде ПЦР, служит матрицей во втором раунде ПЦР. Во втором раунде используется два меченых праймера: один имеет биотинилированную метку на 5'-конце, другой содержит радиоактивную метку ³²P. Разделение ампликонов проходит с использованием магнитных частиц с последующей детекцией уровня радиоактивного излучения [2].

Известные способы выявления фрагментов генома вируса инфекционного некроза поджелудочной железы не лишены недостатков: использование радиоактивной метки требует соблюдения специальных мер безопасности и лицензирования лаборатории, в способе, предложенном K. Williams et al., амплифицируется фрагмент гена VP2, характерный для всех бирнавирусов, что не исключает возможность ложноположительных результатов. Описанные в литературе праймеры подобраны к генам сегмента А. В то же время установлено, что изоляты IPNV, выделенные из разных географических мест, отличаются высоким генетическим разнообразием, главным образом, обусловленным вариабельностью генов, кодируемых именно сегментом А. В этой связи высока вероятность того, что праймеры к сегменту А могут не подойти к вновь изолированным вирусам с измененным генотипом. В первую очередь это касается изолятов из водоемов тех регионов, где исследование на присутствие IPNV ранее не проводилось.

Для идентификации возбудителя методом ПЦР целесообразно использовать праймеры к наиболее консервативной области генома. В случае IPNV это может быть сегмент В, кодирующий ключевой фермент репликации вирусного генома РНК-зависимую РНК-полимеразу.

В задачу исследований входило - разработка эффективного способа обнаружения фрагменов генома вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых методом гнездовой ПЦР с использованием 4 специфических олигонуклеотидных праймеров.

Первоочередной задачей было конструирование четырех специфических праймеров к IPNV, которые являются главным компонентом ПЦР и обеспечивают ее специфичность и чувствительность.

Для выбора праймеров был использован сегмент В - в то время как в публикациях преимущественно описаны праймеры к сегменту А. При конструировании праймеров и оценке их специфичности использовали нуклеотидные последовательности и программу BLAST, доступные в Интернете на сайте NCBI Предложенный способ заключается в следующем: с помощью компьютерной программы DNASTAR (Lasergene Co., США) на основании программы, предоставленной в базах данных Интернет ресурсов GenBank(CLUA), по генотипам вируса инфекционного некроза поджелудочной железы выбирают рефернс - последовательность NC_001916 штамма Jasper. Праймеры проверяют на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека программой BLAST с помощью веб-ресурса Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). На основании проведенного компьютерного анализа была подобрано 2 пары праймеров: внешние B37 и B853r и внутренние B123 и B320r.

Название	5'--3'	длина
B37	ACG TTG GTG GCA CCC GAC АТА С	22
B123	TGT CGG АСА ТСТ ТСА ACT CAC С	22
B320r	CAG TCG AGGCAG AGCGGC АТС	21
B853r	GTG ТСТ ССТ TTGGTT TTGCCT ATG	24

Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре.

Четыре праймера к сегменту В были подобраны таким образом, что позволяют применить технику гнездовой и полугнездовой ПЦР, а также могут быть использованы для секвенирования.

Праймеры имеют следующую характеристику: комлементарность выбранной области гена сегмента В, отсутствие самокомлементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, фланкируют область фрагментов гена В размером 860 пн и 240 пн, соответственно. Синтез разработанных олигонуклеотидных праймеров заказывается в коммерческом сервисном центре.

Пример 1

Амплификация специфических фрагментов кДНК вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых с помощью разработанных праймеров для диагностики болезни.

В процессе проведения практических экспериментов подбирают оптимальные условия прохождения полимеразной цепной реакции с разработанными праймерами.

Предварительно проводят реакцию обратной транскрипции с парой внешних праймеров. Реакция обратной транскрипции проходит при 42° в течение 45 минут, затем полученную кДНК прогревают при 95° в течение 3 минут и используют для постановки ПЦР. Состав реакционной смеси указан в таблице 1. В качестве положительного контроля на стадии обратной транскрипции и ПЦР используют эталонные штаммы IPN (предоставлен доктором E. Neuvonen, Ветеринарный институт, Хельсинки, Финляндия. Предварительно штамм был испытан методом ИФА), в качестве отрицательного - воду или среду для культур клеток (например, Игла MEM).

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу ДНК.

