способ преобразования гранулированного крахмала в этанол

Формула изобретения

1. Способ получения этанола, включающий:

a) осуществление контакта суспензии, содержащей гранулированный крахмал, полученный из растительного материала, с альфа-амилазой при температуре ниже, чем температура желирования гранулированного крахмала для получения олигосахаридов и предоставление эндогенным растительным ферментам гидролиза крахмала возможности гидролизовать олигосахариды с получением сусла, содержащего более 20% глюкозы, где указанный контакт происходит при рН от 3,5 до 7,0 и в течение периода от 5 мин до 24 ч, и

b) ферментацию сусла в присутствии ферментирующего микроорганизма и гидролизующих крахмал ферментов при температуре от 10°С до 40°С в течение периода от 10 ч до 250 ч для получения этанола.

2. Способ по п.1, где альфа-амилаза является бактериальной альфа-амилазой.

3. Способ по п.2, где альфа-амилаза происходит из Bacillus stearothermophilus, Bacillus Iicheniformis или Bacillus amyloliquefaciens.

4. Способ по п.1, где стадию осуществления контакта проводят при температуре от 50°С до 70°С.

5. Способ по п.4, где температура от 60°С до 70°С.

6. Способ по п.1, где стадию осуществления контакта проводят при рН от 5,0 до 6,0.

7. Способ по п.1, где контакт осуществляют в течение промежутка времени от 15 мин до 12 ч.

8. Способ по п.1, где сусло содержит более чем 30% глюкозы после осуществления контакта на протяжении от 15 мин до 6 ч.

9. Способ по п.8, где сусло содержит более чем 40% глюкозы после осуществления контакта на протяжении от 15 мин до 6 ч.

10. Способ по п.1, дополнительно включающий осветление сусла перед стадией ферментации.

11. Способ по п.1, дополнительно включающий добавление дополнительных ферментов на стадии осуществления контакта.

12. Способ по п.11, где дополнительные ферменты выбраны из группы, состоящей из глюкоамилаз, фитаз, протеаз, целлюлаз, и/или гемицеллюлаз.

13. Способ по п.12, где дополнительный фермент является фитазой.

14. Способ по п.12, где дополнительный фермент является протеазой.

15. Способ по п.1, где суспензия содержит от 5 до 60% сухого вещества (DS) гранулированного крахмала.

16. Способ по п.15, где % DS гранулированного крахмала составляет от 20 до 40% DS.

17. Способ по п.1, дополнительно включающий осуществление контакта сусла с водным раствором, содержащим обратный поток для разведения % DS перед стадией ферментации.

18. Способ по п.1, где гранулированный крахмал получен из кукурузы, майло, ячменя, пшеницы, риса или их комбинаций.

19. Способ по п.18, где % глюкозы после 6 ч контакта суспензии, содержащей гранулированный крахмал, с альфа-амилазой составляет 30%.

20. Способ по п.18, где % глюкозы после 6 ч контакта суспензии, содержащей гранулированный крахмал, с альфа-амилазой составляет 40%.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам производства спирта (например, этанола) из гранулированного крахмала, включающим обработку содержащей гранулированный крахмал суспензии из растительного материала альфа-амилазой при температуре ниже температуры желирования гранулированного крахмала и последующую ферментацию с использованием ферментирующего микроорганизма.

Уровень техники

Коммерческая целесообразность производства этанола в качестве источника топлива из сельскохозяйственных зерновых культур вызывает неослабевающий интерес по всему миру по разнообразным причинам, которые включают продолжающуюся и увеличивающуюся зависимость от ограниченных запасов топлива и тот факт, что производство этанола является возобновляемым источником энергии.

Способы производства с использованием спиртового брожения, а, в частности, способы производства этанола, обычно характеризуются как процессы мокрого помола или процессы сухого помола. Обзор этих процессов приведен в Bothast et al. 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 67:19-25 и THE ALCOHOL TEXTBOOK, 3^rd Ed (K. A. Jacques et al. Eds) 1999 Nottingham University Press, UK.

Обычно процесс мокрого помола включает ряд стадий замачивания (вымачивания) для размягчения зерна злака, при котором удаляется растворимый крахмал с последующим получением зародыша, волокон (отрубей) и глютена (белка). Оставшийся крахмал далее подвергают высушиванию, обработке химическими препаратами и/или ферментами. Затем крахмал может быть использован при производстве спирта, зернового сиропа с высоким содержанием глюкозы или коммерческого крахмала высокой очистки.

Обычно сухой помол зерна включает несколько основных стадий, которые включают: перемалывание, тепловую обработку, разжижение, осахаривание, ферментацию и разделение жидкой и твердой фаз для производства спирта и других ко-продуктов. Как правило, цельное зерно, такое как зерно кукурузы, перемалывают до частиц мелкого размера, после чего смешивают с жидкостью в чане для суспензии. Суспензию подвергают высокотемпературной обработке в пароварочном аппарате вместе с разжижающими ферментами (например, альфа-амилазами) для солюбилизации и гидролиза крахмала в зерне до декстринов. Смесь охлаждают, после чего обрабатывают осахаривающими ферментами (например, глюкоамилазами) для получения ферментативной глюкозы. Затем сусло, содержащее глюкозу, подвергают ферментации в течение приблизительно от 24 до 120 часов в присутствии продуцирующих этанол микроорганизмов. Твердые вещества из сусла отделяют от жидкой фазы, после чего производится получение этанола и полезных побочных продуктов, таких как барда.

Были проведены улучшения описанного выше способа ферментации путем объединения стадии осахаривания и ферментации в процессе, одновременно имеющем отношение к осахариванию и ферментации или одновременно к осахариванию, размножению дрожжей и ферментации.

Эти улучшенные способы ферментации имеют преимущества перед описанной ранее ферментацией с использованием сухого помола или даже с использованием влажного помола, поскольку в ферментере не образуются значительные концентрации сахара, таким образом, не происходит подавление сахаром роста дрожжей. В дополнение к этому понижается рост бактерий в связи с недостатком легкодоступной глюкозы. Результатом применения процессов одновременного осахаривания и ферментации может являться увеличенная продукция этанола.

В последнее время были предложены способы ферментации, в которых отсутствует стадия термической обработки или в которых уменьшена необходимость обработки зерен злаков при высоких температурах. Эти способы ферментации, которые иногда упоминаются как способы без варки, варки при низкой температуре или теплой варки, включают перемалывание зерна злаков и соединение перемолотого зерна с жидкостью для образования суспензии, которая затем смешивается с одним или несколькими ферментами, гидролизующими гранулированный крахмал, и, возможно, дрожжами при температуре ниже температуры желирования гранулированного крахмала для получения этанола и других ко-продуктов (USP 4514496, WO 03/066826; WO 04/081193; WO 04/106533; WO 04/080923 и WO 05/069840).

Хотя упомянутые выше способы ферментации с использованием измельченной зерновой суспензии в сочетании с гидролизующими гранулированный крахмал ферментами имеют определенные улучшения по сравнению с известными ранее способами, в промышленности требуются дополнительные улучшения способа ферментации для преобразования гранулированного крахмала, приводящие к увеличению энергетической эффективности и высокому выходу конечного продукта. Целью настоящего изобретения является предложение улучшенного способа преобразования гранулированного крахмала в спирт (например, этанол) и другие конечные продукты.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения спирта (например, этанола) из гранулированного крахмала путем осуществления контакта гранулированного крахмала с альфа-амилазой и обеспечения подходящих условий для эндогенных растительных гидролитических ферментов, которые гидролизуют солюбилизированный крахмал для получения глюкозы. Затем глюкоза может быть использована в качестве исходного сырья для ферментации при производстве спирта.

В одном аспекте изобретение относится к способу получения глюкозы из субстрата, представляющего собой гранулированный крахмал, включающему:

a) осуществление контакта суспензии, содержащей гранулированный крахмал, полученный из растительного материала, с альфа-амилазой при температуре ниже чем температура желирования крахмала для гранулированного крахмала для получения олигосахаридов и предоставление возможности эндогенным гидролизующим ферментам гидролизовать олигосахариды, и

b) получение сусла, содержащего по меньшей мере 10% глюкозы.

