способ получения слабоположительной контрольной сыворотки, содержащей ad и ay субтипы hbsag

Формула изобретения

1. Способ получения слабоположительной контрольной сыворотки, содержащей AD и AY субтипы HBsAg, включающий отбор донорских сывороток с помощью ИФА, титрование положительной сыворотки, содержащей AD и AY субтипы HBsAg в разводящем стабилизированном растворе, генотипирование, проведение теста термодеградации для установления сроков годности панели, отличающийся тем, что положительные контрольные сыворотки, содержащие AY и AD субтипы HBsAg, разводят до диапазона концентраций от 0,05 до 0,025 МЕ/мл и вязкости, равной вязкости нормальной сыворотки человека, а в качестве разводящего стабилизированного раствора используют отрицательную дефибринизированную и безлипидную сыворотку, не содержащую маркеры HBV инфекции, для выявления которой предназначена искомая тест-система.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для изготовления слабоположительной контрольной сыворотки используют высокоочищенные препараты субтипов AD и AY HBsAg.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что титруют препарат AD субтипа HBsAg до фоновой оптической плотности (ОП) и определяют коэффициент разведения до концентрации 0,05 МЕ/мл.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что титруют препарат AY субтипа HBsAg до фоновой оптической плотности (ОП) и определяют коэффициент разведения до концентрации 0,05 МЕ/мл.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что смешивают равные объемы AD субтипа HBsAg с концентрацией 0,05 МЕ/мл и AY субтипа HBsAg в концентрации 0,05 МЕ/мл и получают раствор с содержанием HBsAg AD субтипа в концентрации 0,025 МЕ/мл и HBsAg AY субтипа в концентрации 0,025 МЕ/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления контрольных образцов для тест-систем, используемых для выявления HBsAg.

Процесс получения стабильной референс-сыворотки важен для организации производства контрольных препаратов для различных диагностических систем. В клинической практике объем сыворотки, забираемой для анализов, невелик и не может служить основой производства диагностических тест-систем. Поэтому промышленное производство контрольных препаратов обусловлено заготовкой плазмы крови и переработкой ее в сыворотку.

Биологически активные компоненты, найденные в сыворотке: энзимы, гормоны, электролиты и биологически активные метаболиты широко используются при диагнозе болезней. Из них приготавливают референс-препараты для инструментальных автоматических колориметров, так как они содержат все или большинство компонентов, неизвестных для анализа.

Соответственно, диагноз будет поставлен правильно, если лечащий врач будет иметь информацию о содержании маркера относительно его содержания в физиологической норме.

В натуральной форме такие биологически активные компоненты, выделенные из нормального биоматрикса, обычно нестабильны и испытывают нежелательные изменения под воздействием тепла, энзимов или гидролиза. В прошлом несколько методов были разработаны для сохранения таких лабильных биологических продуктов.

Известен референс-препарат ОСО (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) для контроля диагностики гепатита В [1]. Известны попытки компании BBI (Boston, USA) создать референс-препараты с несколькими инфекционными маркерами [6].

Недостатком его является то, что он изготовлен на основе неизвестного субтипа HBsAg и не позволяет эффективно контролировать образцы крови, т.к. его активность не может быть отнесена к определенному субтипу или генотипу HBV. Кроме того, одним препаратом невозможно решать проблемы контроля качества выполнения анализов в клинических диагностических лабораториях.

Известен патент США № 4121905, МПК G01N 33/95, опубл. 24.10.1978 [3], относящийся к способу получения жидкого биологического состава, используемого в качестве сыворотки крови для диагностических исследований.

Основными недостатками этого способа следует считать потерю до 20% общего белка в процессе ультрацентрифугирования плазмы и значительное изменение состава сыворотки при введении от 20 до 50% этилен или бутилен гликоля. Способ приготовления включает перевод сыворотки в сухое состояние с помощью лиофилизации. Также недостатком способа является потеря до 25% сывороточного белка в процессе передела плазмы в сыворотку.

Известен другой способ (патент США № 4158544, МПК G01N 33/96, опубл. 19.06.1979 [4]) получения жидкого биологического состава, используемого в качестве сыворотки крови для диагностических исследований. В способе [4] потери белка снижены до 1% и процесс очистки конечного материала дополнен удалением липидов и триглицерида.

