способы скрининга с использованием насекомых, имеющих гематоэнцефалический барьер

Формула изобретения

1. Способ оценки возможности транспорта химического соединения через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) позвоночного, предпочтительно млекопитающего, например человека, указанный способ включает этапы:

введения химического соединения насекомому, имеющему ГЭБ,

выдерживания насекомых,

препарирования мозга насекомых и

измерения концентрации химического соединения в мозге.

2. Способ по п.1, в котором насекомые выбраны из группы, состоящей из отрядов Blattoidea, Diptera, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera и Lepidoptera.

3. Способ по п.1, в котором насекомых выдерживают в течение времени от 0,5 ч до 5 ч до препарирования мозга насекомых с целью количественного определения концентрации в мозге введенного химического соединения.

4. Способ по п.1, в котором препарирование мозга выполняют немедленно после умерщвления насекомых.

5. Способ по п.1, в котором измерение концентрации химического соединения выполняют посредством гомогенизирования препарированного мозга, предпочтительно центрифугирования гомогената и анализа концентрации химического соединения в гомогенате при помощи жидкостной хроматографии, возможно с масс-спектрометрическим определением элюированных соединений.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором химическое соединение вводят парентерально или перорально.

7. Способ по любому из пп.1-5, включающий определение градиентов концентрации химического соединения в теле: мозге для количественного определения проницаемости ГЭБ.

8. Способ по любому из пп.1-5, включающий сравнение относительной эффективности химических компонентов с желаемой активностью в центральной нервной системе в присутствии гематоэнцефалического барьера.

9. Способ по п.7, включающий определение возможности метаболизма химического соединения в гематоэнцефалическом барьере.

10. Применение насекомых, выбранных из группы, состоящей из отрядов Blattodea, Diptera, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera и Lepidoptera, для оценки транспортируется ли химическое соединение через гематоэнцефалический барьер позвоночного, предпочтительно млекопитающего, например человека.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение описывает модели на насекомых, предназначенные отображать проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Исследования проницаемости гематоэнцефалического барьера являются чрезвычайно важными при поиске новых лекарственных препаратов; эффективные лекарственные препараты для ЦНС должны проникать через гематоэнцефалический барьер, тогда как прохождение через гематоэнцефалический барьер лекарственных препаратов, действующих на периферии, может приводить к нежелательным побочным эффектам. В частности, данное изобретение касается применения насекомых в скрининге веществ, оказывающих биологическое влияние на мозг или центральную нервную систему и/или влияние на заболевание или нарушение, затрагивающее мозг или центральную нервную систему. Оно также касается применения таких насекомых в скрининге веществ, обладающих желаемой биологической активностью и не проходящих через гематоэнцефалический барьер.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Поиск новых лекарственных препаратов является дорогостоящим предприятием, в котором больше всего денежных средств и времени затрачивается на исследования in vivo. Для снижения этих затрат разработано большое количество моделей in vitro, которые применяются в качестве «фильтров» для отбора соединений, наиболее подходящих для исследований in vivo. Однако модели in vitro зачастую являются излишне упрощенными и за счет этого могут вводить в заблуждение в процессе принятия решений. Таким образом, существует потребность для промежуточных моделей, которые были бы более надежными по сравнению с моделями in vitro и в то же время более быстрыми и дешевыми, чем общепринятые модели in vivo на позвоночных. Для этой цели можно использовать насекомых, и в настоящее время в качестве промежуточной фармакодинамической модели EnVivo Pharmaceuticals Inc., разрабатывающая лекарственные препараты для ЦНС, использует плодовых мушек.

У исследований in vitro существуют различные недостатки. Невозможно проводить тесты in vitro для объяснения всех биологических событий, происходящих in vivo. Существуют биологические события, природа которых еще до конца не известна, или существующие тесты in vitro несовершенны, например, тестам может недоставать важных характеристик, существующих in vivo, например, молекул активных переносчиков, метаболических ферментов, или же биологические события могут оказаться непредвиденными. Несмотря на очевидные недостатки, модели in vitro широко применяются в процессе поиска новых лекарственных препаратов, причем большинство фармацевтических компаний используют большие панели скрининговых тестов in vitro. Исследование соединений в большом количестве тестов in vitro может не всегда отражать их поведение in vivo. Действительно, нередко у соединений, имеющих приемлемые профили in vitro, оказываются неудовлетворительные профили in vivo. И напротив, соединения могут быть необоснованно отбракованы. Таким образом, существует потребность в промежуточных моделях in vitro/in vivo, которые позволили бы получать корректные данные при поиске новых лекарственных препаратов и таким образом сократить количество дорогостоящих экспериментов in vivo.

In vitro модели применяют, исходя из предположения, что каждая из моделей отражает одно единственное изолированное биологическое событие in vivo. Однако, большое количество моделей in vitro, которые применяются на стадии разработки (Ruiz-Garcia et al. 2007), нацелены на то, чтобы отражать сложность биологии in vivo, когда многочисленные биологические события происходят во множестве отделов. Основным ограничением при применении множества моделей in vitro является отсутствие взаимодействия между различными биологическими событиями и взаимодействия между различными отделами. Одним важным преимуществом применения насекомых в качестве промежуточных моделей является то, что эти модели удовлетворяют требованию о наличии сложных взаимодействий не только между различными компонентами структур гематоэнцефалического барьера, но также между различными отделами, появляющимися у насекомых, т.к. они являются биологическими видами, у которых такие отделы в большой степени схожи с позвоночными.