В другом варианте осуществления в этом аспекте сусло ферментируют в присутствии ферментирующего микроорганизма и гидролизующих крахмал ферментов при температуре от 10°С до 40°С в течение от 10 часов до 250 часов для получения спирта, в частности этанола.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения этанола, включающему:

a) осуществление контакта суспензии, содержащей гранулированный крахмал с альфа-амилазой, способной солюбилизировать гранулированный крахмал, где указанный контакт происходит при pH от 3,5 до 7,0; и температуре ниже чем температура желирования крахмала для гранулированного крахмала; и в течение от 5 минут до 24 часов с получением сусла, содержащего более 20% глюкозы, и

b) ферментацию субстрата в присутствии ферментирующего микроорганизма и гидролизующего крахмал фермента при температуре от 10°С до 40°С в течение периода времени от 10 часов до 250 часов для получения этанола.

В других вариантах осуществления любого описанного выше аспекта способ включает выделение этанола. В других вариантах осуществления описанных аспектов способ может включать дополнительные стадии, не описанные здесь, которые могут быть выполнены до, во время или после перечисленных стадий.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой общую схематическую диаграмму, которая иллюстрирует вариант осуществления изобретения, в котором осуществляют контакт суспензии, включающей перемолотое зерно, содержащее гранулированный крахмал и имеющей DS от 20% до 40% контактирует с альфа-амилазой при температуре от 55°С до 70°С и pH от 4,0 до 6,0 в течение от 2 до 24 часов. Полученное сусло, содержащее глюкозу, передают в ферментер и ферментируют при pH от 3,0 до 5,0 при температуре от 25°С до 35°С в течение от 24 до 72 часов в присутствии дрожжей, питательных веществ, кислоты и ферментов, гидролизующих крахмал для производства спирта.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, все использованные здесь технические и научные термины имеют то же значение, что и обычно понимаемое специалистом с обычными знаниями в области техники, к которой относится это изобретение.

Хотя при практическом осуществлении и проверке настоящего изобретения могут быть использованы любые методы и материалы, сходные или эквивалентные тем, что описаны здесь, описаны предпочтительные методы и материалы.

Далее изобретение будет описано в деталях с помощью ссылок только на использование следующих определений и примеров. Все патенты и публикации, включая все последовательности, раскрытые в таких патентах и публикациях, упоминаемые здесь, кратко введены в виде ссылки.

Определения:

Термин «ферментация» относится к ферментативному и анаэробному расщеплению органических веществ микроорганизмами для получения более простых органических соединений. Хотя ферментация происходит при анаэробных условиях, не считается, что термин ограничен исключительно строгими анаэробными условиями, поскольку ферментация также происходит и в присутствии кислорода.

Использованный здесь термин «крахмал» относится к любому материалу, содержащемуся в комплексных полисахаридных углеводах растений, состоящему из амилозы и амилопектина с формулой (С₆H₁₀ O₅)_x, где x может быть любым числом.

Термин «гранулированный крахмал» относится к сырому (необработанному термически) крахмалу в его натуральной форме, находящейся в растительном материале (например, зернах и клубнях).

Использованный здесь термин «содержание сухого вещества (DS)» относится к общему содержанию твердого вещества в суспензии в % по сухому весу.

Термин «суспензия» относится к водной смеси, содержащей нерастворимые твердые вещества (например, гранулированный крахмал).

Термин «декстрины» относится к полимерам глюкозы с короткой цепью (например, от 2 до 10 звеньев).

Термин «олигосахариды» относится к любому соединению, имеющему от 2 до 10 моносахаридных единиц, соединенных гликозидными связями. Эти полимеры с короткой цепью или простые сахара включают декстрины.

Термин «растворимый крахмал» относится к крахмалу, который получается в результате гидролиза нерастворимого крахмала (например, гранулированного крахмала).

Термин «сусло» относится к смеси ферментируемого субстрата с жидкостью, используемой для производства ферментированного продукта, и используется в отношении любой стадии ферментации от начального смешивания ферментируемого субстрата с одним или более гидролизующих крахмал ферментов и ферментирующих организмов в течение всего способа ферментации.

Термины «осахаривающий фермент» и «гидролизующий крахмал фермент» относятся к любому ферменту, способному преобразовывать крахмал в моно- или олигосахариды (например, гексозы или пентозы).

Термины «фермент, гидролизующий гранулированный крахмал (GSH)» и «ферменты, имеющие гидролизующую гранулированный крахмал (GSH) активность» относятся к ферментам, которые способны гидролизовать крахмал в гранулированной форме.

Термин «гидролиз крахмала» относится к расщеплению гликозидных связей при добавлении молекул воды.

Термин «альфа-амилаза (например, класс E.G. 3.2.1.1)» относится к ферменту, который катализирует гидролиз альфа-1,4-гликозидных связей. Эти ферменты также описаны как вызывающие экзо- или эндогидролиз 1,4- -D-гликозидных связей в полисахаридах, содержащих связанные 1,4- связями субъединицы D-глюкозы.

Термин «желирование» означает растворение молекул крахмала при тепловой обработке с образованием вязкой суспензии.

Термин «температура желирования» относится к наиболее низкой температуре, при которой начинается желирование содержащегося в субстрате крахмала. Точная температура желирования зависит от конкретного крахмала и может варьировать в зависимости от различных факторов, таких как вид растения и условия окружающей среды и роста. Таким образом, обсуждаемый здесь диапазон температур желирования предполагается включающим эти изменения.

Термин «ниже температуры желирования» относится к температуре, более низкой, чем температура желирования.

Термин «глюкоамилаза» относится к классу ферментов амилоглюкозидаз (например, глюкоамилазе E.G.3.2.1.3, 1,4-альфа-D-глюкановой глюкогидролазе). Они являются экзоактивными ферментами, которые высвобождают глюкозильные остатки с невосстанавливающих концов молекул амилозы и амилопектина. Эти ферменты также гидролизуют альфа-1,6 и альфа-1,3 связи, хотя и с намного меньшей скоростью, чем альфа-1,4 связи.

Фраза «одновременное осахаривание и ферментация (SSF)» относится к процессу при производстве конечных продуктов, при котором ферментирующий организм, такой как этанолпродуцирующий микроорганизм, и по меньшей мере один фермент, такой как осахаривающий фермент, объединены на одной стадии способа в одном и том же сосуде.

Термин «осахаривание» относится к ферментативному преобразованию непосредственно не пригодного для использования полисахарида в моно- или олигосахариды для ферментативного преобразования в конечный продукт.

Термин «помол» относится к разрушению зерен зерновых культур на более мелкие частицы. В некоторых вариантах осуществления этот термин используется взаимозаменяемо с измельчением.

Термин «сухой помол» относится к помолу сухого цельного зерна, при котором части зерна, такие как зародыш или отруби, не были предварительно удалены.

Термин «разжижение» относится к стадии в преобразовании крахмала, на котором желированный крахмал гидролизуется с получением растворимых декстринов низкого молекулярного веса.

Термин «жидкая барда» относится к жидкости, получающейся в результате ферментации, содержащей растворенный материал и суспендированные мелкие частицы, которая отделена от твердой части, получающейся при ферментации. В процессах промышленной ферментации возвращенная в цикл разбавленная отфильтрованная барда часто упоминается как "обратный поток".

Термин «сосуд» включает, но не ограничен ими, танки, чаны, бутыли, фляги, мешки, биореакторы и т.п. В одном варианте осуществления термин относится к любому резервуару, пригодному для проведения процессов осахаривания и/или ферментации, охватываемых изобретением.

Термин «конечный продукт» относится к любому продукту, производному от источника углерода, который ферментативно преобразован из ферментируемого субстрата. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления конечный продукт является спиртом, таким как этанол.

Использованный здесь термин «ферментирующий организм» относится к любому микроорганизму или клетке, пригодной для использования при ферментации для прямого или опосредованного производства конечного продукта.

Использованный здесь термин «продуцент этанола» или «продуцирующий этанол микроорганизм» относится к ферментирующему микроорганизму, который способен продуцировать этанол из моно- и олигосахаридов.

Термин «производный» включает термины «происходящий от», «полученный» или «возможно, получаемый из», и «выделенный из» и использованный здесь в некоторых вариантах осуществления означает, что полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, производится из клетки, в которой эта нуклеотидная последовательность присутствует естественным образом или в которую эта нуклеотидная последовательность была вставлена.

Термин «гетерологичный» по отношению к белку или полинуклеотиду относится к белку или полинуклеотиду, который в естественных условиях не встречается в клетке-хозяине.

Термин «эндогенный» по отношению к белку или полинуклеотиду относится к белку или полинуклеотиду, который встречается в клетке-хозяине в естественных условиях.

