способ прогнозирования тяжести клинического течения острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области у детей

Формула изобретения

Способ прогнозирования риска развития тяжелого клинического течения острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области у детей, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование полиморфного локуса методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей рестрикцией, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфного локуса 252 A>G гена лимфотоксина (LTA), и при выявлении генотипа GG прогнозируют высокий риск развития тяжелого клинического течения острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к челюстно-лицевой хирургии, может быть использовано для прогнозирования тяжести клинического течения острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области у детей.

Острые гнойно-воспалительные заболевания челюстно-лицевой области (ГВЗ ЧЛО) у детей относятся к широко распространенной стоматологической патологии, отличаются большим разнообразием нозологических форм, вариабельностью клинического течения, трудностью прогнозирования исходов и развитием тяжелых, часто несовместимых с жизнью осложнений в виде медиастенитов, внутричерепной патологии и сепсиса. Это оказывает негативное влияние на качество жизни пациентов, а в случае развития осложнений может приводить к летальным исходам. Вместе с тем, эффективное прогнозирование тяжести клинического течения острых ГВЗ ЧЛО у детей позволит своевременно назначать больным адекватную терапию, что приведет к более легкому клиническому течению заболеваний, сокращению продолжительности пребывания больного в стационаре, снижению частоты развития рецидивов и тяжелых осложнений.

Существует много предложений по оценке состояния больного с острой инфекцией и прогнозу заболеваний на основании данных клинического, гематологического, биохимического, иммунологического обследования (М.И.Озимов, Н.К.Артюшенко, Н.Н.Бажанов, А.С.Галяпин, Ю.В.Казакова, В.А.Козлов, Е.В.Крешетов, Т.К.Супиев, Н.А.Лобан и многие другие). М.М.Соловьевым и О.П.Большаковым совместно с Т.М.Алеховой разработана методика прогнозирования течения острых гнойно-воспалительных заболеваний ЧЛО, основанная на учете локализации, распространенности инфекционно-воспалительного процесса и выраженности таких общих показателей реакции организма, как частота пульса, температура тела, количественного и качественного состава лейкоцитов периферической крови, скорости оседания эритроцитов. К факторам неблагоприятного прогноза относятся частота пульса выше 140 ударов в минуту, частота дыхания выше 40 в минуту, температура тела выше 41,5°С, количество лейкоцитов свыше 50 мкл/тыс, СОЭ более 50 мм/час, коэффициент нейтрофилы (%)/лимфоциты (%)/моноциты (%) более 6,0 (Соловьев М.М. и Большаков О.П. Абсцессы, флегмоны головы и шеи, Москва, 2001-230 с.). Однако наличие у больного таких изменений выявляется уже на поздних стадиях, в разгар заболевания, тогда как необходимо раннее прогнозирование и своевременное назначение адекватной терапии.

Известен способ прогнозирования развития периоститов и остеомиелитов на основе рентгенологического исследования с введением контрастного вещества (Акжигитов Г.Н., Галеев М.А., Сахаутдинов В.Г., Юдин Я.Б. «Остеомиелит». M., Медицина, 1986, 75 с.). Существенными недостатками этого метода является травматичность процедуры, требующей вколачивания специальной иглы в кость, что сопровождается повышением внутрикостного давления, а также длительное заживление костной раны и длительное сохранение периостальной реакции.

Известен способ ранней дифференциальной диагностики острого периостита и остеомиелита челюстей у детей (Останин В.Ф., Цветков В.Г., Симонов А.Г., 1997) с помощью ренттеноконтрастного исследования с применением безигольного инъектора. Недостатком метода является поздняя диагностика при наличии остеомиелитического процесса и секвестрация кости (Останин В.Ф., Цветков В.Г., Симонов А.Г. Патент РФ № 2098132 от 10.12.1997).

Большой интерес представляет изучение специфических маркеров воспаления - цитокинов, которые могут быть прогностически более значимыми в определении процессов, связанных с развитием острой воспалительной реакции.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования повышенного риска развития воспалительных заболеваний ЧЛО у детей, заключающийся в том, что осуществляют выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят анализ полиморфных вариантов генов IL8 и IL10 методом полимеразной цепной реакции, с выявлением ассоциации полиморфных вариантов генов про- и противовоспалительных цитокинов у детей и прогнозируют повышение риска развития воспалительных заболеваний ЧЛО у детей (Викторов С.В. и др. Полиморфизм генов цитокиновой сети у детей с воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области // Медицинский вестник Башкортостана. - 2010. - № 3. - С.72-75).

