способ моделирования молниеносного сепсиса, вызванного микстинфекцией на фоне ожоговой травмы

Формула изобретения

Способ моделирования молниеносного сепсиса, вызванного микстинфекцией на фоне ожоговой травмы отличающийся тем, что кроликам наносят термический ожог под наркозом площадью 12-23% площади поверхности тела путем погружения спины и боковой поверхности туловища в воду при температуре 90° на 10 с, затем подкожно вводят 1,0 мл некультурабельной культуры Staphylococcus aureus в концентрации 10⁵ микробных клеток в 1 мл и через 60 мин вводят некультурабельную культуру Pseudomonas aeruginosa подкожно также в объеме 1,0 мл с концентрацией 10⁵ микробных клеток в 1 мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для эпидемического расследования вспышек инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, и изучения патогенетического механизма развития молниеносного сепсиса с целью поиска новых патогенетических и этиотропных методов лечения сепсиса.

Термин «сепсис» предложил Гиппократ более двух тысяч лет назад, подразумевая под этим понятием распад тканей, неизбежно сопровождающийся гниением, болезнью и смертью. В настоящее время сепсис по-прежнему остается одной из самых актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту заболеваемости и стабильно высокой летальностью [Краснов М.В., Краснов В.М. Сепсис у детей раннего возраста: современные критерии диагноза и принципы лечения. / Клиническая микробиология и антимикробная терапия // 2010, № 1 (40). - С.28-39]. Сепсис является частой причиной летальности в отделениях реанимации и интенсивной терапии. Бактериальные инфекции наиболее часто становятся причиной септического шока. В США ежегодно диагностируют 300-500 тыс. случаев сепсиса, и несмотря на возрастающие возможности интенсивной терапии у пациентов с септическим шоком летальность достигает 60%. [Белобородов В.Б. Актуальные вопросы диагностики и лечения сепсиса. http//old.consilium-medicum.com/media/consilium/mdex.shtmlj. По данным Т.Г. Спиридоновой с соавт. у пациентов с глубокими ожогами летальность при сепсисе составляет 57,1% [Спиридонова Т.Г., Смирнов С. В., Лазарева Е.Б., Евдокимова Н.В., Меньшикова Е.Д. Особенности бактериемии и сепсиса у больных с термической травмой /Неотложная медицина. - 2011, № 1. www.criticaLru/emergency/hage.php?what=articles&chapter=20111.

Основным возбудителем сепсиса является Pseudomonas aeruginosa. Микроб обильно обсеменяет медицинское оборудование, циркулирует среди персонала и пациентов, вызывает до 20% внутрибольничных инфекций, треть всех поражений мочеполовой системы у урологических больных и считается причиной 20-25% гнойно-хирургических инфекций и первичных грамотрицательных бактериемий; часто инфекция наблюдается у больных с ожогами и заболеваниями мочевого пузыря, а резервуарами возбудителя могут быть самые различные объекты (например, сырые овощи, букеты цветов) [Медицинская микробиология /Ред. В.И. Покровский, О.К. Поздеев. - М.: ГЭОТАР, МЕДИЦИНА, 1998. - 1200 с.].

М.Т. Абидов с соавт. предложили способ моделирования грамположительного стафилококкового сепсиса [патент RU № 2058598 от 20.04.1996]. Для моделирования сепсиса автор предложил использовать препарат аминофталгидрозид, подавляющий бактерицидную активность нейтрофильных гранулоцитов. Препарат использован при внутривенном введении. На фоне этого препарата вводили внутривенно культуру культивируемого стафилококка в высокой концентрации (10⁸ степени), обычно выделяемой только в лабораторных условиях. Такие условия возникновения сепсиса практически не наблюдаются в клинической практике. Прежде всего, больные не получают препараты, снижающие бактерицидную активность сывороток крови, а внутривенное проникновение микробов в такой концентрации (10⁸ степени) практически не наблюдается у пациентов. Предложенная экспериментальная модель может быть использована только для проведения научно-исследовательских работ. Кроме того, в практическом здравоохранении чаще сепсис вызывает микстинфекция.

Предложен способ моделирования грамотрицательного сальмонеллезного сепсиса [патент RU № 2058599 от 20.04.1996 г.]. Способ не позволяет моделировать молниеносный сепсис. Созданная модель позволяет на 4 сутки установить клиническую картину развития сальмонеллезного сепсиса. Для стимуляции возникновения сепсиса авторы использовали аминофталгидрозид, искусственное введение которого подавляет функционально-метаболическую активность нейтрофильных гранулоцитов и макрофагов. Данный препарат больным не вводят и поэтому механизм возникновения сепсиса в эксперименте отличается от заболеваний, возникающих в естественных условиях. Недостатками предложенного способа являются воспроизведение моноинфекции и использование неадекватно большой инфицирующей дозы для кроликов (0,5.10⁹ микробных клеток). Инфицирование пациентов в больничных помещениях в такой дозе обычно не происходит.