Фраза «эндогенные растительные гидролитические ферменты, способные гидролизовать растворимый крахмал» относится к гидролитическим ферментам, которые экспрессируются и продуцируются в растения и могут быть получены путем экспрессии эндогенных или гетерологичных генов. В некоторых вариантах осуществления эндогенные ферменты экспрессируются в растения в естественных условиях.

Фраза «экзогенные» ферменты относится к ферментам, которые не продуцируются растением или растительной клеткой.

Термин «ферментативное преобразование» в общем случае относится к модификации субстрата под действием фермента. Использованный здесь этот термин также относится к модификации ферментируемого субстрата, такого как содержащий гранулированный крахмал, субстрат в результате действия фермента.

Термины «получен», «изолирован» и «выделен», как они использованы здесь, относятся к соединению, белку, клетке, нуклеиновой кислоте или аминокислоте, которая отделена по меньшей мере от одного компонента, с которым она связана в природе.

Использованный здесь термин «единица фермента» относится к количеству фермента, которое продуцирует 1 микромоль продукта в минуту при определенных условиях исследования. Например, в одном варианте осуществления термин «единица активности глюкоамилазы» (ед. GA) определен как количество фермента, необходимое для продукции 1 г глюкозы в час из субстрата в виде растворимого крахмала (4% DS) при 60°С и pH 4.2.

Термин «выход» относится к количеству конечного продукта, продуцируемого с применением способов в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления термин относится к объему конечного продукта, в других вариантах осуществления термин относится к концентрации конечного продукта.

Термин «DE» или «декстрозный эквивалент» является промышленным стандартом измерения общей концентрации восстанавливающих сахаров, подсчитанных как D-глюкоза по отношению к сухому весу. Негидролизованный гранулированный крахмал имеет DE, составляющий, практически равный 0, а D-глюкоза имеет DE, равный 100. Наглядный метод определения DE суспензии или раствора описан в методе Schroorl's (анализ титрованием Фехлинга (Fehling)).

Использованный здесь термин «включающий» и родственные ему слова используются в смысле «включающий», таким образом, являясь эквивалентным термину «содержащий» и соответствующим родственным ему словам.

Если контекст явно не требует иного, термины в единственном числе могут подразумевать множественное число.

Числовые значения включают числа, определяющие границы.

Предложенные здесь заголовки не являются ограничивающими различные аспекты или варианты осуществления изобретения, которые могут быть сделаны со ссылкой на описание в целом.

Варианты осуществления изобретения

(A) Сырье

Гранулированный крахмал

Гранулированный крахмал может быть получен из растительного материала, включая, но не ограничиваясь ими, пшеницу, кукурузу, рожь, сорго (майло), рис, просо, ячмень, тритикале, маниоку (тапиоку), картофель, сладкий картофель, сахарную свеклу, сахарный тростник и бобовые, такие как соевые бобы и горох. Предпочтительный растительный материал включает кукурузу, ячмень, пшеницу, рис, майло и их комбинации. Особенно предпочтительный растительный материал получается из кукурузы (Zea mays). Растительный материал может включать гибридные разновидности и генетически измененные разновидности (например, трансгенную кукурузу, ячмень или соевые бобы, содержащие гетерологичные гены). В качестве источника гранулированного крахмала может быть использована любая часть растения, включая, но не ограничиваясь ими, такие части растений, как листья, стебли, скорлупа, шелуха, клубни, стержни початков, зерна и т.п. В некоторых вариантах осуществления может быть использовано практически все растение, например, может быть использована целая кукурузная солома. В одном варианте осуществления в качестве источника гранулированного крахмала может быть использовано цельное зерно. Предпочтительные цельные зерна включают кукурузу, пшеницу, рожь, ячмень, сорго и их сочетания. В других вариантах осуществления гранулированный крахмал может быть получен из разделенного на части зерна зерновых культур, включая волокна, эндосперм и/или компоненты зародыша. Способы фракционирования растительного материала, такого как кукуруза или пшеница, известны в области техники. В некоторых вариантах осуществления растительный материал, полученный из различных источников, может быть смешан вместе для получения гранулированного крахмала, используемого в процессах в соответствии с изобретением (например, кукуруза и майло или кукуруза и ячмень).

В некоторых вариантах осуществления растительный материал, содержащий гранулированный крахмал, может быть подготовлен такими способами, как измельчение. В частности, способы измельчения цельных зерен зерновых культур хорошо известны и включают использование молотковых дробилок и вальцовых мельниц.

Альфа-амилазы

Альфа-амилаза может быть одиночным ферментом, гибридным ферментом или смесью альфа-амилаз. В некоторых вариантах осуществления, входящих в область изобретения, альфа-амилаза является микробным ферментом, имеющим номер E.C. E.C. 3.2.1.1-3, а именно E.C. 3.2.1.1. В представленном процессе могут быть использованы любые подходящие альфа-амилазы. В некоторых вариантах осуществления альфа-амилаза получена из бактериального штамма, в других вариантах осуществления альфа-амилаза получена из грибковых штаммов. В других вариантах осуществления предпочтительной альфа-амилазой является бактериальная альфа-амилаза. В других вариантах осуществления альфа-амилаза является кислотоустойчивой альфа-амилазой. Подходящие альфа-амилазы могут быть природного происхождения или рекомбинантными (гибридными и вариантными) и мутантными альфа-амилазами (WO 99/19467 и WO 97/41213). В особо предпочтительных вариантах осуществления альфа-амилаза происходит из видов Bacillus. Предпочтительные виды Bacillus включают B. subtilis, B. stearothermophilus, B. lentus, B. licheniformis, B. coagulans, и B. amyloliquefaciens (USP 5093257; USP 5763385; USP 5824532; USP 595739; USP 6008026, USP 6361809; USP 6867031; WO 96/23874; WO 96/39528 и WO.05/001064).

Особо предпочтительные альфа-амилазы происходят из Bacillus strains B. stearothermophilus, B. amyloliquefaciens и B. licheniformis ((USP 6187576; USP 6093562; USP 5958739; US 2006/0014265 и WO 99/19467).

Наиболее предпочтительными альфа-амилазами являются альфа-амилазы, происходящие от B. stearothermophilus и B. Licheniformis, включая как гибридные и вариантные альфа-амилазы, так и альфа-амилазы дикого типа. См. Suzuki et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:18933-18938 и US 2006/0014265, в частности, SEQ ID № № : 3, 4 и 16. Также упоминаются штаммы, имеющие номера в американской коллекции типовых культур (ATCC) - ATCC 39709; ATCC 11945; ATCC 6598; ATCC 6634; ATCC 8480; ATCC 9945A и NCIB 8059.

В дополнение к бактериальным альфа-амилазам для применения в способах в соответствии с настоящим изобретением рассматривают грибковые альфа-амилазы. Подходящие грибковые альфа-амилазы происходят из штаммов нитевидных грибов, таких как Aspergillus, таких как A. oryzae и A. niger (например, FUNGAMYL и CLARASE L), и Trichoderma, Rhizopus, Mucor и Penicillium.

Доступные коммерчески альфа-амилазы, рассматриваемые для применения в способах в соответствии с изобретением, включают: SPEZYME AA; SPEZYME FRED; SPEZYME ETHYL; GZYME G997; CLARASE L (Genencor International Inc.); TERMAMYL 120-L, LC, SC и SUPRA (Novozymes Biotech); LIQUOZYME X и SAN SUPER (Novozymes A/S) и ULTRATHIN (/Valley Research).