Гематоэнцефалический барьер позвоночных представляет собой физиологический барьер между тканью мозга и кровеносными сосудами, который ограничивает обмен растворенных веществ и регулирует абсорбцию экзогенных агентов (например, лекарственных препаратов) из крови в мозг. Функционирование центральной нервной системы (ЦНС) требует строгой регуляции внеклеточного окружения. Анатомически Гематоэнцефалический барьер у позвоночных построен из эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла, взаимосвязанных с помощью высокоспециализированных плотных контактов, создающих барьер для диффузии и таким образом играющих главную роль в проницаемости. Обнаруженные недавно компоненты плотных контактов включают клаудины, семейство трансмембранных белков, 4-кратно пронизывающих мембрану, которые предположительно отвечают за барьерную функцию плотных контактов (Turksen and Troy 2004). Проницаемость гематоэнцефалического барьера является одним из основных препятствий при разработке эффективных лекарственных препаратов для ЦНС.С другой стороны, когда происходит проникновение через гематоэнцефалический барьер, это может вызвать нежелательные побочные эффекты у препаратов, действующих на периферии (Schinkel 1999) (см. обзор Pardridge 2002).

Проницаемость ГЭБ обычно подразделяют на проницаемость, в основе которой лежат химические или биологические процессы. Проницаемость, в основе которой лежат химические процессы, связана с пассивной диффузией, опосредованной липидами, зависящей от физико-химических свойств молекулы, т.е. небольшие гидрофобные молекулы имеют склонность легче проникать через гематоэнцефалический барьер по сравнению с крупными и гидрофильными молекулами. В проницаемости, в основе которой лежат биологические процессы, задействованы компоненты, являющиеся субстратами для систем, осуществляющих эндогенный транспорт в/из ГЭБ, например, было показано, что многие небольшие молекулы (например, лекарственные препараты) являются субстратами для Р-гликопротеинового (Р-ГП) переносчика. Р-гликопротеины являются белками-переносчиками, расположенными в клеточной стенке клеток, составляющих гематоэнцефалический барьер (Schinkel 1999), и являются консервативными у таких различных таксонов как простейшие, растения, насекомые и млекопитающие (Gaertner et. al. 1998). Р-ГП присутствуют в клетках многих типов и играют важную роль в адсорбции, распределении, метаболизме и токсичности лекарственных препаратов (Xia et al. 2006).

Очевидно, что при поиске новых лекарственных препаратов чрезвычайно важно знать их способность проникать через гематоэнцефалический барьер и желательно получать такие сведения без проведения излишнего количества исследований in vivo. Поэтому для прогнозирования поведения исследуемых компонентов in vivo было разработано несколько in vitro моделей проницаемости ГЭБ. Однако, как оказалось, даже сложные in vitro модели, использующие системы Р-ГП переносчиков (Di and Kerns 2003, Summerfield et al. 2005) не соответствуют степени сложности, присущей плотным контактам и, следовательно, могут не очень хорошо описывать поведение in vivo. На это четко указывают результаты крупного исследования проницаемости ГЭБ, в котором 22 соединения были протестированы в 10 различных in vitro моделях проницаемости ГЭБ (Garberg 2005). Ни в одной из десяти моделей не было обнаружено какой-либо корреляции между проницаемостью in vitro и in vivo. Это указывает на то, что определенные модели гематоэнцефалического барьера не обязательно позволяют составить лучший прогноз по сравнению с моделями, не имитирующими ГЭБ. Кроме того, предполагается, что связывание белков, ток крови, метаболическая стабильность и липофильность, а также аффинность к другим переносчикам гематоэнцефалического барьера являются факторами, которые также следует учитывать при прогнозировании распределения соединений в мозге in vivo. Следовательно, in vitro модели оказываются главным образом предназначенными для качественного определения того, какие компоненты проникают через гематоэнцефалический барьер путем пассивной диффузии или отток каких компонентов происходит через Р-ГП переносчики (Garberg 2005).