Предложен способ моделирования молниеносного сепсиса у крыс в результате перфорации слепой кишки с летальным исходом 92% случаев [Lundblad R. et al. Granulocyte colony-stimulating factor improves myelopoiesis and host defense in fulminant intra-abdominal sepsis in rats //Shock. 1995 Jul; 4 (1): 68-73, реф.]. Сепсис вызван различными бактериями желудочно-кишечного тракта. Одним из недостатков предложенного способа является то, что не установлена этиология возбудителей, вызывающих сепсис, а следовательно, нельзя провести этиотропное лечение больных. Кроме того, предложенный способ мойсет быть использован только для разработки способов лечения пациентов, а не для выявления в ЛПУ циркуляции возбудителей инфекционных заболеваний, вызывающих сепсис.

Наиболее близким техническим решением, выбранный нами в качестве прототипа, является способ моделирования молниеносного сепсиса, вызванного Pseudomonas aeruginosa [Ridings, Р.С et al. Beneficial cardiopulmonary effects of pentoxifylline in experimental sepsis are lost once septic shock is established. // Arch Surg., 1994. - Nov; 129 (11): 1144-52, реф.]. Недостатками предложенного способа является: 1. Использование высокой концентрации синегнойной палочки (5.10 ⁸ микробных клеток в 1 мл); 2. Для воспроизведения молниеносного сепсиса использована моноинфекция, вызванная синегнойной палочкой; 3. Для воспроизведения экспериментальной модели использована культурабельная форма синегнойной палочки. Как известно, синегнойная палочка относится к биопленкообразующим бактериям и поэтому чаще находится в некультурабельном состоянии.

Задачей настоящего изобретения является разработка простого способа создания экспериментальной модели молниеносного сепсиса, вызванного микстинфекцией в условиях максимально приближенных к естественному инфицированию больных в стационарах.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат способ, основанный на инфицировании лабораторных животных некультурабельными бактериями Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa на фоне ожоговой травмы. Для инфицирования животных использована концентрация бактерий, которая обычно определялась на поверхности ран у больных с ожоговой болезнью.

Технический результат достигается тем, что согласно изобретению кроликам наносят термический ожог под наркозом площадью 12-23% площади поверхности тела путем погружения спины и боковой поверхности туловища в воду при температуре 90° на 10 с, затем подкожно вводят 1,0 мл некультурабельной культуры Staphylococcus aureus в концентрации 10³ микробных клеток в 1 мл и через 60 мин вводят некультурабельную культуру Pseudomonas aeruginosa подкожно также в объеме 1,0 мл с концентрацией 10⁵ микробных клеток в 1 мл.

На 1-3 сутки у животных отмечались клинические признаки молниеносного сепсиса и летальный исход при явлениях септического шока.

Сущность способа достигается тем, что ожоговая травма через механизм стресса и нарушение иммунологической реактивности организма, а также в результате интоксикации, связанной с повреждением тканей, вызывает переход некультурабельных бактерий Р. aeruginosa в культивируемое состояние с выделением ферментов агрессии и повышением проницаемости тканей. В результате этого возникает микстинфекция, вызванная некультурабельным стафилококком, культурабельными синегнойной и кишечной палочками. Escherichia coli проникает в кровь в результате пареза тонкого кишечника и инфицирует различные органы и ткани организма. Вышеперечисленные факторы вызывают развитие молниеносного септического шока.

Тяжесть эндогенной интоксикации при сепсисе определяется массивностью поступления в кровоток продуктов распада тканей. При нарушении барьерной антитоксической функции печени в сыворотке крови возрастает концентрация микроэлементов с переменной валентностью, к которым относится двухвалентное железо. Являясь активаторами перекисного окисления липидов, ферроионы истощают резервы антиоксидантной защиты организма, что приводит к гиперактивации процессов перекисного окисления липидов, возрастанию в системном кровотоке средне- и низкомолекулярных пептидов, прогрессированию эндогенной интоксикации и осложнению сепсиса полиорганной недостаточностью и инфекционно-токсическим шоком.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом: кролика помещают в клетку в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом № 1045-73) на 3 дня карантина для адаптации кроликов к новым клеткам в эксперименте Животных содержат в виварии при температуре воздуха 24-26°С в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации. У кролика удаляли волосяной покров со спины и боковой поверхности туловища площадью 25% поверхности тела.