Растительные ферменты

Растения содержат разлагающие крахмал ферменты естественного происхождения, такие как альфа-амилазы(EC 3.1.1.1); бета-амилазы (EC 3.1.1.2), амилогликозилазы (глюкоамилазы) (EC 3.1.1.3) и фосфорилазы крахмала (EC 2.4.1.1). В дополнение к этому растения могут быть генетически модифицированы, чтобы включать гетерологичные гены, кодирующие ферменты деградации крахмала, такие как амилазы, глюкоамилазу и другие (WO 03/018766 and WO 05/096804). Эндогенные растительные ферменты деградации крахмала, натурального происхождения или экспрессируемые с введенного полинуклеотида, при обработке высокой температурой, такой как температура паровой варки или даже температура желирования гранулированного крахмала, инактивируются. Однако считается, что при температурах, используемых в способах по изобретению, эндогенные ферменты, разлагающие крахмал, не инактивируются и участвуют в гидролизе гранулированного крахмала. Не углубляясь в теоретические подробности, авторы настоящего изобретения считают, что альфа-амилаза, внесенная на стадии осуществления контакта, модифицирует структуру гранулированного крахмала растительного материала, делая возможным продуцирование олигосахаридов, включая декстрины. Далее олигосахариды разлагаются при температурах, при которых протекает стадия контактирования (например, от 45°С до 70°С) под действием ферментов, разлагающих крахмал из растений. Растительные ферменты, разлагающие крахмал, действуют на частично гидролизованный крахмал для получения глюкозы. Хотя на стадии осуществления контакта могут быть добавлены экзогенные источники глюкоамилаз, для получения глюкозы, которую можно использовать в качестве сырья для спиртового брожения, не требуется добавления экзогенной глюкоамилазы. Таким образом, в одном варианте осуществления стадия осуществления контакта в соответствии с изобретением не включает добавления глюкоамилаз, происходящих из микробных источников. В другом варианте осуществления стадию осуществления контакта выполняют без добавления экзогенных ферментов, в особенности экзогенной глюкоамилазы или других гидролизующих олигосахариды ферментов. В других вариантах осуществления олигосахариды подвергают гидролизу только встречающимися в природе эндогенными растительными ферментами, специфическими для рода растения или, альтернативно, специфическими для рода и вида растения. Тем не менее, добавление экзогенных глюкоамилаз и/или других ферментов, таких как фталазы и протеазы, может увеличить продукцию растворимого гранулированного крахмала.

Ферментирующие организмы

Примерами ферментирующих микроорганизмов являются этанологенные микроорганизмы или этанолпродуцирующие микроорганизмы, такие как этанологенные бактерии, которые экспрессируют алкогольдегидрогеназу и которые могут быть получены из Zymomonas moblis (см., например, USP 5000000; USP 5028539, USP 5424202; USP 5514583 и USP 5554520). В других вариантах осуществления этанологенные микроорганизмы экспрессируют ксилозоредуктазу и ксилитдегидрогеназу, ферменты, которые превращают ксилозу в ксилулозу. В других вариантах осуществления для преобразования ксилозы в ксилулозу служит ксилозоизомераза. В особо предпочтительных вариантах осуществления используют микроорганизм, способный ферментировать до этанола как пентозы, так и гексозы. Например, в некоторых вариантах осуществления микроорганизм может быть естественным или не генетически модифицированным микроорганизмом, в других вариантах осуществления микроорганизм может быть рекомбинантным микроорганизмом. Например, в некоторых вариантах осуществления предпочтительные ферментирующие микроорганизмы включают бактериальные штаммы из родов Bacillus, Lactobacillus, E. coli, Erwinia, Pantoea (например, P. citrea) и Klebsiella (например, K. oxytoca) (см., например, USP 5028539, USP 5424202 и WO 95/13362).

В других предпочтительных вариантах осуществления этанолпродуцирующим микроорганизмом является грибковый микроорганизм, такой как дрожжи, а именно Saccharomyces, такой как штамм S. cerevisiae (USP 4,316,956). Разновидности S. cerevisiae доступны коммерчески и включают, но не ограничены FALI (Fleischmann's Yeast), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR (Lesaffre) и алкогольными дрожжами Angel (Angel Yeast Company, China).

Вспомогательные ферменты

Хотя в одном варианте осуществления предполагается, что дополнительные гидролизующие крахмал ферменты не требуются и, таким образом, не добавляются на стадии осуществления контакта, в соответствии с изобретением, как на стадии осуществления контакта, так и на стадии ферментации могут быть использованы дополнительные ферменты. В некоторых вариантах осуществления эти ферменты будут включены в качестве одного или нескольких вспомогательных ферментов на стадии осуществления контакта, который включает контакт суспензии гранулированного крахмала с альфа-амилазой и одним или более вспомогательных ферментов. В других вариантах осуществления дополнительные ферменты будут включены на стадии ферментации вместе с дрожжами и другими компонентами.

В некоторых вариантах осуществления на стадии осуществления контакта с альфа-амилазой вспомогательные ферменты могут включать глюкоамилазу, ферменты, гидролизующие гранулированный крахмал, протеазу, фитазу, целлюлазу, гемицеллюлазу, пуллюланазу, ксиланазу, липазу, кутиназу, пектиназу, бета-глюканазу, бета-амилазу, циклодекстринтрансгликозилтрансферазу и их комбинации.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления стадия осуществления контакта включает комбинацию альфа-амилазы, фитазы и, необязательно, протеазы. В других вариантах осуществления стадия осуществления контакта включает комбинацию альфа-амилазы, глюкоамилазы и, необязательно, протеазы. В еще одном варианте осуществления стадия осуществления контакта включает комбинацию альфа-амилазы, глюкоамилазы, фитазы и, необязательно, протеазы.

Глюкоамилазы (GA) (E.C. 3.2.1.3.) могут быть получены в результате гетерологичной или эндогенной экспрессии белка в бактериальных, растительных и грибковых источниках. Предпочтительная глюкоамилаза, используемая в составах и способах в соответствии с изобретением, продуцируется несколькими штаммами нитевидных грибов и дрожжей. В частности, коммерчески важными являются глюкоамилазы, секретируемые штаммами Aspergillus и Trichoderma. Подходящие глюкоамилазы включают встречающиеся в природе глюкоамилазы дикого типа, а также вариантные и генетически сконструированные мутантные глюкоамилазы. Следующие глюкоамилазы являются неограничивающими примерами глюкоамилаз, которые могут быть использованы в процессах, охватываемых изобретением. Глюкоамилазы Gl и G2 Aspergillus niger (Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097 - 1102; WO 92/00381, WO 00/04136 и USP 6,352,851); глюкоамилазы Aspergillus awamori (WO 84/02921); глюкоамилазы Aspergillus oryzae Hata et al., (1991) Agric. Biol. Chem. 55:941 - 949) и Aspergillus shirousami. (см. Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9:499 - 505; Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8:575-582; и Chen et al., (1994) Biochem J. 302:275-281).

Глюкоамилазы также получают из штаммов Talaromyces, таких как T. emersonii, T. leycettanus, T. duponti и T. thermophilus (WO 99/28488; USP № RE: 32,153; USP № 4587215); штаммов Trichoderma, таких как T. reesei, в частности, глюкоамилазы, имеющие по меньшей мере 80%, 85%, 90% и 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 4, раскрытой в патентной публикации США. № . 2006-0094080; штаммов Rhizopus, таких как R. niveus и R. oryzae; штаммов Mucor и штаммов Humicola, таких как H. grisea (см. Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; WO 92/00381; WO 00/04136; Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9:499-505; Taylor et al., (1978) Carbohydrate Res. 61:301-308; Патент США № 4514496; Патент США № 4092434; и Jensen et al., (1988) Can. J. Microbiol. 34:218 - 223). Другие глюкоамилазы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают полученные из Athelia rolfsii и ее вариантов (WO 04/111218).

Коммерчески используемые ферменты, имеющие глюкоамилазную активность, производятся, например, из Aspergillus niger (товарное наименование DISTILLASE, OPTIDEX L-400 и G ZYME G990 4X производитель Genencor International Inc.) или видов Rhizopus (товарное наименование CU.CONC производитель Shin Nihon Chemicals, Japan). Также коммерческий расщепляющий фермент имеет товарное наименование GLUCZYME, производитель Amano Pharmaceuticals, Japan (Takahashi et al., (1985) J. Biochem. 98:663-671). Дополнительные ферменты включают три формы глюкоамилазы (E.G.3.2.1.3) из Rhizopus sp., называющиеся "Glucl" (Мол. вес 74,000), "Gluc2" (Мол. вес 58,600) и "Gluc3" (Мол. вес 61,400). Также в изобретении может использоваться ферментативный препарат GC480 (Genencor International Inc.).

Гидролизующие гранулированный крахмал ферменты (GSHE) способны гидролизовать гранулированный крахмал, эти ферменты выделяют из грибковых, бактериальных и растительных клеток, таких как Bacillus sp., Penicillium sp., Humicola sp., Trichoderma sp. Aspergillus sp. Mucor sp. и Rhizopus sp. В одном варианте осуществления определенная группа ферментов, имеющая активность GSH, включает ферменты, имеющие гликоамилазную активность и/или альфа-амилазную активность (см. Tosi et al., (1993) Can. J. Microbiol. 39:846 -855). GSHE из Rhizopus oryzae описан в Ashikari et al., (1986) Agric. Biol. Chem. 50:957-964 и USP 4863864. GSHE из Humicola grisea описан в Allison et al., (1992) Curr. Genet. 21:225-229; WO 05/052148 и Европейском патенте № 171218. GSHE из Aspergillus awamori var. kawachi был описан в Hayashida et al., (1989) Agric. Biol. Chem 53:923-929. GSHE из Aspergillus shirousami был описан в Shibuya et al., (1990) Agric. Biol. Chem. 54:1905-1914.