Определенные беспозвоночные служили удобными моделями для изучения многих различных биологических процессов. В частности, плодовая мушка, Drosophila melanogaster является общепринятым модельным организмом для проведения исследований, внесшим существенный вклад в понимание генетических, нейробиологических, молекулярно-биологических и др. механизмов (Gullan and Cranston 2000). Как правило, насекомые и позвоночные имеют много общих физиологических признаков. Они являются многоклеточными организмами со сложной компартментализацией нервной системы, предназначенной для выполнения таких специализированных функций как зрение, обоняние, обучение и память. Нервные системы насекомых и позвоночных характеризуются схожим физиологическим ответом, множеством идентичных нейрогормонов и рецепторов. Насекомые имеют бессосудистую нервную систему, в которой гемолимфа омывает все внешние поверхности ганглиев и нервов. Таким образом, многим насекомым требуется сложная система гематоэнцефалического барьера для защиты их ЦНС от растительных нейротоксинов и для сохранения надлежащего ионного микроокружения нейронов. Действительно, сложная система гематоэнцефалического барьера у насекомых оказалась преимуществом в эволюционном плане. У насекомых такой гематоэнцефалический барьер в основном построен на системе клеток глии, у позвоночных эта роль перешла к системе клеток эндотелия вследствие возросшей значимости микроциркуляторного русла мозга у позвоночных. В поддержку этой точки зрения служит возникновение глиальной системы у пластиножаберных рыб и остатки их глиального барьера в ЦНС современных млекопитающих. Таким образом, насекомые обладают гематоэнцефалическим барьером, который является важным компонентом окружения нервной системы. Гематоэнцефалический барьер у насекомых чрезвычайно сложен, но может отличаться по структуре у насекомых различных отрядов. Таким образом, насекомые, имеющие очень сложный Гематоэнцефалический барьер с развитыми интегративными компонентами, имитирующими барьер позвоночных, будут прекрасной моделью для регистрации прохождения различных молекул через такие структуры.

US 20050132425 A1 описывает трансгенную муху, экспрессирующую форму человеческого пептида Abeta42 с мутацией Italian человеческого белка-предшественника амилоида, и двойную трансгенную муху, экспрессирующую как белок Таи, так и человеческий пептид Abeta42_Italian человеческого белка-предшественника амилоида. Трансгенные мухи используются как модели нейродегенеративных нарушений, например, болезни Альцгеймера. US 20050132425 A1 также описывает способы выявления генов-модификаторов, а также способы скрининга для выявления терапевтических соединений для лечения нейродегенеративных нарушений с применением трансгенных мух.

WO 04006854 A2 описывает способ скрининга влияния исследуемого агента на популяцию насекомых, включающий этапы получения популяции особей, введение по меньшей мере одного исследуемого агента в популяцию, создание цифрового фильма, показывающего движение насекомых, определение по меньшей мере одной характеристики насекомых популяции, подвергшихся влиянию исследуемого агента. В публикации также предложен способ изготовления препарата, подходящего для лечения заболеваний млекопитающих.

Marsh и Thompson (Marsh and Thompson 2006) указывают, что насекомые являются очень удобной модельной системой, из-за своей простоты в сочетании с высокой репродуктивностью. Некоторые из моделей (на дрозофилах) показали свою эффективность при исследовании соответствующих лекарственных препаратов и позволили обнаружить сходство в эффективности препаратов у мух и млекопитающих при таких заболеваниях как болезни Хантингтона, Паркинсона и Альцгеймера.

Marsh и Thompson (Marsh and Thompson 2004) предполагают, что доминантные нейродегенеративные заболевания человека могут быть точно смоделированы на насекомых, таких как дрозофила (плодовая мушка), поскольку они демонстрируют ключевые признаки этих заболеваний, такие как медленно прогрессирующая дегенерация, позднее начало заболевания, образование аномальных агрегатов белков и т.д. Согласно мнению авторов, способность манипулировать такими рекомбинантными организмами, позволяет выявить патогенетические механизмы и быстро протестировать возможные фармакологические схемы. Авторы полагают, что прекрасное согласование полученных на сегодняшний день результатов фармакологического лечения, эффективно подавляющего патологические изменения как у мух, так и у мышей, позволяет с растущей уверенностью считать, что модели на беспозвоночных организмах могут продуктивно ускорить выявление агентов, которые могут оказаться эффективными в лечении заболеваний млекопитающих.

Как следует из вышеупомянутых литературных данных, известный уровень техники включает проведение исследований соединений для применения в лечении нейродегенеративных заболеваний человека в первую очередь на мухах (дрозофилах). Однако все еще существует потребность в установлении подходящих скрининговых моделей, выходящих за рамки общеупотребительных способов тестирования in vitro для определения/оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера для лекарственных препаратов. При этом следует учитывать, что мухи имеют септированные контакты, а не плотные контакты, как позвоночные и саранча, бабочки и тараканы.

Существует насущная потребность в более сложных скрининговых моделях для поиска новых лекарственных препаратов, а также для исследования токсичности в отношении ЦНС у химических веществ, существующих на рынке, влияние которых на функцию мозга мало изучено.

Таким образом, при поиске новых лекарственных препаратов существует:

а) потребность в эффективном скрининге соединений, направленно действующих на мишени- в составе ЦНС. Такой скрининг предпочтительно выполняется на моделях на насекомых с интактной функцией гематоэнцефалического барьера и будет способствовать позитивному отбору соединений, проникающих через гематоэнцефалический барьер. Такой скрининг включает низкомолекулярные соединения по ряду показаний (например, боль, эпилепсия, болезнь Паркинсона, шизофрения, болезнь Альцгеймера, нарушения сна, тревожность, депрессия, нарушения питания, злоупотребления наркотиками и лекарственными средствами, включая курение).

б) потребность в эффективном скрининге соединений, нацеленных на то, чтобы оказывать воздействие за пределами ЦНС и способными вызвать неприемлемые побочные эффекты при проникновении в ЦНС.

