способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью

Формула изобретения

Способ получения фракции из клеток Escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью, включающий консервацию клеток в присутствии забуференного 80-90% глицерина с последующим снятием клеточных оболочек 3% тритоном Х-100, экстракцию возрастающими концентрациями солей: 0,14 М, 0,35 М; 2 М NaCl, 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% -меркаптоэтанолом, аффинную хроматографию на сефарозе 4 В с иммобилизованным трипсином и последующей оценкой в элюатах ингибирующей протеазы активности.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии прокариотической клетки и может быть применено к анализу молекулярно-генетических механизмов формирования структуры клетки прокариот и роли белковых компонентов в их организации, а также особенностей ремоделирования генома, что является необходимым для раскрытия путей регулирования механизмов воздействия макро- и микроорганизмов, а также поиску новых мишеней для лекарственных средств и разработке экологически безопасных лечебных препаратов.

Известен способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью [1], котором был описан способ получения фракций из клеточных ядер соматических клеток растений. Недостаток этого метода заключается в том, что получение надмолекулярно-генетических структур осуществляется из клеточных ядер растений, а не из безъядерной прокариотической клетки, оболочка которой не может быть снята 0,5% тритоном Х-100.

Вышеуказанный способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью, был принят за основу, в котором первоначально производят консервацию растительных тканей в забуференном 80-90% глицерине с последующей трехступенчатой гомогенизацией в забуференной 20% глицериновой среде, низкоскоростное центрифугирование растительного гомогената и очистку ядер через пятислойный (50, 60, 70, 80, 90 масса/объем) забуференный глицериновый градиент с последующей очисткой ядер буфером, содержащем 0,5% тритона Х-100 с последующей экстракцией ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия, 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% -меркаптоэтанолом и 0,5 н. раствором гидроксида натрия при сопутствующей аффинной хроматографии вышеперечисленных ядерных фракций на сефарозе 4В с иммобилизованным трипсином либо ингибитором трипсина.

Недостатком этого способа является то, что трехступенчатая гомогенизация неприемлема для клеток прокариот, т.к. культура уже состоит из отдельных клеток не объединенных в ткань, 0.5% тритон Х-100 не снимает клеточную оболочку прокариотической клетки, экстракция фракций 0,5 н. гидроксидом натрия невозможна, т.к. клеточный остаток целиком растворяется в 6 М гуанидин гидрохлориде с 0,1% -меркаптоэтанолом.

Целью изобретения является расширение спектра сравнительных методов, позволяющих получать фракции из клеток различных уровней организации.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения фракций из клеток Escherichia coli, обладающих протеолитической и ингибирующей протеазы активностью, у консервированных в присутствии забуференного 80-90% глицерина клеток снимают клеточную оболочку 3% тритоном Х-100, затем проводят экстракцию возрастающими концентрациями солей: 0,14 М, 0,35 М; 2 М NaCl, 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% -меркаптоэтанолом, при одновременной на двух колонках аффинной хроматографией на сефарозе 4В с иммобилизованным ингибитором трипсином и трипсином соответственно, оценивают протеолитическую и ингибирующую протеазы активности.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Опыты проводили на протяжении жизненного цикла клеток штамма Е. coli JC-158 (Hfr PO1, thi1, serA6, lacI22, relA1) [5], предоставленного Ступак И.В. и Ступак Е.Э., выращивание культуры проводилось Тропыниной Т.С. (Институт биологии УНЦ РАН, лаборатория математической и молекулярной генетики) и штамма E.coli 5а, предоставленного Маркушевой Т.В. (Институт биологии УНЦ РАН, группа генетики микроорганизмов). В работе для выращивания использовалась богатая питательная среда LB (Луриа-Бертани). В 1 литре дистиллированной воды растворялись при помешивании (на магнитной мешалке типа MM 2A): бакто-триптон (Difco, США) - 10 г; дрожжевой экстракт (Difco, США) 5 г; NaCl 10 г, рН до 7,5. Среда стерилизовалась при 120-123°С, при давлении пара 1 атм в стандартном автоклаве.