Процесс дополнительно включает кислотную обработку сыворотки путем понижения рН до 3-4.5 с целью инактивировать все эндогенные энзимы. После снижения активности эндогенных энзимов рН сыворотки устанавливают в диапазоне 6.5-8.5.

Основным недостатком способа является необходимость введения от 15 до 40% хотя бы одного алкил полиола для повышения стабильности референс-препарата.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ изготовления контрольной панели сывороток AY и AD субтипов HBsAg для контроля качества диагностики гепатита В [5, прототип], включающий отбор донорских сывороток, не содержащих специфические антитела к основным маркерам вирусных инфекций, изготовление разводящих растворов на основе отобранных сывороток, разведение препарата HBsAg в разводящем растворе, проведение теста термодеградации для установления сроков годности панели, отличающийся тем, что отбор разводящих сывороток проводят путем анализа донорских сывороток методами иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции на наличие ДНК вируса гепатита В, анти HBs антител, неспецифичного связывания HBsAg, причем в качестве разводящих сывороток выбирают сыворотки с отрицательным результатом в данных методах, титрование препаратов HBsAg осуществляют в разводящем стабилизированном растворе до требуемой концентрации HBsAg (0,1-2 МЕ/мл) AD и AY субтипов.

Однако контрольная панель, изготовленная способом по патенту РФ № 2267960, содержит образцы положительных сывороток с концентрацией HBsAg от 2 МЕ/мл до 0,1 МЕ/мл, плазменно очищенные или рекомбинантные, что не позволяет контролировать качество тест-систем, способных выявлять инфекцию HBV на более ранней стадии заболевания.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого способа изготовления контрольной слабоположительной (К+HBsAg) сыворотки с AY и AD субтипами HBsAg, позволяющей создавать и контролировать качество тест-систем, обеспечивающих чувствительность до 0,025 МЕ/мл с выявлением инфекции HBV на более ранней стадии заболевания.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе изготовления слабоположительной контрольной сыворотки, содержащей AD и AY субтипы HBsAg, включающем отбор донорских сывороток с помощью ИФА, титрование положительной сыворотки, содержащей AD и AY субтипы HBsAg в разводящем стабилизированном растворе, генотипирование, проведение теста термодеградации для установления сроков годности панели, согласно изобретению положительные контрольные сыворотки, содержащие AY и AD субтипы HBsAg, разводят до диапазона концентраций от 0,05 до 0,025 МЕ/мл и вязкости, равной вязкости нормальной сыворотки человека (НЧС), а в качестве разводящего стабилизированного раствора используют отрицательную дефибринизированную и безлипидную сыворотку, не содержащую маркеры HBV инфекции, для выявления которой предназначена искомая тест-система.

Для изготовления слабоположительной контрольной сыворотки используют высокоочищенные препараты субтипов AD и AY HBsAg (препарат HBsAg AD субтипа (GeneLabs Diagnostic, Singapore) и препарат HBsAg AY субтипа (НПК «Иммуноген», Н. Новгород).

Препарат AD субтипа HBsAg титруют до фоновой оптической плотности (ОП) и определяют коэффициент разведения до концентрации 0,05 МЕ/мл, а препарат AY субтипа HBsAg титруют до фонового ОН и определяют коэффициент разведения до концентрации 0,05 МЕ/мл. Далее смешивают равные объемы AD субтипа HBsAg с концентрацией 0,05 МЕ/мл и AY субтипа HBsAg в концентрации 0,05МЕ/мл и получают раствор с содержанием HBsAg AD субтипа в концентрации 0,025 МЕ/мл и HBsAg AY субтипа в концентрации 0,025 МЕ/мл.

Ниже приведено описание заявляемого способа.

Способ изготовления слабоположительной контрольной сыворотки, содержащей AD и AY субтипы HBsAg, осуществляют следующим образом.

Вследствие того что ИФА является эффективным, удобным и недорогим методом анализа HBs-антигена, метод ИФА широко распространен и был усовершенствован для детекции Hbs-антигена вплоть до концентрации 0,01 ME. Поэтому все этапы разведения нативной плазмы в референс-сыворотку контролируют с помощью ИФА, фиксируя количество специфического белка и его сохранение [2].