в) потребность в эффективном скрининге, проводимом на моделях на насекомых, характеризующихся отдельными изменениями в функционировании гематоэнцефалического барьера. Такой скрининг включает соединения или пептиды или макромолекулы с молекулярным весом от низкого до очень высокого при заболеваниях, характеризуемых нарушением функции гематоэнцефалического барьера (например, ишемическом инсульте, травматическом повреждении мозга, злоупотреблении наркотиками и лекарственными средствами, нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера, эпилепсия, инфекционных заболеваниях, воспалительных процессах, таких как менингит и рассеянный склероз, ВИЧ).

Кроме того, существует потребность в скрининге химических соединений, существующих на рынке, у которых не была классифицирована или документально зафиксирована их возможная нейротоксичность.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Общая цель данного изобретения - разработка скрининговых моделей на насекомых для определения/оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера для различных химических соединений у позвоночных, таких как млекопитающие, предпочтительно, человек, с целью усовершенствования процедуры/процесса скрининга соединений на ранних этапах поиска новых лекарственных препаратов. Достижение данной цели позволит добиться ряда преимуществ по сравнению с существующими технологиями, поскольку модели на насекомых являются более надежным инструментом в процессе принятия решения, чем существующие модели in vitro, и позволит ускорить процесс скрининга лекарственных препаратов и сократить интенсивность расходования средств на завершающих фазах. Кроме того, это позволит сократить количество млекопитающих, принесенных в жертву в процессе поиска новых лекарственных препаратов.

Авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) у насекомых, выбранных из группы, состоящей из тараканов, саранчи и бабочек, имеет гораздо больше общего с ГЭБ млекопитающих, чем это предполагалось ранее. Было обнаружено, что система барьеров у этих насекомых представлена плотными контактами, тогда как у мух (например, дрозофилы) она представлена септированными контактами (Banerjee and Baht 2007). Насекомые по данному изобретению могут, таким образом, служить в качестве промежуточной модели для определения проницаемости ГЭБ для химических веществ.

Таким образом, настоящее изобретение способно впервые предложить обоснованный подход при скрининге соединений для применения по неврологическим показаниям, а также создания простой системы in vivo для определения проникновения соединения в мозг. Настоящее изобретение также способно обеспечить рациональную основу для скрининга соединений на моделях на насекомых, имитирующих дисфункцию ГЭБ вследствие неврологических нарушений.

Поиск новых лекарственных препаратов представляет собой длительный и дорогостоящий процесс, требующий огромного количества химических и биологических ресурсов. В настоящем изобретении возможность использовать насекомых в качестве модельной системы была тщательно разработана с целью усовершенствования процесса отбора соединений и сокращения затрат в ходе поиска новых лекарственных препаратов. Основываясь на недавних открытиях, авторы изобретения предположили, что модели на насекомых по данному изобретению позволяют лучше обосновать отбор соединений для исследований на позвоночных по сравнению с существующими моделями in vitro.

В одном аспекте изобретения предлагается способ скрининга проницаемости ГЭБ для исследуемого агента, указанный способ включает этапы:

- введения исследуемого агента насекомым, выбранным из отрядов, состоящих из Blattodea, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera и Lepidoptera,

- выдерживания насекомых в течение времени от 0,05 ч и 72 ч,

- препарирования мозга насекомых,

- измерения концентрации исследуемого агента в препарированном мозге.

В предпочтительном воплощении данного изобретения насекомые выбраны из отрядов Acridoidea (саранча) и Blattodea (тараканы).

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения насекомых выдерживают в течение времени между 0,5 ч и 5 ч до препарирования мозга насекомых с целью определения концентрации в мозге введенного исследуемого агента.

Препарирование мозга предпочтительно следует выполнять немедленно после умерщвления насекомых. В альтернативном случае мозг препарируют и удаляют у живых насекомых.

Предпочтительно препарированный мозг гомогенизируют и, возможно, лизируют с целью получения гомогенной жидкости, отражающей состав мозга.

Жидкость центрифугируют и надосадочную жидкость хранят до проведения анализа. Дальнейший анализ жидкости может выполняться при помощи жидкостной хроматографии, возможно, с масс-спектрометрическим определением элюированных соединений.

В следующих воплощениях изобретения предлагаются способы скрининга для агентов, обладающих желаемой биологической активностью в организме, а также нежелательной биологической активностью на мишени, присутствующие в мозге, центральной нервной системе и/или глазах.

Таким образом, способ скрининга по данному изобретению может применяться для определения биологической активности исследуемого вещества и для определения/оценки способности или неспособности исследуемого вещества проходить через гематоэнцефалический барьер, в частности, гематоэнцефалический барьер человека, например, путем определения, будет ли вещество появляться в сколько-нибудь значимой степени в мозге, центральной нервной системе или глазах в отсутствие его непосредственного введения в эти ткани.

В различных аспектах и воплощениях данного изобретения описаны объекты, изложенные в следующей ниже формуле изобретения.