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования риска развития тяжелого клинического течения острых ГВЗ ЧЛО у детей.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования риска развития тяжелого клинического течения острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области у детей, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование полиморфного локуса методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей рестрикцией, согласно изобретению проводят генотипирование полиморфного локуса 252 A>G гена лимфотоксина (LTA), и при выявлении генотипа GG прогнозируют высокий риск развития тяжелого клинического течения острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату Добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до рН 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂ О; раствор хранят при -20°С.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) полиморфных локусов генов интерлейкинов. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия ПЦР-анализа полиморфного локуса лимфотоксина (LTA 252 A>G) приведены в работе Warzocha K. с соавт. (Warzocha K., Ribeiro Р., Bienvenu J. et al. Genetic polymorphisms in the tumor necrosis factor locus influence non-Hodgkin's lymphoma outcome // Blood. - 1998. - Vol.91. - P.3574-3581). Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого де-зоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6.7 mM MgCl₂ , 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°С, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°С - 45 секунд, 55°С - 45 секунд, 72°С - 45 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 7 минут.

Нуклеотидную замену G A в положении 252 гена LTA выявляют при помощи рестрикционного анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. эндонуклеазы рестрикции BspI9I, смесь выдерживают при 37°С в течение 10-12 часов в термостате. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl рН=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с рН=8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Генотипы типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции и соответствующего фрагмента на электрофорезе так, что при наличии фрагмента размером 368 пар нуклеотидов (пн) идентифируется аллель А и гомозиготный генотип АА, при наличии двух фрагментов размером 368 и 133 пн идентифицируется гетерозиготный генотип AG, при наличии фрагмента размером 133 пн идентифицируется гомозиготный по редкому аллелю генотип GG.

В качестве конкретных примеров обследовано 97 детей с острыми ГВЗ ЧЛО в возрасте от 1 года до 15 лет, находившихся на лечении в отделении челюстно-лицевой хирургии Республиканской детской клинической больницы г.Уфы. Диагноз с указанием конкретной нозологической формы ГВЗ ЧЛО устанавливался врачами отделения на основании данных клинического обследования пациентов, результатов лабораторных и инструментальных методов обследования. Из общей группы больных были выделены пациенты с тяжелым клиническим течением абсцессов (10 чел.), флегмон (13 чел.), периоститов (16 чел.), остеомиелитов (14 чел.) и лимфаденитов (44 чел.). Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфного локуса 252 A>G гена LTA у больных ГВЗ ЧЛО представлены в таблице.

Исследование полиморфного локуса -252A>G гена LTA выявило существенные различия в частотах генотипов у больных с острыми ГВЗ ЧЛО и контроле. Достоверно чаще в группе детей с острыми ГВЗ ЧЛО встречался генотип GG (9,47%) по сравнению с группой контроля, где его частота составила - 2,55% ( ²=4,74; р=0,030). Показатель отношения шансов (OR), указывающий на рисковую значимость данного полиморфного варианта, составил 3,54 (доверительный интервал 95%CI 1,22-10,26). На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации генотипа GG полиморфного локуса 252A>G гена LTA с развитием тяжелых клинических форм острых ГВЗ ЧЛО и возможности использования данного полиморфизма для прогнозирования тяжелого течения и развития остеомиелитов и лимфаденитов.