Технология такого разведения включает следующие этапы.

(a) Заготовка цитратной плазмы методом плазмафореза (в количестве 500 мл в 2 недели от 1-го донора) и

(b) введение 0,2% хлорида кальция и тщательное перемешивание для получения бесцитратной плазмы;

(c) добавление тромбина к бесцитратной плазме и тщательное перемешивание для получения плотного сгустка фибрина;

(d) выполнение от 1-го до 3-х циклов замораживания - оттаивания для уплотнения сгустка;

(e) удаление фибрина для получения сыворотки;

(j) добавление к полученной сыворотке стабилизатора (Пролин + ЭДТА), составляющего не более 2,5 вес.% и не влияющего на вязкость сыворотки [7].

Добавляют хлористого кальция в количестве, достаточном для замещения цитрата на хлорид, наиболее предпочтительно около 20 мг СaСl₂ на 100 мл плазмы. Добавление более 40 мг хлорида вызывает искажение результатов ИФА диагностики.

Тромбин превращает фибриноген в фибрин. Тромбин гидролизует 4 аргинил-глициновые связи в молекуле фибриногена. При этом отщепляются 4 пептида и образуется фибрин-мономер, который далее полимеризуется в сгусток фибрина), добавляют в бесцитратную плазму (лошадиный или бычий) в количестве 1-3 ед./мл сыворотки.

После добавления тромбина раствор стоит при комнатной температуре в течение 2-4 час для образования плотного сгустка.

В заключение рекомендуется выполнить процедуру удаления липидов и триглицеридов смешиванием полученной сыворотки с гидрофобным диоксидом кремния высокой дисперсности.

Полученный материал является контрольной отрицательной сывороткой (К-) и пригоден для изготовления контрольной положительной сыворотки (К+) в качестве растворителя.

Приготовление контрольной К-

Дефибринизированная и безлипидная сыворотка является кандидатом для изготовления контрольной К- в тест-системах для выявления маркеров вирусных инфекций. Соответственно, кандидат в К- не должен содержать тот маркер инфекции, для выявления которого предназначена искомая тест-система.

Сыворотка-кандидат, показавшая отрицательный результат при определении инфекционного маркера, может быть использована в качестве контрольной К- и в качестве разбавителя реактивной положительной сыворотки при изготовлении стандартных и контрольных препаратов HBsAg.

Приготовление контрольной К+

Для приготовления К+ естественно использовать отрицательную сыворотку для разведения нативной сыворотки инфицированного пациента до требуемого уровня содержания инфекционного маркера. При отборе кандидатов К+ HBsAg следует контролировать субтип вируса гепатита В и концентрацию HBsAg [5].

Изготовление слабоположительной контрольной сыворотки К+ HBsAg, содержащей AD и AY субтипы антигена в концентрации по 0,025 МЕ/мл

Порядок изготовления К+ HBsAg:

1. Титруют 2 International standard HBsAg субтипа Adw2, code 00/588 в ИФА тест-системе.

2. Титруют препарат AD (GeneLabs Diagnostic, Singapore) до фонового ОПф. Строят кривую титрования.

3. По кривой титрования AD препарата определяют коэффициент разведения препарата, фиксируя на кривой титрования значение ОП, соответствующего значению ОП стандарта ВОЗ 00/588 при концентрации 0,05 МЕ/мл.

4. Титруют ОСО ГИСК субтипа Ayw2, в ИФА тест-системе.

5. Титруют препарат AY (НПК Иммуноген, Н. Новгород) до фонового ОПф. Строят кривую титрования.

4. По кривой титрования AY препарата определяют коэффициент разведения препарата, фиксируя на кривой титрования значение ОП, соответствующего значению ОП ОСО ГИСК при концентрации 0,05 МЕ/мл.

5. Смешивают равные объемы AD(0,05) и AY (0,05) и получают раствор с содержанием HBsAg AD субтипа (0,025 ME) и HBsAg AY субтипа (0,025 ME).