Изобретение, в общем, может найти применение в любой программе поиска новых лекарственных препаратов, предназначенных для разнообразных заболеваний и нарушений, в частности, дегенеративных нарушений, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, заболевания двигательных нейронов, таупатию, кортико-базальную дегенерацию; нервно-психиатрические нарушения, включая депрессию, или биполярные расстройства, шизофрению, тревожность и агрессию. Кроме того, изобретение можно применять в программах поиска новых лекарственных препаратов, направленно действующих на периферические мишени, для которых неприемлемы какие-либо побочные эффекты на ЦНС, или скрининга химических соединений, чье влияние на функцию ЦНС неизвестно.

Таким образом, изобретение в равной мере может применяться для скрининга агентов, обладающих биологическим эффектом, изменяющим активность или функцию центральной нервной системы, мозга или глаз, как нормальных, так и подверженных заболеванию или нарушению, а также для скрининга агентов, которые обладают биологическим эффектом, благоприятным в отношении признаков или симптомов заболевания или нарушения. Кроме того, данное изобретение предоставляет возможность исследовать, имеет ли место непреднамеренная проницаемость ГЭБ для лекарственных препаратов и токсических агентов, действующих на периферии, например, пестицидов.

После выявления исследуемого вещества с желаемой биологической активностью посредством способа скрининга в соответствии с любым аспектом или воплощением данного изобретения, исследуемое вещество может войти в состав композиции содержащей, по меньшей мере, один дополнительный компонент, например, фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или вспомогательное вещество.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предлагаются новые методы скрининга проницаемости ГЭБ для химических веществ, поступающих в кровоток. Изобретение может в частности найти применение в высокопроизводительном скрининге агентов, разработанных в ходе программ поиска новых лекарственных препаратов, направленно действующих на разнообразные заболевания и нарушения, в частности, дегенеративные нарушения, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, заболевания двигательных нейронов, таупатию, кортико-базальную дегенерацию; нервно-психиатрические нарушения, включая депрессию, или биполярные расстройства, шизофрению, тревожность и агрессию. Кроме того, изобретение может найти применение в программах поиска новых лекарственных препаратов, направленно воздействующих на периферические мишени, когда побочные эффекты на ЦНС являются неприемлемыми. Кроме того, данное изобретение может найти применение при скрининге агентов, разработанных в ходе программ поиска новых лекарственных препаратов, направленно действующих на нарушения питания, нарушения сна и т.д.

Данное изобретение касается применения насекомых, выбранных из следующих отрядов, но не ограничивается ими (таксономия приводится по: Djurens Värld, Ed B.Hanström; Förlagshuset Norden AB, Maölmö, 1964):

Отряд	Подотряд/семейство	Примечание
Dictyoptera	Blattodea	тараканы
	Mantodea
Orthoptera	Grylloidea	сверчки

	Acridoidea	саранча
Cheleutoptera		палочники
Lepidoptera		бабочки
Hymenoptera	Formicoidea	муравьи
	Vespoidea	осы
	Apoidea	пчелиные
	Bombinae	шмели
	Apinae	настоящие пчелы
Odonata		стрекозы
Diptera	Nematocera	комары
	Brachycera	мухи, например, дрозофилы

В частности изобретение касается видов насекомых, выбранных из Blattodea, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera и Lepidoptera, и в особенности Acridoidea (Locusta migratoria и Schistocera gregaria).

Изобретение также будет касаться следующих отрядов, включающих виды насекомых, подходящих способу скрининга:

Отряд	Подотряд/семейство	Примечание
Ephemerida		поденки
Plecoptera
Dermoptera	Forficuloidea	уховертки
Homoptera	Cicadinea	цикады
	Aphidine	тля
Heteroptera		клопы
Coleoptera		жуки
Trichoptera		ручейники

В данном изобретении предпочтительно применяются крупные насекомые, например, саранча перелетная, Locusta migratoria, и саранча пустынная, Schistocera gregaria или таракан, которых возможно кормить и которым можно делать инъекции лекарственных препаратов, а затем брать образцы гемолимфы и проводить препарирование тканей мозга для анализа. Саранчу применяли для разработки моделей скрининга для определения проницаемости ГЭБ для различных терапевтических препаратов и сравнения этой модели с существующими в литературе данными, полученными в обыкновенных исследованиях in vivo на позвоночных.

Поиск новых лекарственных препаратов представляет собой длительный и дорогостоящий процесс, требующий большого количества химических и биологических ресурсов. В данном изобретении определенных насекомых применяют в качестве модельной системы для усовершенствования процесса отбора соединений и сокращения затрат на этапе разработки лекарств. В ходе экспериментов неожиданно было обнаружено, что модели на насекомых по данному изобретению позволяют лучше обосновать выбор соединений для исследований на позвоночных по сравнению с существующими моделями in vitro.

Таким образом, в данном изобретении особое внимание уделяется моделям на насекомых, предназначенным для того, чтобы отражать проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) у позвоночных. Как указано выше, исследование проницаемости ГЭБ чрезвычайно важно в поиске новых лекарственных препаратов; эффективные препараты для ЦНС должны проникать через ГЭБ, тогда как проницаемость ГЭБ для соединений, действующих на периферии, может вызывать нежелательные побочные эффекты.

В соответствии с предпочтительным воплощением данного изобретения саранчу перелетную, Locusta migratoria, и/или саранчу пустынную, Schistocera gregaria, применяют поскольку это легко культивируемые и относительно крупные насекомые (40-60 мм в длину, вес - приблизительно 2 г, объем гемолимфы - приблизительно 300 мкл, вес мозга - приблизительно 2 мг).