В доступной научно-медицинской и патентной литературе сведений об известности способа прогнозирования риска развития тяжелого клинического течения острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области у детей, заключающегося в том, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфного локуса 252 A>G гена лимфотоксина (LTA) методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей рестрикцией, и при выявлении генотипа GG прогнозируют высокий риск развития тяжелого клинического течения заболевания, не обнаружено. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Исследованиями авторов доказано, что выявление генотипа GG при генотипировании полиморфного локуса 252 A>G гена лимфотоксина (LTA) методом ПЦР, позволяет осуществить прогноз высокого риска развития тяжелого клинического течения острых гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области у детей на самых ранних стадиях заболевания при отсутствии у пациента яркой клинической симптоматики и иммунологических сдвигов. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Б-ой В., 10 лет, 1998 года рождения (г.Стерлитамак, Республика Башкортостан). Диагноз острый одонтогенный остеомиелит нижней челюсти слева от зуба 3.7 установлен 15.12.2010 г. Жалобы при поступлении на острую боль в нижней челюсти слева, отек на десне и в поднижнечелюстной области слева, ассиметрию лица. По характеру боль постоянная, острая, интенсивная, локализующаяся в нижней челюсти слева. Жалобы общего характера: слабость, недомогание, потеря аппетита, плохой сон, бессонница. Из анамнеза установлено, что около недели назад пациент почувствовал ноющую боль в области нижнего зуба слева. В поликлинику не обращался, лечился дома самостоятельно (применял ротовые ванночки с солью и содой), после чего боль ненадолго утихла. Однако через два дня у пациента появилась острая боль в нижней челюсти слева, повышение температуры тела до 38°С, появилась ассиметрия лица, ухудшилось общее состояние. С родителями обратился в поликлинику Республиканской детской клинической больницы г.Уфы, откуда был госпитализирован в отделение челюстно-лицевой хирургии.

При объективном исследовании было выявлено: общее состояние больного тяжелое, в сознании. Температура тела в подмышечной области 39,5°С, пульс 126 в минуту, частота дыхания 44 в минуту, артериальное давление 120/80 мм рт.ст. При пальпации околочелюстные мягкие ткани уплотнены, болезненны, кожа с подлежащими тканями спаяна, с трудом собирается в складку, цвет изменен от интенсивно-розового до ярко-красного, температура тканей повышена. При пальпации отмечается болезненность и увеличение подчелюстных лимфатических узлов слева. Обследование полости рта: открывание рта ограничено. В полости рта зуб 3.7 разрушен на 2/3, слизистая оболочка вокруг отечная, пальпация и перкуссия данного зуба болезненна. Переходная складка в области зубов 3.5, 3.6, 3.7 сглажена. Кровоизлияний, расчесов, рубцов, «сосудистых звездочек», ангиом нет. Слизистая оболочка альвеолярного отростка гиперемирована и отечна как со стороны преддверия полости рта, так и с язычной стороны, высыпаний нет. Десны отечны и гиперемированы, не кровоточивы, разрыхлены. Язык нормальной формы и величины, влажный, обложен, выраженность сосочков в пределах нормы. Трещин, прикусов, язвочек нет. Изо рта неприятный запах.

При лабораторном исследовании крови выявлен лейкоцитоз до 20,0-30,0-10⁹ /л и выше, нейтрофилез до 70-80%, уменьшение числа лимфоцитов до 10% и моноцитов до 2%, увеличение палочкоядерных форм до 16%, количество эозинофилов в норме (2%), что свидетельствовало о выраженной интоксикации, СОЭ - 43 мм/час. В моче обнаруживались следы белка и эритроциты (1-2 в поле зрения), указывая на развитие реактивного процесса в почках вследствие интоксикации.

На ОПТГ нижней челюсти слева обнаруживается - очаг деструкции костной ткани в области корней зуба 3.7 с четкими контурами, диаметром 1,0 см, каналы корней зуба 3.7 не запломбированы.

При молекулярно-генетическом исследовании у больного было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного локуса 252A>G гена LTA в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании полиморфного локуса 252A>G гена LTA у больного был выявлен генотип GG. Обнаружение данного генотипа позволило прогнозировать предрасположенность к развитию тяжелого клинического течения остеомиелита.

Действительно, несмотря на удаление причинного зуба, проводимую терапию (дренирование гнойного очага с последующей перевязкой, применение антибиотиков, витаминотерапия) состояние пациента оставалось средней тяжести. На протяжении последующих четырех дней температура тела продолжала оставаться повышенной до 38-38,5°С, разница уровней утренней и вечерней температуры тела составила 1°С и более, на фоне повышения температуры тела иногда наблюдалась рвота и расстройство функции желудочно-кишечного тракта, что свидетельствовало о раздражении ЦНС в результате высокой общей интоксикации организма. Общее количество пребывания больного в стационаре составило 12 дней.