6. Полученный раствор может служить в качестве слабоположительного контроля для HBsAg тест-систем.

7. При равной вероятности тест-системы выявлять AY и AD генотипы в ИФА результирующая ОП должна быть близка к ОП (0,05 ME). В случае низкой чувствительности тест-системы к одному из 2-х субтипов результирующая ОП будет значительно ниже значения ОП (0,05 ME).

ОП (0.025AD+0.025AY)=ОП (0,05 ME) или << OD (0,05 ME)

Пример детальной иллюстрации способа приготовления.

Пример изготовления слабоположительной К+ HBsAg

2 л плазмы здоровых доноров получают со станции переливания крови в гемаконах (150 мл) в замороженном состоянии. Хранят до использования в холодильнике при -35°С.

1. Достают гемакон из холодильника и размораживают в термостате при 37°С в течение 3-4 ч.

2. Вводят 2.0% раствор CaCl₂ с 0.1% мертиолятом с помощью стерильного шприца в каждый гемакон (10 мл на 100 мл плазмы). Гемаконы интенсивно трясут на шейкере 5-10 мин и помещают в термостат на 37°С на 1 час.

3. Для образования плотного сгустка фибрина гемаконы подвергают 3-м циклам замораживания-оттаивания.

4. После размораживания отделяют сыворотку от фибрина центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин). Пулируют сыворотку из всех гемаконов и вводят стабилизатор на основе пролина и ЭДТА.

5. Пул сывороток фильтруют через кассету фильтров: 1,2 мкм и 0,45 мкм.

Определяют среднее содержание общего белка - 56 г/л.

В процессе переработки плазмы в сыворотку потери белка не превышают 0,5%, которые осаждаются вместе с фибрином.

Пул сывороток объемом 2 л разливают по 0,5 мл в 400 2-мл флаконов, которые помещают в морозильник на -35°С для хранения перед использованием.

Выполняют серию ИФА для международного стандарта NIBSC и для препаратов HBsAg AD и AY субтипов.

1. Титруют 2 International standard HBsAg, code 00/588 (NIBSC) препарат ОСО ГИСК в тест-системах 0542 HBsAg- ИФА-БЕСТ и т/с ДС-ИФА HBsAg. Строят калибровочные кривые Ln OD=f(# step) для обоих субтипов. Титруют препарат AD до фона донорской сыворотки. Строят кривую титрования и на том же планшете титруют препарат AY до фона. Строят кривые титрования.

По результатам статобработки кривые титрования имеют очень высокие показатели линейности (R2>0,99) и равные в пределах экспериментальной погрешности коэффициенты наклона.

4. По кривой титрования выбирают разведение препарата АУ для уровня, равного ОП для стандарта ОСО в концентрации 0,05 МЕ. Коэффициент разведения k(AY)=320 раз.

5. Аналогично выбирают разведение препарата AD для ОСО в концентрации 0,05 МЕ. Коэффициент разведения к (AD)=32 раза.

6. Смешивают по 1-му мл разведенные препараты AD(0,05) и AY (0,05) и получают 2 мл раствора с содержанием HBsAg AD субтипа (0,025 ME) и HBsAg AY субтипа (0,025 ME).

Тестируют приготовленную слабоположительную К+ HBsAg в тестах ЗАО Вектор Бест и ООО «Диагностические системы» (табл.1).

Таблица 1
Результаты тестирования слабоположительной сыворотки
Тест-система	Дата	Серия	ОП (0,05 ME)	ОП (0,025 ME)	ОПкрит
т/с ДС -ИФА -	13.12.10	Сер. 19	0,311	0,15	0,118
HBsAg
т/с ДС -ИФА -	13.12.10	Сер. 19	0,268	0,15	0,118
HBsAg
0542 HBsAg-	16.06.2011	Сер. 18	0,443	0,22	0,08
ИФА-БЕСТ
0542 HBsAg-	25.11.2010	Сер. 15	0,433	0,27	0,06
ИФА-БЕСТ
0543 HBsAg-	13.04.2011	Сер. 23	0,420	0,231	0,07
ИФА-БЕСТ

ОП(VB)=1,14ОП(DS)+0,13

R2=1,00

Резюме. Обе тест-системы с равной вероятностью выявляют оба генотипа в ИФА, поэтому результирующие ОП=2 ОП(0,025 МЕ/мл) близки к величине ОП (0,05 МЕ/мл).