Наркоз осуществляли по методике предложенной А.В. Разиной [Разина А.В. Влияние различных вариантов общей анестезии и операционной травмы на организм кроликов. Автореф. канд. дисс.. Троицк. - 2010]. Премедикацию проводили 2% раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5% раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно. У кроликов регистрировалось состояние общей анестезии достаточной по глубине и продолжительности для воспроизведения экспериментальной ожоговой травмы.

Поверхность спины и боковые поверхности туловища кролика погружали в водяную баню на 10 с при температуре 90°С. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку и подкожно кролику вводили 1,0 мл некультурабельных бактериЙ S. aureus в концентрации 10⁵ микробных клеток в 1 мл, а затем через 60 мин некультурабельную культуру P.aeruginosa в концентрации 1,0 мл 10⁵ микробных клеток в 1 мл. Некультурабельные бактерии получали по методике, предложенной Л.Б. Козловым с соавт. [Патент RU № 2470074 от 20.12.2012 г. Способ выделения некультивируемых бактерий стафилококка]. Клинические проявления микстинфекции регистрировали в течение 21 дня.

Примеры практического использования предлагаемого способа

Пример 1.

Кролика породы «шиншилла» помещали в клетку в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом № 1045-73) на 3 дня карантина для адаптации кролика к новой клетке в эксперименте. Кролика содержали в виварии при температуре воздуха 24-26°С в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации. Со спины и боковой поверхности тела кролика удаляли волосяной покров.

Наркоз осуществляли по следующей методике: Премедикацию проводили 2% раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5% раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно. Затем погружали очищенную от шерсти поверхность в водяную баню на 10 с при температуре 90°С. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку и подкожно кролику вводили 1,0 мл некультурабельные бактерии S. aureus в концентрации 10 ⁵ микробных клеток в 1 мл и через 60 мин 1,0 мл некультурабельную культуру P. aeruginosa в концентрации 10³ микробных клеток в 1 мл. Некультурабельные бактерии получали по методике предложенной Л.Б. Козловым с соавт. [Патент RU № 2470074 от 20.12.2012 г.]. Через сутки у кролика регистрировались клинические симптомы сепсиса, а через 52 часа кролик погиб в результате микстинфекции, вызванной культурабельными синегнойной и кишечной палочками и некультурабельным S. aureus. При вскрытии животного площадь глубокого ожога составила 13,0% площади поверхности тела кролика.

Используя культуральные методы выделить S. aureus не удалось (посев на мясо-пептонный, молочно-солевой, желточно-солевой и кровяной агар).

Синегнойная палочка выделялась из всех органов вскрытого животного, а кишечная палочка выделялась только из сердца. Для выделения культурабельных бактерий P. aeruginosa проводили посев на селективную среду ЦПХ-агар, 5% кровяной агар и агар Эндо. Идентификацию бактерий проводили на основании изучения культуральных и морфологических свойств бактерий, пигментообразованию, способности образовывать цитохромоксидазу, росту на среде Кинг А, среде Хью-Лейфсена и ацетамидном агаре, способности роста при 42°С и отсутствии роста при 5°С.

Е. coli выделяли на среде Эндо при температуре 37°С. Через 18-24 ч инкубации в термостате с этой среды отбирали красные лактозоположительные колонии эшерихий и агглютинировали их на стекле с поливалентной ОК-сывороткой, содержащей антитела к 22 сероварам энтеропатогенных кишечных палочек (ЭПКП). При положительной реакции агглютинации колонии пересевали на скошенный агар и на следующие сутки выделенную культуру агглютинировали с поливалентными сыворотками. На заключительном этапе серологической идентификации ЭПКП ставили развернутую реакцию агглютинации со специфическими сыворотками. При положительной развернутой реакции агглютинации выделенной культуры проводили посев на среды Гисса для изучения ее сахаролитических и протеолитических свойств.

Пример 2

Кролика породы «шиншилла» помещали в клетку в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным Государственным санитарным врачом № 1045-73) на 3 дня карантина для адаптации кролика к новой клетке в эксперименте. Кролика содержали в виварии при температуре воздуха 24-26°С в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации.