Изобретение детально описано в следующих разделах, тем не менее краткое предварительное описание одного из иллюстрирующих его воплощений поможет читателю понять суть изобретения. Однако это предварительное описание конкретного воплощения не должно рассматриваться как ограничивающее рамки изобретения.

Введение исследуемого вещества насекомым по данному изобретению при скрининге может быть таким, как изложено ниже, в соответствии с предпочтительным воплощением данного изобретения.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В предпочтительном воплощении данного изобретения насекомые выбраны из отряда Acridoidea и, в частности, применяются Locusta migratoria и Schistocera gregaria. Насекомые могут быть получены у местных поставщиков или выращены собственными силами, с содержанием и кормлением согласно Goldsworthy et al. (2003). Исследуемые соединения вводят в гемолимфу как описано Goldworthy et al. (2003) или вводят орально с пищей или с помощью зонда. Для количественного определения концентрации в мозге лекарственного препарата мозг препарируют согласно Mokri-Moayyed et al. (2008), промывают, быстро замораживают и хранят до проведения анализа. Перед анализом мозг гомогенизируют/перемешивают на вортексе и центрифугируют. Концентрацию препарата в надосадочной жидкости определяют с помощью ВЭЖХ, жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC/MSMS) или другими соответствующими способами. Влияние лечения лекарственными препаратами может быть документировано путем регистрации фармакологического влияния на поведение или путем регистрации сигналов нервных волокон центральной нервной системы.

Пример А

20 мкл раствора миансерина с концентрацией 9,8 мг/мл вводили 6 особям саранчи Locusta migratoria (самцам). Через 5 мин мозг препарировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) согласно Mokri-Moayyed et al. (2008). Три образца мозга помещали в отдельные пробирки и добавляли 100 мкл дистиллированной Н₂O и 80 мкл хлорной кислоты (РСА). Пробирки помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 27 нг/мл.

Пример В

20 мкл раствора миансерина с концентрацией 9,8 мг/мл вводили 3 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 15 мин мозг препарировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) согласно Mokri-Moayyed et al. (2008). Три образца мозга помещали в пробирку и добавляли 100 мкл дистиллированной Н₂ О и 80 мкл хлорной кислоты (РСА). Пробирку помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образец, содержащий измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новую пробирку и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли концентрацию миансерина, которая составила 73 нг/мл.

Пример С

20 мкл раствора миансерина с концентрацией 9,8 мг/мл вводили 6 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 5 мин мозг препарировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) согласно Mokri-Moayyed et al. (2008). Мозг промывали однократно в PBS. Три образца мозга помещали в отдельные пробирки и добавляли 100 мкл дистиллированной Н ₂O и 80 мкл хлорной кислоты (РСА). Пробирки помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 10 нг/мл.

Пример D

20 мкл раствора миансерина с концентрацией 9,8 мг/мл вводили 3 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 15 мин мозг препарировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) согласно Mokri-Moayyed et al. (2008). Мозг промывали однократно в PBS. Три образца мозга помещали в пробирку и добавляли 100 мкл дистиллированной Н₂ O и 80 мкл хлорной кислоты (РСА). Пробирку помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образец, содержащий измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новую пробирку и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли концентрацию миансерина, которая составила 97 нг/мл.

Пример Е

20 мкл раствора миансерина с концентрацией 9,8 мг/мл вводили 6 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 5 мин мозг препарировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) согласно Mokri-Moayyed et al. (2008). Мозг промывали двукратно в PBS. Три образца мозга помещали в отдельные пробирки и добавляли 100 мкл дистиллированной Н ₂O и 80 мкл хлорной кислоты (РСА). Пробирки помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 32 нг/мл.

Исследования в Примерах A-G показывают, что наблюдается повышение концентрации миансерина в мозге с увеличением времени от 5 до 15 минут, что объясняется более длительным временем воздействия (c.f. Примеры G-I). Кроме того, можно сделать вывод, что промывание мозга не приводит к какому-либо существенному снижению концентрации в мозге.

Пример F

20 мкл раствора миансерина с концентрацией 9,8 мг/мл вводили 9 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 5 минут выполняли разрез по фронтальной части головы саранчи, содержащей большинство фронтальных органов, включая антенны, фасеточные глаза, мозг и все нервные соединения между мозгом и антеннами и глазами. Затем мозг препарировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем синий Эванса.

Удаляли мозговые оболочки и три образца мозга помещали в отдельные пробирки и добавляли 100 мкл дистиллированной Н₂O и 80 мкл хлорной кислоты (РСА). Пробирки помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 9 нг/мл.

Пример F показывает, что миансерин проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) саранчи и это отражает проницаемость ГЭБ у позвоночных. По данным Примеров A-F можно сделать вывод, что некоторая часть соединения связывается с мозговыми оболочками. Таким образом, измеренная в мозге концентрация должна быть скорректирована с учетом этого вклада перед тем как будет сделано заключение о проницаемости ГЭБ. В альтернативном случае мозговая оболочка может быть удалена и концентрация в мозге в этом случае будет прямым показателем проницаемости ГЭБ.