В одном варианте осуществления GSHE может иметь глюкоамилазную активность и может быть выделен из штамма Humicola grisea, в частности, из штамма Humicola grisea var. Thermoidea (см. USP 4618579). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления фермент Humicola, имеющий активность GSH, имеет по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 из WO 05/052148.

В другом варианте осуществления GSHE может иметь глюкоамилазную активность и может происходить из штамма Aspergillus awamori, в частности, из штамма A. awamori var. kawachi. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления фермент A. awamori var. kawachi, имеющий активность GSH, будет иметь по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6 из WO 05/052148.

В другом варианте осуществления GSHE может иметь глюкоамилазную активность и происходить из штамма Rhizopus, такого как R. niveus или R. oryzae. Фермент, происходящий из штамма коджи R. niveus, выпускают под товарным наименованием «CU CONC», или фермент из Rhizopus, выпускаемых под товарным наименованием GLUZYME.

Другим полезным GSHE, имеющим глюкоамилазную активность, является SPIRIZYME Plus (Novozymes AJS), который также имеет активность кислой амилазы грибов.

В другом варианте осуществления GSHE может иметь альфа-амилазную активность и происходить из штамма Aspergillus, такого как штаммы A. awamori, A. niger, A. oryzae, или A. kawachi, особенно штамм A. kawachi.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления фермент A. kawachi, имеющий активность GSH, будет иметь по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 из WO 05/1 18800 и WO 05/003311.

В некоторых вариантах осуществления фермент, имеющий активность GSH, является гибридным ферментом, например, содержащим каталитический домен альфа-амилазы, такой как каталитический домен альфа-амилазы Aspergillus niger, альфа-амилазы Aspergillus oryzae или альфа-амилазы Aspergillus kawachi, и домен связывания крахмала из другой грибковой альфа-амилазы или глюкоамилазы, такой как связывающий крахмал домен Aspergillus kawachi или Humicola grisea. В других вариантах осуществления гибридный фермент, имеющий активность GSH, может включать каталитический домен глюкоамилазы, такой как каталитический домен Aspergillus sp., a Talaromyces sp., Althea sp., Trichoderma sp. или Rhizopus sp. И связывающий крахмал домен другой глюкоамилазы или альфа-амилазы. Некоторые гибридные ферменты, имеющие активность GSH, раскрыты в WO 05/003311, WO 05/045018; Shibuya et al., (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56: 1674 - 1675 и Cornett et al., (2003) Protein Engineering 16:521 - 520.

Подходящие протеазы включают микробные протеазы, такие как грибные и бактериальные протеазы, например, кислые грибковые протеазы, такие как NSP24, а также GC 106 (Genencor International Inc.). Предпочтительные грибковые протеазы происходят из штаммов Aspergillus (например, протеазы из A. niger и A. oryzae), Mucor (например, M. miehei), Trichoderma, Rhizopus и Candida. Предпочтительные бактериальные протеазы происходят из штаммов Bacillus, таких как B. amyloliquefaciens. Протеазы, добавляемые при ферментации, могут увеличивать уровень свободного аминного азота и увеличивать скорость метаболизма дрожжей и способствовать более высокой эффективности ферментации.

Ферменты, которые могут быть использованы в способах в соответствии с изобретением, включают бета-амилазы (E.C. 3.2.1.2). Эти мальтогенные экзоамилазы, которые катализируют гидролиз 1,4-альфа-гликозидных связей в амилозе, амилопектине и родственных полимеров глюкозы. Коммерческие бета-амилазы доступны от Genencor International Inc., примеры включают SPEZYME BBA и OPTIMALT BBA.

Целлюлазы (E.C. 3.2.1.4), такие как эндоглюканазы, могут быть использованы в способах в соответствии с изобретением. Примеры целлюлаз включают целлюлазы из нитевых грибов, таких как Trichoderma, Humicola, Fusarium и Aspergillus. Коммерчески доступные целлюлазы как SPEZYME CP и LAMINEX (Genencor International, Inc) и CELLUZYME и ULTRAFLO (Novozymes A/S).

Ксиланазы, применяемые в способах в соответствии с изобретением, могут происходить из бактериальных или грибковых источников, таких как Aspergillus, Trichoderma, Neurospora и Fusarium. Коммерческие препараты включают SPEZYME CP и LAMINEX (Genencor International, Inc.) и ULTRAFLO (Novozymes A/S).

Известно несколько бактериальных и грибковых фитаз (E.C. 3.1.3.8 и 3.1.3.26), в некоторых вариантах осуществления изобретения способы с добавлением фитаз особенно эффективны. Дрожжевые фитазы могут происходить из штаммов Saccharomyces (например, S. cerevisiae) и Schwanniomyces (например, S. occidentalis) (Wodzinski et al., Adv. Apple. Microbiol., 42:263-303). Другие грибковые фитазы описаны в литературе с приведением ссылок на Wyss et al., (1999) Appl. Environ Microbiol. 65:367 - 373; Berka et al., (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64: 4423 - 4427; Yamada et ah, (1986) Agric. Biol. Chem. 322:1275 - 1282; публикации PCT № № WO 98/28408; WO 98/28409; WO 97/38096 и WO 9844125; и патенты США № № 6734004; 6350602; и 5863533).

Грибковые фитазы происходят из Aspergillus (например, A. niger, A. awamori, A. terreus, A. oryzea и A. fumigatus); Thermomyces (Humicola) lanuginousus; Fusarium (F. javanicum и F. versillibodes). Также в изобретении могут применяться бактериальные фитазы (Greiner R. et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 303: 107-1 13; Yoon S.J. et al. (1996) Enzyme and Microbial Technol. 18: 449 - 454; и WO 06/043178).

Коммерчески доступные фитазы, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, включают PHYZYMEXP 5000 (Danisco AJS); FINASE (Altech); GC 491; FINASE, SPEZYME HPA (Genencor), BIO-FEED PHYTASE и PHYTASE NOVO (Novozymes), а также NATUPHOS (DSM).

Специалист в данной области техники может легко определить эффективное количество ферментов, которые могут быть использованы на соответствующих этапах способа, охватываемого изобретением.

(B) Стадии способа

Подвергаемый обработке гранулированный крахмал (например, перемолотое зерно зерновых культур) перемешивают с водным раствором для получения суспензии. Водный раствор может быть получен, например, из воды, жидкой барды и/или обратного потока.

Суспензия может иметь DS от 5 до 60%; от 10 до 50%, от 15 до 45%; от 15 до 30%; от 20 до 45%; от 20 до 30%; а также от 25 до 40%. Стадия осуществления контакта с альфа-амилазой протекает в диапазоне pH от 3,5 до 7,0, также в диапазоне pH от 3,5 до 7,0, предпочтительно в диапазоне pH от 4,0 до 6,0 и более предпочтительно в диапазоне pH от 5,4 до 5,5. Суспензия выдерживается в контакте с альфа-амилазой при температуре ниже температуры желирования гранулированного крахмала. В некоторых вариантах осуществления эта температура поддерживается от 45°C до 70°C; в других вариантах осуществления эту температуру поддерживают от 50°C до 70°C; от 55°C до 70°C; от 60°C до 70°C; от 60°C до 65°C, от 55°C до 65°C и от 55°C до 68°C. В других вариантах осуществления температура составляет не менее чем 45°C, 48°C, 50°C, 53°C, 55°C, 58°C, 60°C, 63°C, 65°C до 68°C. В других вариантах осуществления температура была не более чем 65°C, 68°C, 70°C, 73°C, 75°C до 80°C.

Начальная температура желирования крахмала изменяется для различного гранулированного крахмала, который может быть использован в соответствии с процессом, описанным здесь, включая ячмень (от 52°C до 59°C), пшеницу (от 58°C до 64°C), рожь (от 57°C до 70°C), кукурузу (от 62°C до 72°C), кукурузу с высоким содержанием амилозы (от 67°C до 80°C), рис (от 68°C до 77°C), сорго (от 68°C до 77°C), картофель (от 58°C до 68°C), тапиоку (от 59°C до 69°C) и сладкий картофель (от 58°C до 72°C). (J.J.M. Swinkels pg 32 - 38 в STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Eds Van Beymim et al., (1985) Marcel Dekker Inc. New York и The Alcohol Textbook 3^rd ED. A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, UK).