Бактериальные клетки, использованные в эксперименте, первоначально находились в агаризованных столбиках LB (на 1 литр среды 1,5 г агар-агара, Difco, США) и хранились при температуре 4°С.При такой температуре и практически полном отсутствии кислорода происходит замедление всех физиологических процессов в клетках. Для того чтобы перевести клетки в "нормальное физиологическое состояние", а именно аэробное дыхание, бактериальную культуру из агаризованного столбика в стерильных условиях переносили с помощью бактериологической петли в жидкую среду LB в объеме 5 мл, находящуюся в химической пробирке объемом 20 мл, закрывали ватно-марлевой пробкой и инкубировали при 37°С, 160 об/мин на лабораторном термостатируемом встряхивателе (П5.10-Э5960) в течение 16 часов. Отдельно выросшая хорошо сформировавшаяся колония бактерий с агаризованной среды LB пересевалась с помощью бактериологической петли в жидкую среду LB в объеме 5 мл и инкубировалась при 37°С, 160 об/мин 7 часов. Затем 100 мкл подросшей культуры клеток пересевались в свежую жидкую среду LB в объеме 5 мл и инкубировались при 37°С, 160 об/мин 16 часов. 2 мл культуры клеток вносились в кювету с рабочей длиной 5,075 мм, и измерялась оптическая плотность на колориметре фотоэлектрическом концентрационном (КФК-2) при длине волны 590 нм. Это значение составляло 1,0. В свежую жидкую среду LB в объеме 120 мл в 500 мл колбе высевались 120 мкл 16-часовой культуры и проводилось инкубирование при 37°С, 160 об/мин в течение 7 часов 10 минут.

Первая проба была взята через 50 минут после начала инкубирования. Оптическая плотность первой пробы составляла 0,005. Для дальнейшего анализа отбирались образцы в объеме 1,5 мл. Клетки осаждались центрифугированием при 12000 об/мин на центрифуге Эппендорф в течение 5 мин. Надосадочная жидкость удалялась, осадки подсушивались. К осадкам добавлялось по 50 мкл среды следующего состава: 80-90% глицерин на 0,01 М трис-HCl буфере, рН 6.8, с добавлением 0.005 М MgCl₂ ; 0.025 М КСl; 0.003 М CaCl₂; 0.005 М NaCl для консервации клеток при минус 25°С. Последующие пробы отбирались через каждые 20 минут в течение 7 часов 10 минут.

Далее осадки клеток промывали 3% тритоном Х-100 в среде следующего состава: 0.02М триэтаноламин (ТЭА)·HCl, рН 6.8; 0.005 М MgCl₂; 0.025 М KCl; 0.003 М CaCl₂; 0.005 М NaCl, рН 6,8; встряхивали в течение 30 мин на микрошейкере (Micro-shaker type 326 m, Польша), с последующим центрифугированием при 4000 об/мин (К-23, ГДР) в течение 20 мин для снятия клеточной оболочки, после чего осадок дважды промывали в среде следующего состава: 0.005 М MgCl₂; 0.025 М KCl; 0.003 М CaCl ₂; 0.005 М NaCl; 0,01 М трис-HCl, рН 6.8, с последующим центрифугированием при вышеуказанных условиях. Более низкие концентрации тритона Х-100 не снимали оболочки клеток Е. coli.

Цитоплазматические белки экстрагировали 0,14 М NaCl, 0.01 М трис-HCl буфером, рН 6.8. Фракцию непрочносвязанную с клеточным остатком выделяли путем экстракции осадка 0,35 М NaCl, 0.01 М трис-HCl буфером, рН 6.8. Далее осадок фракционировали суспендированием в трис-HCl буфере с 2 М NaCl. В осадке оставалась фракция, содержащая клеточный остаток с клеточной оболочкой. Последующую экстракцию проводили 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% -меркаптоэтанолом на трис-HCl буфере. В вышеуказанном буфере осадок растворялся полностью, поэтому экстракцию 0,5 н. NaOH не проводили. Клеточные фракции хранили при -196°С в азоте.

Количество белка определяли по связыванию белка с кумасси ярко-синим G (Loba, Австрия) [1,3]. Метод использовался в случае микронаноколичественного определения белка.

Аффинную хроматографию проводили на двух колонках (0,5x4 см) с иммобилизованным трипсином («СПОФА», ЧССР) и ингибитором трипсина соответственно, ковалентно присоединенных к CNBr-активированной агарозе (Институт химии АН Эстонии) [1]. Гель содержал 0,1 мкмоль присоединенного трипсина («Спофа», Чехословакия) и ингибитора трипсина соответственно. Уравновешивание колонок для связывания трипсина и ингибитора проводили с помощью 0.05 М трис-HCl, рН 8.0 (из буфера был исключен СаСl₂ вследствие того, что при последующих реакциях по определению протеолитической и ингибиторной активностей он давал осадочную реакцию). Связавшийся белок элюировали 0.1 н. Na-ацетатным буфером, рН 3.0. Работу колонок с иммобилизованным трипсином или ингибитором трипсина проверяли пропусканием через них чистого сывороточного альбумина (Реахим), а также альбумина с добавлением ингибитора трипсина или просто трипсина (по 10 мкг соответственно). Колонки не связывали чистый сывороточный альбумин, а из смеси альбумин-трипсин или альбумин-ингибитор трипсина идентифицировали трипсин (колонка с иммобилизованным ингибитором трипсина) или ингибитор трипсина (колонка с иммобилизованным трипсином). Полученные фракции наносились на обе колонки одновременно, чтобы сохранить физиологический статус фракции, и результаты эксперимента были корректными.