Пример G

40 мкл раствора миансерина с концентрацией 8,8 мг/мл в 5% ДМСО вводили 18 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 5 мин у каждой особи саранчи брали 20 мкл гемолимфы. Выполняли разрез по фронтальной части головы саранчи, содержащей большинство фронтальных органов, включая антенны, фасеточные глаза, мозг и все нервные соединения между мозгом и антеннами и глазами. Затем мозг препарировали в солевом растворе, содержащем синий Эванса.

2 образца гемолимфы помещали в пробирку, содержащую 60 мкл дистиллированной H₂O и 200 мкл ацетонитрила. Каждый образец центрифугировали в течение 5 минут (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 38 мкг/мл.

Каждый образец мозга промывали в солевом растворе и помещали в пробирку, содержащую 100 мкл дистиллированной H₂ O. Удаляли мозговые оболочки и 6 образцов мозга помещали в отдельные пробирки и добавляли 200 мкл ацетонитрила. Пробирки помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000 при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 152 нг/мл.

Пример Н

40 мкл раствора миансерина с концентрацией 8,8 мг/мл в 5% ДМСО вводили 18 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 15 мин у каждой особи саранчи брали 20 мкл гемолимфы. Выполняли разрез по фронтальной части головы саранчи, содержащей большинство фронтальных органов, включая антенны, фасеточные глаза, мозг и все нервные соединения между мозгом и антеннами и глазами. Затем мозг препарировали в солевом растворе, содержащем синий Эванса.

2 образца гемолимфы помещали в пробирку, содержащую 60 мкл дистиллированной H₂O и 200 мкл ацетонитрила. Каждый образец центрифугировали в течение 5 минут (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 17 мкг/мл.

Каждый образец мозга промывали в солевом растворе и помещали в пробирку, содержащую 100 мкл дистиллированной H₂O. Удаляли мозговые оболочки и 6 образцов мозга помещали в отдельные пробирки и добавляли 200 мкл ацетонитрила. Пробирки помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 305 нг/мл.

Пример I

40 мкл раствора миансерина с концентрацией 8,8 мг/мл в 5% ДМСО вводили 18 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 45 мин у каждой особи саранчи брали 20 мкл гемолимфы. Выполняли разрез по фронтальной части головы саранчи, содержащей большинство фронтальных органов, включая антенны, фасеточные глаза, мозг и все нервные соединения между мозгом и антеннами и глазами. Затем мозг препарировали в солевом растворе, содержащем синий Эванса.

2 образца гемолимфы помещали в пробирку, содержащую 60 мкл дистиллированной H₂O и 200 мкл ацетонитрила. Каждый образец центрифугировали в течение 5 минут (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 13 мкг/мл.

Каждый образец мозга промывали в солевом растворе и помещали в пробирку, содержащую 100 мкл дистиллированной H₂ O. Удаляли мозговые оболочки и 6 образцов мозга помещали в отдельные пробирки и добавляли 200 мкл ацетонитрила. Пробирки помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию миансерина, которая составила 393 нг/мл.

На основании Примеров G-I можно сделать вывод, что концентрация миансерина в гемолимфе снижается со временем, тогда как концентрация в мозге возрастает с увеличением времени от 5 до 15 минут и выравнивается через 15-45 минут. Это отражает ситуацию у позвоночных, когда более длительная экспозиция мозга повышает уровень вещества в мозге до определенного предела. Кроме того, клиренс соединения в мозге позвоночного медленнее, чем в жидкостях организма, т.е. то же самое наблюдается в Примерах G-I.

Пример J

20 мкл раствора серотонина с концентрацией 630 мкг/мл вводили 6 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 5 минут у каждой особи саранчи брали 20 мкл гемолимфы. Выполняли разрез по фронтальной части головы саранчи, содержащей большинство фронтальных органов, включая антенны, фасеточные глаза, мозг и все нервные соединения между мозгом и антеннами и глазами и препарировали мозг в солевом растворе. Каждый образец гемолимфы помещали в пробирку, содержащую 80 мкл дистиллированной Н₂O и 200 мкл ацетонитрила. Каждый образец центрифугировали в течение 5 минут (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию серотонина, которая составила 4,7 мкг/мл.

Каждый образец мозга промывали в солевом растворе и помещали в пробирку, содержащую 100 мкл дистиллированной H₂O. Три образца мозга помещали в отдельные пробирки и добавляли 200 мкл ацетонитрила. Пробирки помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000 при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию серотонина, которая составила 86,5 нг/мл.

Пример К

Образцы мозга 3 особей саранчи, Locusta migratoria (самцов) были использованы для измерения уровня эндогенного серотонина в мозге. Выполняли разрез по фронтальной части головы саранчи, содержащей большинство фронтальных органов, включая антенны, фасеточные глаза, мозг и все нервные соединения между мозгом и антеннами и глазами и препарировали мозг в солевом растворе. Каждый образец мозга промывали в солевом растворе и помещали в пробирку, содержащую 100 мкл дистиллированной H₂ O. Три образца мозга помещали в одну пробирку и добавляли 200 мкл ацетонитрила. Пробирку помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новую пробирку и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли концентрацию серотонина, которая составила 20 нг/мл.