На стадии осуществления контакта суспензия может выдерживаться в контакте с альфа-амилазой в течение периода от 5 минут до 48 часов; а также в течение периода от 5 минут до 24 часов. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет от 15 минут до 12 часов, от 15 минут до 6 часов, от 15 минут до 4 часов, а также от 30 минут до 2 часов.

Эффективная концентрация альфа-амилазы, используемой на стадии осуществления контакта, варьирует в соответствии с условиями конкретного использованного процесса и использованным гранулированным крахмалом. Однако обычно количество используемой альфа-амилазы находится в пределах от 0,001 до 50 ед. AA/г DS, от 0,01 до 30 ед. AA/г DS, от 0,01 до 10 ед. AA/г DS, а также от 0,05 до 5,0 ед. AA/г DS.

В некоторых вариантах осуществления эффективная доза альфа-амилазы на стадии осуществления контакта и/или на стадии ферментации составляет от 0,01 до 15 ед. SS/г DS; также от 0,05 до 10 ед. SS/г DS; а также от 0,1 до 10 ед. SS/г DS; и от 0,5 до 5 ед. SS/г DS.

В некоторых вариантах осуществления эффективная доза глюкоамилазы для этапа осуществления контакта и/или ферментации находится в границах от 0,01 до 15 ед. GA/г DS; также от 0,05 до 10 ед. GA/г DS; также от 0,1 до 10 ед. GA/г DS; или даже от 0,5 до 5 ед. GA/г DS.

В некоторых вариантах осуществления эффективная доза фитазы, используемая на стадии осуществления контакта и/или на стадии ферментации, находится в пределах от 0,001 до 15 ед. FT/г DS; также от 0,005 до 10 ед. FT/г DS; а также от 0,05 до 5 ед. FT/г DS. Одна единица фитазы (ед. FT) представляет собой количество фермента, которое высвобождает 1 микромоль неорганического фосфата в минуту из фитата натрия, 0,0051 моль на литр при 37°C и при pH 5,0.

В некоторых вариантах осуществления эффективная доза протеазы, используемая на стадии осуществления контакта и/или на стадии ферментации, составляет от 0,01 до 15 ед. SAP/г DS; также от 0,01 до 10 ед. SAP/г DS; а также от 0,05 до 5 ед. SAP/г DS. ед. SAP обозначает спектрофотометрическую единицу кислой протеазы, где 1 ед. SAP представляет собой количество протеазной активности фермента, высвобождающее один микромоль тирозина в минуту из казеинового субстрата при условиях исследования.

На стадии осуществления контакта от 25 до 90% гранулированного крахмала солюбилизируется, образуя олигосахариды, включающие декстрин. В некоторых вариантах осуществления солюбилизируется более чем 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% и 90% гранулированного крахмала.

После контакта гранулированного крахмала с альфа-амилазой в течение периода времени, показанного выше, получается субстрат на основе растворимого крахмала (сусло), содержащий более чем 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% и 80% глюкозы.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления стадии осуществления контакта происходил контакт суспензии, содержащей гранулированный зерновой крахмал, имеющей DS 20 - 40% с альфа-амилазой, происходящей из Bacillus stearothermophilus или Bacillus licheniformis в течение от 1 до 6 часов при температуре от 55°C до 70°C, для получения растворимого крахмального субстрата, содержащего по меньшей мере 30% глюкозы. В других предпочтительных вариантах осуществления стадии осуществления контакта происходил контакт суспензии, содержащей гранулированный крахмал из майло, имеющей DS 20 - 40% с альфа-амилазой, происходящей из Bacillus stearothermophilus или Bacillus licheniformis в течение от 1 до 6 часов при температуре от 55°C до 70°C для получения растворимого крахмального субстрата, содержащего по меньшей мере 50% глюкозы.

После стадии осуществления контакта, в результате которого происходит образование сусла, содержащего глюкозу, сусло подвергают ферментации ферментирующим микроорганизмом (например, продуцирующим этанол микроорганизмом).

Однако прежде чем сусло, содержащее по меньшей мере 10% глюкозы, подвергают ферментации, сусло может быть далее обработано водным раствором, содержащим, например, обратный поток и/или кукурузный экстракт, pH при этом корректируется таким образом, чтобы попадать в диапазон pH от 3,0 до 6,0; от 3,5 до 5,5; или от 4,0 до 5,5. В этом варианте изобретении % DS сусла может быть разведен. Например, DS разведенного сусла может быть на величину от 5 до 35%; от 5 до 30%; от 5 до 25%; от 5 до 20%; от 5 до 20%; от 5 до 15%; и от 5 до 10% меньше, чем % DS суспензии на стадии осуществления контакта. В одном неограничивающем примере, если % DS суспензии на стадии составляет приблизительно 32%, а сусло далее подвергается разведению водным раствором, в результате чего DS уменьшается на значение от 5 до 10%, DS подвергаемого ферментации сусла будет составлять от 22% до 27%. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения, если DS суспензии на стадии осуществления контакта составляет от 30 до 35%, DS разведенной суспензии составляет приблизительно от 20 до 30%.

В предпочтительном варианте осуществления сусло, содержащее по меньшей мере 10% глюкозы, подвергают затем процессу брожения с использованием ферментирующих микроорганизмов, таких как описанные выше. Эти способы ферментации описаны в The Alcohol Textbook 3^rd ED, A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, UK.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления сусло подвергают ферментации дрожжами при температурах в диапазоне от 15 до 40°C, а также от 25 до 35°C; при pH в диапазоне от 3,0 до 6,5; а также от 3,0 до 6,0; pH от 3,0 до 5,5, pH от 3,5 до 5,0 а также pH от 3,5 до 4,5 в течение периода времени от 12 до 240 часов, предпочтительно от 12 до 120 часов и более предпочтительно от 24 до 90 часов для получения спиртового продукта, предпочтительно этанола.

Обычно дрожжевые клетки вносят в количестве от 10⁴ до 10¹² , предпочтительно от 10⁷ до 10¹⁰ жизнеспособных дрожжевых клеток на миллилитр ферментируемого бульона. Ферментация также включает добавление к ферментирующим микроорганизмам (например, дрожжам) питательных веществ, возможно, также кислот и дополнительных ферментов.

В одном предпочтительном варианте осуществления стадию осуществления контакта проводят в отдельном от стадии ферментации сосуде. Также предполагается, что стадия осуществления контакта и стадия ферментации могут быть проведены в процессе SSF в одном сосуде.

В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к описанному выше сырью, среда для ферментации содержит добавки, включая, но не ограничиваясь витаминами (например, биотином, фолиевой кислотой, никотиновой кислотой, рибофлавином), кофакторами и макро- и микронутриентами и солями (например, (NH4)₂SO₄; K₂HPO ₄; NaCl; MgSO₄; H₃BO₃; ZnCl₂; и CaCl₂).

Дополнительные ферменты, включаемые на стадии ферментации, могут быть теми же самыми ферментами, что и ферменты, используемые на стадии осуществления контакта, или отличными от них. В некоторых вариантах осуществления фермент включает альфа-амилазы и глюкоамилазы, включая ферменты гидролиза гранулированного крахмала. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления глюкоамилаза и альфа-амилаза могут встречаться в смеси. Особо предпочтительные смеси ферментов включают STARGEN 001 (Genencor International Inc.), который является смесью альфа-амилазы из A. Kawachi и глюкоамилазы из A. niger. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления глюкоамилаза происходит от глюкоамилазы Trichoderma reesei, глюкоамилазы Athelia rolfi, глюкоамилазы Talaromyces, глюкоамилазы Aspergillus и гибридных или вариантных глюкоамилаз, происходящих от них. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления фермент выбран из целлюлазы, фитазы и протеазы.

Получение спирта и других продуктов

Предпочтительным конечным продуктом самого способа ферментации является спиртовой продукт, предпочтительно этанол. Конечный продукт, полученный в соответствии с этим способом, может быть отделен и/или очищен от среды ферментации. Известны способы отделения и очистки, например, путем экстракции, дистилляции и колоночной хроматографии среды. В некоторых вариантах осуществления конечный продукт определяется непосредственно путем подвергания среды анализу с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В других вариантах осуществления сусло может быть разделено, например, с помощью центрифугирования, на жидкую фазу и твердую фазу, конечные продукты, такие как спирт, и твердые вещества при этом извлекаются. Спирт может быть извлечен при помощи таких средств, как дистилляция и дегидратация с помощью молекулярного сита или ультрафильтрация.