Состав реакционной смеси представлен в таблице 2. Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «Терцик» («ДНК-технология», Россия) представлен в таблице 3. Условия амплификации и реакционной смеси для первого и второго раунда одинаковые.

После проведения реакции амплификации продукты ПЦР анализируют методом электрофоретического разделения в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

В процессе ПЦР были получены продукты амплификации кДНК вируса инфекционного некроза поджелудочной железы размером около 860 пн в первом раунде ПЦР и 240 пн во втором раунде ПЦР, что подтверждалось во всех экспериментах. Электрофореграмма результатов ПЦР представлена на рис.1. При учете результатов ПЦР в первую очередь оценивали контрольные образцы. В электрофоретической дорожке с положительным контрольным образцом (K+) присутствовала светящаяся полоса на уровне соответствующем фрагменту длиной 860 или 240 пн (в первом и втором раунде, соответственно; оценивали по маркеру М).

Опытные пробы оценивали по наличию в соответствующей дорожке специфической полосы, которая в положительных образцах располагалась на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе. В отрицательных пробах полоса отсутствовала (рис.2).

Пример 2

Определение чувствительности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров.

Анализировали десятикратные разведения инфицированной IPNV суспензии клеток с исходным титром 7,5 lg ТЦД₅₀/мл. (10^7,5 ТЦД₅₀ /мл).

При проведении «гнездовой» ПЦР последним разведением, в котором обнаруживалась специфическая полоса, было разведение 10^-7, что соответствует 0,5 lg ТЦД₅₀/мл или ~3 ТЦД₅₀/мл. Электрофореграмма результатов ПЦР представлена на Рисунке 2.

Пример 3

Определение специфичности реакции амплификации с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров.

Специфичность праймеров проверяли на образцах вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани, вируса инфекционного некроза поджелудочной железы и вируса геморрагической септицемии лососевых. Специфическая полоса была выявлена только в случае наличия в пробе вируса инфекционного некроза поджелудочной железы.

Предложенный вариант апробирован с положительным результатом и регулярной воспроизводимостью в 2010-2011 годах на 500 пробах, полученных из гомогената внутренних органов рыб, поступивших из хозяйств Московской, Рязанской областей и республики Карелия, а также инфицированных клеточных культур.

Предлагаемое изобретение найдет применение в диагностических исследованиях в научно- исследовательских институтах, ветеринарных лабораториях, рыбоводческих хозяйствах.

Литература

1. Wiliams K., Blake S., Sweeney A., Singer J.T., Nicholson B.L. // Multiplex Reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses // J of clinical microbiology. - 1999. - V.37 ( № 12). - Р.4139-4141.

2. Rimstad E., Homes E., Olsvik O., Hyllseth B. // Identification of a double-stranded RNA virus by using polymerase chain reaction and magnetic separation of the synthesized DNA segments // J of clinical microbiology - 1990 -. V.28 ( № 10). - Р.2275-2278.

Сущность изобретения поясняется таблицами и рисунками, в которых отображается следующая информация:

Таблица 2
Состав реакционной смеси для проведения ПЦР для 1 реакции объемом 25 мкл
Компоненты ПЦР	Исходная концентрация	Конечная концентрация	Объем на 1 реакцию
ПЦР-смесь 2 red	2,5 х	1х	10 мкл
дНТФ	10 µМ	0,2 µМ	0,5 мкл
«Прямой» праймер B37(B123)*	10 µМ	0,2 µМ	0,5 мкл
«Обратный» праймер B853 (B320)*	10 µМ	0,2 µМ	0,5 мкл
Вода			8,5 мкл
кДНК (матрица)			5 мкл
* в скобках указаны праймеры для второго раунда ПЦР

Таблица 3
Температурно-временной режим проведения ПЦР (прибор «Терцик», Россия)
Описание стадии		Температура, °С	Длительность, сек.	Кол-во циклов
1	Предварительное нагревание прибора «пауза»	94	-	-
2	Черничная денатурация ДНК	95	120	1
3	Денатурация ДНК	95	20	3
4	Гибридизация праймеров со специфическими участками	50	20
5	Синтез комплементарных цепей	72	50
6	Денатурация ДНК	95	20	30
7	Гибридизация праймеров со специфическими участками	58	20
8	Синтез комплементарных цепей	72	50
9	Конечный синтез комп-х цепей	72	120	1
10	Хранение	10	-	-