Таким образом, на основании генотипирования полиморфного локуса 252A>G гена LTA и выявления у б-го В. генотипа GG дан прогноз о повышенном риске тяжелого клинического течения остеомиелита, что было подтверждено результатами клинического и лабораторного обследования пациента.

Пример 2. Пациент б-ая А., 8 лет, 2000 года рождения (г.Уфа, Республика Башкортостан). Диагноз острый одонтогенный периостит нижней челюсти справа от зуба 4.6 установлен 23.12.2010 г. Жалобы при поступлении на острую боль в нижней челюсти справа, отек на десне, незначительную ассиметрию лица. По характеру боль постоянная, острая, интенсивная, локализующаяся в нижней челюсти справа. Жалобы общего характера: слабость, недомогание, потеря аппетита, плохой сон, бессонница. Из анамнеза установлено, что 22.12.2010 г. у пациента появилась острая боль в нижней челюсти справа, повышение температуры тела до 37°С, также стала увеличиваться ассиметрия лица, ухудшение общего состояния. С родителями обратился в поликлинику Республиканской детской клинической больницы г.Уфы, откуда был госпитализирован в отделение челюстно-лицевой хирургии. Цель госпитализации - обследование и оперативное лечение.

При объективном исследовании выявлено: общее состояние больного средней тяжести, сознание ясное, ориентирован в пространстве и времени, положение пациента активное. Температура тела в подмышечной области 37,3°С, пульс 79 в минуту, ЧДД 16 в минуту, артериальное давление 110/70 мм рт.ст. При пальпации в глубине отечных тканей соответственно расположению поднадкостничного воспалительного очага определяется плотный и болезненный инфильтрат. Регионарные лимфатические узлы увеличены, болезненны. При обследовании полости рта выявлено затрудненное и болезненное открывание рта, возникающее вследствие воспалительной контрактуры жевательной и внутренней крыловидной мышц. В полости рта выявлена гиперемия и отечность слизистой оболочки переходной складки и прилежащих участков щеки в области зубов 4.5 и 4.6. Слизистая оболочка рта покрыта налетом, видны отпечатки наружных поверхностей коронок зубов. При исследовании зуба, послужившего источником инфекции, установлено, что его полость и корневые каналы заполнены гнилостным распадом. Коронка зуба 4.6 разрушена на 1/3.

При лабораторном исследовании общего анализа крови выявлен нейтрофилез за счет увеличения количества сегментоядерных (73%) и палочкоядерных (16%) лейкоцитов, содержание лимфоцитов и эозинофилов ниже нормы. СОЭ=35 мм/ч. В общем анализе мочи обнаружены следы белка.

На прицельной рентгенограмме зуба 4.6 каналы корней зуба не запломбированы. Отмечается расширение периодонтальной щели. В области дистального корня определяется очаг деструкции с четкими контурами размером 0,2×0,6 см.

При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного локуса 252A>G гена LTA в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК; 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании полиморфного локуса 252A>G гена LTA у больной А. выявлен генотип АА, что позволило сделать заключение об отсутствии риска развития тяжелого клинического течения заболевания.

После вскрытия гнойного очага, операции удаления причинного зуба и приема антибиотиков температура нормализовалась на 2-е сутки, выздоровление наступило на 5-е сутки.

Предлагаемый способ легко воспроизводим и при его использовании достигается указанный технический результат. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Таблица
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного локуса 252G>A гена LTA у детей с тяжелым течением острых гнойно-воспалительных заболеваний ЧЛО и индивидов контрольной группы
		Контрольная группа
Дети с ГВЗ ЧЛО	2	Р	OR	CI-95%
Генотипы/аллели
Абс.	Частота	Абс.	Частота
АА	53	55,79%	107	54,59%	0,01	0,939	1,05	0,65-1,71
AG	33	34,74%	84	42,85%	1,36	0,244	0,72	0,43-1,19
GG	9	9,47%*	5	2,55%	4,74	0,030	3,54	1,22-10,26
А	139	73,16%	317	75,84%	0,37	0,545	0,87	0,59-1,29
G	51	26,84%	101	24,16%	0,37	0,545	1,15	0,78-1,70
Примечание: * - различия между сравниваемыми группами статистически значимые при р<0,05; р - уровень статистической значимости.