способ комбинированного иммунологического и генетического исследования клеток

Формула изобретения

1. Способ комбинированного иммунологического и генетического исследования клеток, отличающийся тем, что исследуемую суспензию клеток инкубируют с биочипом, содержащим иммобилизованные антитела, специфичные к поверхностным антигенам клеток, после инкубирования биочип отмывают от неспецифически связавшихся клеток, далее биочип подвергают обработке мечеными полинуклеотидными зондами одного или нескольких видов, осуществляют гибридизацию, считывают и обрабатывают полученные результаты, при этом устанавливают наличие у исследуемых клеток определяемых поверхностных антигенов, а также наличие или отсутствие у тех же клеток определяемых генетических признаков.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после выполнения отмывки биочипа от неспецифически связавшихся клеток, оставшиеся связанными с биочипом клетки подвергают фиксации, дегидратированию и высушиванию.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что после выполнения гибридизации с мечеными полинуклеотидными зондами проводят отмывку биочипа от не связавшихся полинуклеотидных зондов.

4. Способ по любому из пп.1 и 3, отличающийся тем, что после выполнения отмывки биочипа от несвязавшихся полинуклеотидных зондов проводят его высушивание.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе обработки результатов определяют плотность связывания клеток в области участков биочипа с различными иммобилизованными антителами и оценивают содержание в исследуемом образце клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены.

6. Способ по любому из пп.1 и 5, отличающийся тем, что определяют долю клеток, сочетанно имеющих определяемый генетический признак и определяемый антиген, от количества клеток, имеющих определяемый антиген.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения коэкспрессии антигенов связавшиеся с биочипом клетки дополнительно обрабатывают мечеными антителами, специфичными к одному или нескольким антигенам.

8. Способ по любому из пп.1 и 7, отличающийся тем, что для исследования одной и той же клеточной суспензии используют комплекс из нескольких биочипов, связавшиеся с которыми клетки подвергают гибридизации с разными видами меченых полинуклеотидных зондов или обрабатывают разными видами меченых антител.

9. Способ по любому из пп.1 и 7, отличающийся тем, что определяют количество клеток, имеющих определяемую коэкспрессию антигенов и оценивают долю клеток, одновременно имеющих определяемый генетический признак.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к области гематологии, онкологии и клинической лабораторной диагностики, кроме того, оно может быть использовано в ветеринарии и биологии.

Известен способ определения поверхностных антигенов клеток с помощью биочипов (см. Liu A.Y. Differential Expression of Cell Surface Molecules in Prostate Cancer Cells// Cancer Research. 2000., vol.60, p.3429-3434), взятый в качестве аналога, заключающийся в том, что биочип (представляющий собой подложку с иммобилизованными в строго определенных участках антителами, каждое из которых специфично к определенному клеточному поверхностному антигену) инкубируют с суспензией клеток. Клетки, имеющие на своей поверхности соответствующие антигены, связываются с антителами, иммобилизованными в строго определенных участках (пятнах) биочипа. Остальные клетки не специфически связываются с его поверхностью. Затем биочип отмывают от не специфически связавшихся клеток изотоническим отмывочным раствором. В результате, на поверхности биочипа остаются только те клетки, которые связались с антителами. Осуществляют считывание результата, определяя, в каких пятнах биочипа произошло связывание клеток. Способ позволяет одновременно определять на разных клетках большое количество различных поверхностных антигенов.

Недостатком данного способа является невозможность проведения генетического исследования тех же самых клеток, что снижает информативность анализа.