Протеолитическую активность протеаз определяли по расщеплению низкомолекулярного белка протамина («Calbiochem», США) [1]. Количество освободившегося аргинина рассчитывали, пользуясь калибровочным графиком. В качестве стандарта использовали D,L-аргинин («Reanal», Венгрия), Активность протеаз и их ингибиторов выражали в нмоль аргинина на 1 мг/с.

Анализ полноты выделения клеточных фракций (табл.1) и фракций, полученных после аффинной хроматографии (табл.3), показал, что все фракции представляют собой не чистый белок, а комплексы нуклеиновых кислот, белка и гексоз. Для определения ДНК и РНК использовали метод А.С.Спирина [4]. Для определения содержания гексоз использовали метод [2].

На фиг.1 представлена кривая роста штамма Е.coli JC-158. На оси ординат показана оптическая плотность периодической культуры. На оси абсцисс показан возраст периодической культуры в мин, измеряемый в течение 7 часов 10 минут в растущей культуре клеток.

На фиг.2 представлена полнота выделения белкового компонента в надмолекулярно-генетических структурах клеток Е.coli JC-158. На оси ординат показан процент выхода белка, на оси абсцисс - возраст культуры.

Эффективность последовательной ступенчатой экстракции протеаз и ингибиторов трипсина из клеток Е.coli JC-158 показана на фиг.3. На оси ординат (фиг.3) показана активность протеаз (1) и ингибиторов трипсина (2) выраженная в нмоль аргинина на 1 мг белка/с. На оси абсцисс указан возраст культуры в мин (от 50 до 430 мин). Использованы следующие обозначения: Цп - цитоплазма; Фр-I - фракция непрочносвязанная с клеточным остатком (35 М NaCl); Фр-II - фракция прочносвязанная с клеточным остатком (2 М NaCl); Ко - клеточный остаток с клеточной оболочкой;

На фиг.4 показана последующая идентификация фракций, полученных из клеток Е.coli JC-158, на колонках либо с иммобилизованным ингибитором трипсина либо с трипсином. На оси ординат показано содержание протеолитических и ингибиторных надмолекулярно-генетических комплексов в расчете на 1 клетку (пг). На оси абсцисс указан возраст культуры в мин (от 50 до 430 мин). Использованы следующие обозначения: 1 - протеолитический комплекс; 2 - ингибиторный комплекс.

Исследование фракций, обладающих протеолитической и ингибиторной активностью, включает предварительную консервацию клеток в глицериновой среде, снятие клеточной оболочки и выделение из них клеточных фракций возрастающими концентрациями солей. Табл.1 показывает, что структура клеток (штамма Е. coli 5 а) не нарушена и иллюстрирует полноту выделения клеточных фракций. Табл.2 и 3 иллюстрируют компонентный состав аффинновыделенных протеолитических (табл.2) и ингибиторных (табл.3) комплексов в течение роста клеток штамма Е. coli 5a в периодической культуре.

Предложенный способ рекомендуется в исследовании молекулярно-генетических механизмов формирования прокариотической структуры клетки и роли белковых компонентов в их организации, в частности в исследованиях Arg-X протеиназ и их ингибиторов, участвующих в ремоделировании хроматина, для построения компьютерных моделей организации прокариот. Знание биохимических процессов, происходящих на разных фазах роста популяции бактерий, позволяет раскрыть пути регулирования механизмов воздействия макро- и микроорганизмов, а также способствует поиску новых мишеней для лекарственных средств, что дает возможность управления бактериальными сообществами, населяющими человеческий организм. Предложенный способ также рекомендуется в разработках в области нанотехнологий, а именно полиалкиленгуанидинов (ПАГ), как экологически безопасных биоцидных полимеров, широкий биоцидный спектр действия которых обусловлен наличием в повторяющихся звеньях гуанидиновых группировок, являющихся активным началом некоторых природных и синтетических лекарственных средств, и, кроме того, для понимания перспектив практического применения аргининсодержащих препаратов, применяющихся в клинике

Источники информации

1. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью. Авторское свидетельство № 1733471 //БИ 1992, № 18, с.96.

2. Иванова Э.А., Вафина Г.Х., Ремеева P.Г. Способ определения углеводных компонентов в клеточных ядрах. Патент № 2108571 // БИ № 10, 10.04.98.

3. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. С.342.

4. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия, 1968, т.23, 35, с.656.

5. Myrphy D.B., Pembroke J.T. Transfer of the IncJ plasmid R391 to recombination deficient E.coli K12: evidence that R391 behaves as a conjugal transposon//FEMS Microbiology Letters, 1995, V.134, P.153-158.