В некоторых вариантах осуществления выход этанола будет более чем 8%, 10%, 12%, 14%, 16% и 18% по объему. Полученный в соответствии с процессом в соответствии с изобретением может быть использован как топливный этанол, питьевой этанол или промышленный этанол.

В других вариантах осуществления конечный продукт может включать ко-продукты брожения, такие как сухая барда (DDG) и сухая барда с растворимыми веществами (DDGS), которые могут быть использованы в качестве корма для животных.

Экспериментальная часть

Последующие примеры предложены для того, чтобы продемонстрировать и дополнительно проиллюстрировать определенные предпочтительные варианты осуществления, и аспекты настоящего изобретения и не должны толковаться как ограничивающие область его действия. Действительно подразумевается, что эта информация найдет применение при дальнейшей оптимизации описанных здесь систем процессов.

В раскрытии и последующей экспериментальной секции используются следующие аббревиатуры: GA (глюкоамилазы); % вес. (процент по весу);°C (градусы Цельсия); H₂O (вода); dH₂O (деионизированная вода); dIH₂O (деионизированная вода, фильтрация MiIIi-Q); г или гр. (граммы); мкг (микрограммы); мг (миллиграммы); кг (килограммы); мкл (микролитры); мл (миллилитры); мм (миллиметры); мкм (микрометры); М (молярный); мМ(миллимолярный); мкМ (микромолярный); ед. (единицы); Мол. Вес (молекулярная масса); сек (секунды); мин (минута/минуты); ч (час/часы); DO (растворенный кислород); вес/объем (отношение веса к объему); вес. (отношение весов); объемн. (отношение объемов); Genencor (Genencor International, Inc., Palo Alto, CA); мт (метрическая тонна); и ETOH (этанол).

В примерах ниже использованы следующие препараты ферментов:

SPEZYME Ethyl (доступен от Genencor) представляет собой бактериальную альфа-амилазу, полученную из генетически модифицированного штамма Bacillus Iicheniformis.

GC100 представляет собой экспериментальную бактериальную альфа-амилазу, раскрытую в US 2006/0014265.

Глюкоамилаза Humicola grisea (HGA), имеющая аминокислотную последовательность, раскрытую как SEQ ID NO: 3 в WO 2005/052148.

STARGEN 001 (доступен от Genencor) представляет собой смесь глюкоамилазы Aspergillus niger и альфа-амилазы Aspergillus kawachi.

В приведенных ниже примерах использованы следующие исследования:

Активность альфа-амилазы выражена в единицах альфа-амилазы (ед. АА), ферментативную активность определяли по скорости гидролиза крахмала, отражающейся на скорости уменьшения способности к окрашиванию йодом, которую измеряли при помощи спектрофотометрии. Одна ед. АА активности бактериальной альфа-амилазы представляет собой количество фермента, необходимое для гидролиза 10 мг крахмала в минуту в стандартизованных условиях.

Активность альфа-амилазы также определяется как единица растворимого крахмала (ед. SS) и основана на степени гидролиза субстрата - растворимого картофельного крахмала (4% DS) аликвотой образца фермента при pH 4,5 и 50°C. Содержание восстанавливающего сахара измеряется с применением метода DNS, описанного в Miller, G. L. (1959) Anal. Chem. 31:426 - 428. Одна единица ферментативной активности (ед. SS) равнозначна высвобождению продуктов, имеющих восстанавливающую способность, соответствующую 1 мг глюкозы при определенных условиях инкубации.

Активность глюкоамилазы измеряли с применением хорошо известного исследования, основанного на способности глюкоамилазы катализировать гидролиз p-нитрофенил-альфа-D-глюкопиранозида до глюкозы и p-нитрофенола. При щелочных pH нитрофенол дает желтое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна активности глюкоамилазы, которое отслеживали при 400 нм, после чего сравнивалась с результатами стандартов фермента, измеренных в ед. GA.

Одна «единица активности глюкоамилазы» (ед. GA) представляет собой количество фермента, которое продуцирует 1 г восстанавливающего сахара, считающегося при вычислениях глюкозой, из субстрата, представляющего собой растворимый крахмал при pH 4,2 и 60°C.

Содержание сухих веществ по Бриксу (брикс): измерение содержания растворенных твердых веществ при определенной температуре проводилось путем измерений при помощи рефрактометра.

Определение общего содержания крахмала: Для определения общего содержания крахмала использовали фермент-ферментный процесс ожижения и осахаривания крахмала. В обычном анализе 2 г сухого образца помещали в колбу Кольрауша на 100 мл, после чего добавляли 45 мл буфера MOPS, pH 7,0. Суспензию интенсивно перемешивали 30 минут. Затем добавляли 1 мл SPEZYME FRED (разведенного 1:50 водой) (Genencor), после чего смесь нагревали до кипения в течение 3-5 минут. Колбу помещали в автоклав, поддерживаемый при 121°C, на 15 минут. После автоклавирования колбу помещали на водяную баню при 95°C, добавляли 1 мл разведенного 1:50 SPEZYME FRED и инкубировали в течение 45 мин. Затем pH доводили до 4,2, а температуру снижали до 60°C. Далее добавляли 20 мл ацетатного буфера с pH 4,2. Осахаривание проводили путем добавления 1 мл разведенного 1:100 OPTIDEX L-400 (Genencor), после чего продолжали инкубацию в течение 18 часов при 60°C. Ферментативную реакцию останавливали путем нагревания до 95°C в течение 10 мин. Общий состав сахаров определяли методом анализа ВЭЖХ с использованием глюкозы в качестве стандарта. Значения для гидролизата растворимого крахмала после водной экстракции образца при комнатной температуре без обработки ферментами вычитали из общего количества сахара.

Определение % растворенных твердых веществ. 7 мл образца помещали в пробирку с завинчивающейся крышкой (pH доводили до значения от 5,0 до 6,0), после чего в пробирку добавляли 0,007 мл SPEZYME Fred. Пробирку помещали в кипящую водяную баню на 10 мин, осторожно перемешивали в различное время в процессе инкубации. Через 10 минут пробирку вынимали и помещали в водяную баню при 80°C на 1 час. Пробирку охлаждали и центрифугировали. Определяли брикс-супернатанта, после чего сравнивали с контрольным образцом % солюбилизированных твердых веществ = брикс-контроля х 100/ брикс-образца.

Определение этанола и углеводов в образцах проводилось следующим образом с использованием способа ВЭЖХ:

Центрифужную пробирку Eppendorf на 1,5 мл наполняли суслом из ферментера и охлаждали на льду в течение 10 мин; пробирку центрифугировали в течение 1 мин в настольной центрифуге Eppendorf; образец супернатанта 0,5 мл переносили в пробирку, содержащую 0,05 мл 1,1 Н H₂SO₄ , и оставляли в покое на 5 мин; в пробирку добавляли 5,0 мл воды, после чего образец фильтровали через 0,2 мкм нейлоновый шприц-фильтр в сосуд для ВЭЖХ и проводили ВЭЖХ. Условия ВЭЖХ включали:

Система для этанола: колонка Phenomenex Rezex Organic Acid Column (RHM- Monosaccharide) #00H-0132-KO (эквивалентна Bio-Rad 87H); температура колонки: 60°C; подвижная фаза 0,01 Н H₂SO₄; Скорость потока: 0,6 мл/мин; детектор RI; объем впрыскивания 20 мкл.

Система для углеводов: колонка Phenomenex Rezex Organic Acid Column (RHM- Monosaccharide) #00H-0132-KO (эквивалентна Bio-Rad 87H); температура колонки: 70°C; подвижная фаза: сверхчистая dI H₂ O; Скорость потока: 0,8 мл/мин; детектор RI; объем впрыскивания 10 мкл (для материала с 3% DS).

Колонка разделяет сахара на основе их молекулярной массы на фракции, обозначенные как DP1 (глюкоза); DP2 (дисахариды); DP3 (трисахариды) и DP>3 (сахара-олигосахариды, имеющие степень полимеризации большую чем 3).