Со спины и боковой поверхности тела кролика удаляли волосяной покров. Наркоз осуществляли по следующей методике: Премедикацию проводили 2% раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг, а на его фоне внутримышечно вводили 5% раствор золетина в дозе 7,5 мг/кг массы тела кролика соответственно. Затем погружали очищенную от шерсти поверхность кролика в водяную баню на 10 с при температуре 90°С. На ожоговую поверхность накладывали стерильную асептическую марлевую повязку и подкожно кролику вводили 1,0 мл некультурабельные бактерии S.aureus в концентрации 10³ микробных клеток в 1 мл и через 60 мин 1,0 мл некультурабельную культуру P. aeruginosa в концентрации 10⁵ микробных клеток в 1 мл. Некультурабельные бактерии выделяли по методике предложенной Л.Б. Козловым с соавт. [Патент RU № 2470074 от 20.12.2012 г.]. В первые же сутки у кролика регистрировались клинические симптомы сепсиса и через 17 часов кролик погиб в результате микстинфекции, вызванной культурабельными бакатериями P. aeruginosa и некультурабельным S. aureus. Площадь ожога составила 15,38% площади поверхности тела. Культурабельные культуры S. aureus и E. coli из крови и внутренних органов выделить не удалось. Выделение и идентификацию синегнойной палочки, золотистого стафилококка и кишечной палочки проводили по описанным выше методикам.

Предложенный способ апробирован на базе ООО Научно-производственного инновационного предприятия «Тюменский институт микробиологических технологий». Под наблюдением находилось 16 кроликов породы «шиншилла». Результаты исследований представлены в таблице 1. Установлено, что молниеносный токический сепсис с летальным исходом возникал через 17-52 часа после микстинфекции, вызванной некультурабельными бактериями S. aureus и P. aeruginosa на фоне ожоговой болезни. Клинические проявления болезни регистрировались у экспериметальных животных в 100%, а летальный исход - в 87,5% случаев. Оценка положительного эффекта применения предложенной экспериментальной модели по сравнению с прототипом представлена в таблице 2.

Способ моделирования молниеносного сепсиса, вызванного некультурабельными бактериями P. aeruginosa и S. aureus открывает новые возможности расследования эпидемических вспышек инфекционных заболеваний, связанных с оказанием медицинской помощи, в этиологии которых ведущую роль играют культурабельные и некультурабельные бактерии, а также позволяет проводить исследования по испытанию эффективного патогенетического и этиотропного лечения больных с молниеносным сепсисом, возникшим на фоне ожоговой травмы.

Таблица 2
п/п № №	Отличительные признаки способа	Прототип	Предложенный способ
1	Вид микробов, вызывающих сепсис	P. aeruginosa	S. aureus, P. aeruginosa, E. coli
2	Культурабельность бактерий	Культурабельные	Некультурабельные и культурабельные
3	Срок клинического проявления сепсиса (в часах)	5	28,7±2,8
4	Количество вводимой дозы бактерий в 1 мл взвеси	5.10 8	105
5	Вид лабораторных животных	свиньи	Кролики
6	Научная новизна изобретения	Патент характеризует общий уровень развития техники	Опыт с некультурабельными бактериями открывает новое направление в эпидемиологии, диагностике, лечении и профилактике инфекционных заболеваний

Таблица 1
Характеристика инфекционного процесса у кроликов, вызванного введением некультурабельных штаммов S. aureus и. P. aeruginosa на фоне ожоговой травмы (n=14)
№ кро лика	Масса тела кролика до эксперимента (в граммах)	Масса тела кролика при вскрытии (в граммах)	Площадь глубокого ожога (в %)	Средняя суточная потеря массы тела (в граммах)	Срок летальности (в часах)	Выделе из органов кролика при вскрытии
						P. aeruginosa	E. coli
1	2600	2500	12,66	100.0	39	+	-
2	2300	2230	15,38	70,0	17	+	-
4	3600	3525	17,77	75,0	18	+	-
5	2100	2025	14,68	75,0	21	+	-
6	2600	2500	22,85	100,0	49	+	-
7	2560	2500	17,15	60,0	20	+	-
8	2100	2045	16,66	55,0	18	+	-
9	3150	3075	13,51	75,0	22	+	-
10	3750	3660	17,77	90,0	36	+	+
12	2700	2605	20,0	95,0	48	+	+
13	3700	3630	12,45	70,0	22	+	-
14	2600	2535	17,15	65,0	21	+	-
15	2660	2600	16,58	60,0	19	+	-
16	3300	3200	13,0	100,0	52	+	+
	2837,14±129,92	2759,28±128,74	16,32±0,81	77,86±3,54	28,71±2,76	100%	21,4%
Примечание: В таблицу не включены кролики под номерами 3 и 11 с площадью ожога 14,1% и 14,7% соответственно в связи с тем, что животные прожили в течение 21 дня.