В случае низкой чувствительности тест-системы к одному из 2-х субтипов результирующая ОП (0,025 AY+0,025 AD) будет значительно ниже значения ОП (0,05 МЕ/мл). Испытания стабильности контрольной К+ HBsAg проводят методом термостатирования образцов разводящей К- контрольной сыворотки при 4°С, КТ и 37°С в течение до 4-х недель. Испытания стабильности на примере К- обусловлено тем, что при разведении образцов позитивной плазмы в 32 или 320 раз мы полностью замещаем исходный матрикс на матрикс К- HBsAg. В процессе ускоренной термодеградации К- на первом этапе инактивации возрастает значение ОП выше ОПкрит.

Результаты испытаний представлены в табл. 2. При испытаниях использована тест-система HBsAg-ИФА-БЕСТ-0542, сер# 18, ОПкр=0,08

Таблица 2
Данные термодеградации К- HBsAg в течение 4-х недель, 37°С
Образцы	ОП/Ком	ОП/Vector	Примечание
Исходный -20°С	0,027	0,033
1 нед КТ	0,154	0,045
1 нед 37°С	0,238	0,069
2 нед КТ	0,141	0,066
2 нед 37°С	0,190	0,065
3 нед КТ	0,163	0,082
3 нед 37°С	0,153	0,080
4 нед КТ	0,127	0,100
4 нед 37°С	0,068	0,076
Примечание. ОП/ком - Результаты ИФА для образцов К+ с коммерческим стабилизатором, ОП/Vector - Результаты ИФА для стабилизатора «Вектор».

Как следует из результатов таблицы 2, стабилизатор Вектор позволяет сохранить исходную специфичность контрольной сыворотки на уровне 95%-ной доверительной вероятности. В то время как коммерческий стабилизатор не сохраняет К- HBsAg даже 1 нед. при комнатной температуре.

Таким образом, с помощью теста термодеградации определяют срок годности панели - более 2-х лет при хранении при - 20°С [8]. Экономическая эффективность применения предлагаемого способа изготовления контрольных образцов К+ HBsAg заключается в том, что указанные препараты используются как прогностические маркеры качества диагностики гепатита В. Именно надежная диагностика инфицированных пациентов, и более ранняя медицинская помощь, и контролируемое по количеству HBsAg лечение составляют социально значимую и экономическую эффективность, обусловленную сокращением сроков лечения и сроков трудовой недееспособности людей. Кроме того, введение в практику серологии валидизированной контрольной слабоположительной сыворотки субтипов AD и AY с аттестованной концентрацией HBsAg составляют юридическую основу для разрешения конфликтов между производителями и пользователями HBsAg тест-систем.

Источники научно-технической и патентной информации

1. ОСО HBsAg Инструкция по применению, 1999 г. ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Москва, 1999, 3 с.

2. Fields H.A., David C.I., BrADley D, W. and MAYnard J.E. Experimental conditions affecting the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assya (ELISA) for detection of hepatitis В surface antigen (HBsAg) // Bulletin of the World Health Organization, 1983, v.61, 1, p.135-142.

3. United States Patent 4121905. Process for preparing biological compositions for use as reference controls in diagnostic analyses.

4. United States Patent 4158544. Process for preparing a biological composition for use as a reference control in diagnostic analysis.

5. Патент РФ № 2265028 «Способ изготовления контрольной панели сывороток AY и AD субтипов HBsAg для контроля качества диагностики гепатита В».

6. Информационный бюллетень фирмы Boston Biomedica Inc., 1994, p.12.

7. Патент РФ № 2011202 «Стабилизирующий состав для контрольных сывороток, положительных на антитела к вирусным и микробным антигенам».

8. Kirkwood, T.B.L. Принципы приготовления и утверждения международных и других стандартов и эталонных материалов биологических препаратов. Сер. техн. докл. № 37. ВОЗ, Женева, 1990. 14а // J. biol. Standardization. - 1984. - Vol.12. - P.207-224.