Пример 1

Солюбилизация и производство этанола из гранулированного крахмала цельной перемолотой кукурузы и разделенной на фракции кукурузы

Данный эксперимент проводили на трех различных субстратах из гранулированного кукурузного крахмала: (А) на 370 г цельной перемолотой кукурузы, имеющей содержание влаги 13,3% (В) на 354,2 г эндосперма кукурузы, имеющего содержание влаги 9,2%; и (С) на очищенном кукурузном крахмале, obtained from, имеющем концентрацию влаги 11,8%. Каждый субстрат взвешивали и переносили в сосуд из нержавеющей стали с определенным количеством воды для получения, в конечном итоге, 1000 г суспензии с 32% DS.

pH суспензии доводили до 5,5 с использованием 6Н H₂SO₄ , после чего добавляли GC100 (4,0 ед. AA/г DS). Поддерживали температуру 60°C. Во время инкубации суспензию осторожно перемешивали при помощи верхней мешалки. Через временные промежутки в 2, 4, 6, 12 и 24 часа определяли БРИКС, % растворимого крахмала и состав сахаров (в % вес.), результаты приведены в таблице 1. Через 24 часа, в процессе этапа осуществления контакта из цельной перемолотой кукурузы, эндосперма и очищенного крахмала было растворено 79,1%, 71,1% и 60,0% гранулированного крахмала соответственно. Содержание глюкозы в гидролизате через 24 часа составляло 65,22% для целой перемолотой кукурузы, 49,64% для эндосперма и только 5,79% для очищенного крахмала.

Таблица 1
Зерно	Время	БРИКС	% крахмала растворено	глюкоза	% DP2	% DP3	% DP>3
Целая кукуруза	2	11,5		31,60	21,36	13,48	33,56
	4	14,0		37,56	24,31	13,65	24,48
	6	16,3		41,33	25,42	13,36	19,88
	12	18,2		46,23	26,18	12,63	14,96
	24	20,0	79,1	65,22	22,50	7,36	4,92
Эндосперм	2	13,4		27,12	13,85	8,88	50,15
	4	16,1		33,01	16,45	9,39	41,15
	6	17,5		36,56	18,18	9,59	35,67
	12	21,7		47,43	20,98	9,65	21,94
	24	22,9	71,1	49,64	21,33	9,52	19,51
Очищенный крахмал	2	14,4		1,40	10,37	15,27	72,96
	4	16,8		2,34	11,60	15,22	70,84
	6	17,8		5,14	12,27	15,13	67,45
	12	19,1		4,94	13,21	15,62	66,22
	24	20,9	60,0	5,79	14,40	17,42	62,39

Через 24 часа с использованием образцов из целого перемолотого зерна (32% DS) проводили ферментацию дрожжами при pH 4,2, 32°C в присутствии 400 промилле мочевины; дрожжей Red Star Red (Fermentus); STARGEN 001; и 0,1 ед. SAP/г DS протеазы в 125 мл колбе. Данные ВЭЖХ показаны в таблице 2.

Таблица 2
STARGEN 001; ед. GA/г	% объемн. ETOH 24 ч.	% объемн. ETOH 48 ч.	% объемн. ETOH 72 ч.
0,1	10,11	11,74	13,64
0,2	10,36	12,19	14,62
0,4	10,83	12,73	15,35

Пример 2

Солюбилизация и продукция этанола из гранулированного крахмала из майло

Проводили два варианта предварительной обработки: (А) 160 г целого перемолотого майло, имеющего содержание влаги 11,6%, и общее содержание крахмала 53,3% взвешивали и переносили в сосуд из нержавеющей стали, содержащий 340 г воды. Суспензию доводили до pH 6,0 с использованием 6Н серной кислоты. Затем добавляли SPEZYME Ethyl (1.0 ед. AA/г DS). Поддерживали температуру 62°C и плотность 32% DS. (В) предварительную обработку проводили, как написано в (А), с дополнительным добавлением HGA в эквиваленте 0,1 ед. GA HGA/г DS. Количество растворенных твердых веществ (в %) и % глюкозы представлено в таблице 3.

Таблица 3
Фермент	Время (ч)	% DP1 (глюкозы)	% DP2	% DP3	% DP>3	% растворенного крахмала
SPEZYME Ethyl	2	57,71	24,60	10,42	7,27
	4	64,41	22,50	9,13	3,95
	6	67,16	21,83	8,16	2,85
	24	86,50	9,91	2,95	0,63	54,7
SPEZYME Ethyl +HGA	2	84,34	9,48	1,47	4,72
	4	87,72	8,07	1,18	3,03
	6	88,91	7,68	1,03	2,37
	24	93,10	5,26	0,59	1,05	69,3

Сырье после описанной выше предварительной обработки HGA (сусло) оценивали с применением дрожжей при обычных условиях ферментации (например, дрожжи Red Star, pH 4,2, 32°C, в присутствии 400 промилле мочевины; STARGEN 001 и 0,05 ед. SAP/г DS) в колбе на 125 мл. Результаты ВЭЖХ показаны в таблице 4.

Таблица 4
Предварительная обработка	ед. GA/г STARGEN 001	% объемн. Этанола, 24 ч.	% объемн. Этанола, 48 ч.
SPEZYME Ethyl +HGA	0,1	10,02	11,98
	0,2	10,22	12,75

Пример 3

Действие температуры на продукцию глюкозы из целого перемолотого майло

Инкубирование 30% DS водной суспензии перемолотого майло при pH 5.5 в присутствии GC100 (4,0 ед. AA/г DS) проводили при температуре 60°C, 65°C и 70°C. Через 6 часов инкубирования брали образцы и центрифугировали их для того, чтобы отделить нерастворимые вещества. Измеряли брикс и состав чистого супернатанта при помощи ВЭЖХ. Определяли % растворенного крахмала и % глюкозы, результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5
°C	% растворенного крахмала	% вес DP1 (глюкозы)	% вес DP2	% вес DP3	% вес DP>3
60	69,9	52,48	27,07	12,08	8,36
65	68,2	52,61	23,42	10,41	13,56
70	61,9	36,49	18,98	10,27	34,26

По мере увеличения температуры инкубации на стадии осуществления контакта с цельным перемолотым майло от 60°C до 70°C растворение крахмала и содержание глюкозы уменьшалось. Это наводит на мысль, что альфа-амилаза может инактивироваться при 70°C. Более 50% растворенного крахмала было гидролизовано до глюкозы при 65°C, что позволяет предположить, что эндогенные ферменты растения, гидролизующие крахмал, способны гидролизовать растворимые олигосахариды до глюкозы.

После описанной выше предварительной обработки при 65°C сырье оценивали с применением обычных условий ферментации, описанных в основном в примере 2, за исключением того, что DS составлял 30%. Результаты показаны в таблице 6.

Таблица 6
STARGEN 001; ед. GA/г	% объемн. ETOH, 24 ч.	% объемн. ETOH, 48 ч.	% объемн. ETOH, 72 ч.
0,1	9,19	11,00	11,29
0,2	9,32	11,07	12,80
0,4	9,61	11,47	13,32

Пример 4

Солюбилизация и производство этанола из рисового гранулированного крахмала

Зерно риса (116 г), имеющее содержание крахмала 81,5%, содержание влаги 14% и размером частиц, позволяющим их просеивать через сито 30 меш, перемешивали с 284 г воды для получения суспензии с 25% DS. К суспензии добавляли GC100 (4.0 ед. AA/г DS). Затем pH доводили до pH 5,5 и поддерживали температуру 65°C. Через 2, 4, 6 и 24 часа был измерен брикс. Был определен % растворимого крахмала и % глюкозы, результаты показаны в таблице 7.

Таблица 7
Время, ч	брикс	% растворенного крахмала	% вес/объем DP1 (глюкозы)	% вес/объем DP2	% вес/объем DP3	% вес/объем DP4
1	11	39,2	27,5	19,8	12,7	39,6
2	12,5	44,6	31,2	22,2	13,4	32,6
4	14,8	52,8	33,4	24,0	13,8	28,7
6	16,2	57,5	33,8	24,4	13,9	27,7
24	16,4	58,4	36	26,2	14,6	23,2

Через 24 часа проводили ферментацию дрожжами при pH 4,2, 30°C в присутствии 0,75 ед. GA/г DS STARGEN 001, 400 промилле мочевины, и дрожжей Angel (Jiangxi, China) в количестве 0.4%. Образцы для ВЭЖХ брали через 24, 48 и 67 ч. (таблица 8).

Таблица 8
Время, ч	% вес/объем глюкозы	% объемн. ETOH
24	2,15	6,62
48	0,32	10,4
67	0,35	12,0