Примеры A-F демонстрируют, что измеренная концентрация миансерина повышалась в 3 раза, когда при измерении концентрации мозг имел мозговую оболочку. Логично предположить, что серотонин связанный с мозговыми оболочками, вносит такой же вклад, как и в исследованиях с миансерином. Таким образом, введение поправочного коэффициента на основании экспериментов с миансерином предполагает, что реальная измеренная концентрация серотонина в мозге в Примере J близка к эндогенному уровню серотонина, измеренному в Примере К.

На основании Примеров J и К можно сделать заключение, что серотонин проникает через ГЭБ саранчи только в очень незначительной степени, если проникает вообще. Очень низкая проницаемость ГЭБ для серотонина также наблюдается у позвоночных.

Пример L

20 мкл раствора буспирона с концентрацией 8,4 мг/мл в 5% ДМСО вводили 6 особям саранчи, Locusta migratoria (самцам). Через 5 минут у каждой особи саранчи брали 20 мкл гемолимфы. Выполняли разрез по фронтальной части головы саранчи, содержащей большинство фронтальных органов, включая антенны, фасеточные глаза, мозг и все нервные соединения между мозгом и антеннами и глазами и препарировали мозг в солевом растворе.

Каждый образец гемолимфы помещали в пробирку, содержащую 80 мкл дистиллированной H₂O и 200 мкл ацетонитрила. Каждый образец центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию буспирона, которая составила 4,5 мкг/мл.

Каждый образец мозга промывали в солевом растворе и помещали в пробирку, содержащую 100 мкл дистиллированной H₂O. Три образца мозга помещали в отдельные пробирки и добавляли 200 мкл ацетонитрила. Пробирки помещали в соникатор и мозг измельчали посредством соникации приблизительно в течение 5 секунд. Образцы, содержащие измельченный мозг, центрифугировали в течение 5 мин (10000g при 4°С). 100 мкл надосадочной жидкости переносили в новые пробирки и при помощи хромато-масс-спектрометрии (LCMS) измеряли среднюю концентрацию буспирона, которая составила 20 нг/мл.

Из данного примера ясно следует, что буспирон проникает через ГЭБ саранчи, но его относительное содержание гораздо меньше, чем в случае миансерина. Эти результаты отражают проницаемость ГЭБ у позвоночных, у которых проницаемость ГЭБ для буспирона значительно ниже, чем соответствующая проницаемость для миансерина.

Ссылки

Banerjee and Baht (2007), Neuron-Glial Interactions in Blood-Brain Barrier Formation Annual Review of Neuroscience 30: 235-258.

Di, L. and Kerns, E.H. (2003). Profiling drug-like properties in discovery research. Current Opinion in Chemical Biology 7, 402-408.

Gaertner, L.S., Murray, C.L, Morris, C.E. (1998). Transepithelial transport of nicotine and vinblastine in isolated malpighian tubules of the tobacco hornworm (Manduca sexta) suggests a P-glycoprotein-like mechanism. The Journal of Experimental Biology 201, 2637-2645.

Garberg, P. et al. (2005). In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro 19, 299-334.

Goldsworthy, G et al. (2003) Adipokinetic hormone enhances nodule formation and phenoloxidase activation in adult locusts injected with bacterial lipopolysaccaride. J. Insect. Physiol., 49, 793-803.

Gullan, P.J and Cranston, P.S. (2000). The insects. An outline of entomology. Blackwell Science Ltd.

Marsh, J.L, and Thompson, L.M. (2004). Can flies help humans treat neurodegenerative diseases? Bioessays 26, 485-496.

Marsh, J.L. and Thompson, L.M. (2006). Drosophila in the Study of Neurodegenerative Disease. Neuron 52, 169-178.

Mokri-Moayyed, В et al., (2008). Development of a novel ex vivo insect model for studying virulence determinants of Escherichia coli K1. J. Medical Microbiol. 57, 106-110.Pardridge, W.M. (2002). Drug and gene targeting to the brain with molecular Trojan horses. Nature Reviews Drug Discovery 1, 131-139.

Ruiz-Garcia, A., Bermejo, M., Moss A., Casabo, V.G. (2007). Pharmacokinetics in drug discovery. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1-37.

Schinkel, A.H. (1999). P-Glycoprotein, a gatekeeper in the blood-brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews 36, 179-194.

Summerfield, S. et al. (2005). Improving the In Vitro Prediction of In Vivo CNS Penetration: Integrating Permeability, Pgp Efflux and Free Fractions in Blood and Brain. Journal of Pharmacology And Experimental Therapeutics.

Turksen, K. and Troy, T.-C. (2004). Barriers built on claudins. Journal of Cell Science 117, 2435-2447.

Xia, C.Q., Xiao, G., Liu, N., Pimprale, S., Fox, L., Patten, C.J., Crespi, C.L, Miwa, G., Gan, L.-S. (2006). Comparison of Species Differences of P-Glycoproteins in Beagle Dog, Rhesus Monkey, and Human Using ATPase Activity Assays. Molecular Pharmaceutics 3 (1), 78-86.