Известен способ выполнения комбинированного иммунологического и генетического исследования клеток, получивший название M-FICTION анализа (multicolor fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasms), взятый в качестве прототипа, (см., например, J.I. Martin-Subero, I. Chudoba, L. Harder, S. Gesk, W. Grote, F.J. Novo, M. J. Calasanz, and R. Siebert "Multicolor-FICTION Expanding the Possibilities of Combined Morphologic, Immunophenotypic, and Genetic Single Cell Analyses" / Am J Pathol. 2002 August; 161(2): 413-420.) Данный способ заключается в том, что клетки (находящиеся на поверхности предметного стекла) обрабатывают одним или несколькими флуоресцентно-меченными антителами, специфичными к их антигенам, отмывают, фиксируют, дегидратируют (с помощью растворов этилового спирта с возрастающими концентрациями) и высушивают. Затем те же клетки обрабатывают одним или несколькими флуоресцентно-меченными ДНК-зондами, комплиментарными к известным нуклеотидным последовательностям. Осуществляют денатурацию ДНК и гибридизацию, в результате которой каждый меченный зонд связывается с комплементарным ему участком гена. Затем выполняют отмывку. Проводят исследование препарата с помощью флуоресцентного микроскопа с наборами светофильтров, позволяющих определить флуоресценцию каждой используемой метки, а также при необходимости определить взаимное расположение меток. (Каждый вид антител и каждый вид зондов зонд конъюгирован со строго определенной меткой). Может быть также получено трехмерное изображение каждой клетки. Для этого получают серию последовательных изображений, при разных расстояниях объектива микроскопа от препарата (например, с шагом 1 мкм) и осуществляют их компьютерную обработку.

Проведение подобного анализа дает возможность одновременного обнаружения морфологических, иммунофенотипических, и генетических особенностей одних и тех же клеток.

Недостатком способа является большой расход дорогостоящих флуоресцентно- меченных антител при определении антигенов клеток, имеющих поверхностную локализацию. При этом невозможно проведение исследования с использованием немеченых антител, имеющих меньшую стоимость. Кроме того, вследствие ограниченного числа одновременно используемых флуоресцентных меток на разных клетках может быть определено лишь небольшое число поверхностных антигенов, что ограничивает число одновременное определяемых иммунологических субпопуляций клеток. (На практике число одновременно используемых флуоресцентных меток ограничено из-за наложения их спектров эмиссии).

Задачей заявленного изобретения является снижение расхода антител при определении поверхностных антигенов клеток и увеличение количества одновременно определяемых поверхностных антигенов на разных клетках, а также возможность использования для этого антител не конъюгированных с меткой.

Поставленная задача решается за счет того, что согласно способа комбинированного иммунологического и генетического исследования клеток, заключающегося в том, что осуществляют определение антигенов клеток, с помощью антител с известной специфичностью, те же клетки фиксируют и проводят гибридизацию с меченными полинуклеотидными зондами одного или нескольких видов, выполняют отмывку, устанавливают наличие или отсутствие у данных клеток одного или нескольких искомых генетических признаков, исследуемую суспензию клеток инкубируют с биочипом, содержащим иммобилизованные антитела, специфичные к поверхностным антигенам клеток, осуществляют отмывку биочипа от неспецифически связавшихся клеток, оставшиеся связанными клетки подвергают обработке меченными полинуклеотидными зондами одного или нескольких видов, осуществляют гибридизацию, выполняют считывание и обработку результата.

Осуществляют определение коэкспрессии антигенов, включающее обработку связавшихся с биочипом клеток меченными антителами, специфичными к одному или нескольким антигенам.

Для исследования одного и того же образца биологического материала используют комплекс из нескольких биочипов, связавшиеся с которыми клетки подвергают гибридизации с разными видами меченных полинуклеотидных зондов или обрабатывают разными видами меченных антител.

Определяют плотность связывания клеток в области участков биочипа с различными иммобилизованными антителами и осуществляют оценку содержания в исследуемом образце клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены.

Определяют долю клеток, одновременно имеющих определяемый генетический признак и определяемый антиген, от количества клеток, имеющих определяемый антиген.

Определяют количество клеток, имеющих определяемую коэкспрессию антигенов и оценивают долю клеток, одновременно имеющих определяемый генетический признак.

Использование заявленного изобретения позволяет на разных клетках с помощью биочипа определять множество поверхностных антигенов. (Число поверхностных антигенов, определяемых по факту связывания клеток в различных тестовых участках биочипа с иммобилизованными антителами, определяется только количеством этих участков на подложке биочипа и может достигать нескольких десятков или сотен.). Применение биочипа позволяет значительно снизить расход антител.

Сохраняется возможность определения нескольких антигенов на каждой отдельно взятой клетке с помощью дополнительной обработки меченными антителами. Но за счет связывания любой отдельно взятой клетки с иммобилизованными на биочипе антителами, на ее поверхности определяется на один антиген больше. При этом на биочипе иммобилизованы более дешевые антитела не конъюгированные с меткой и расход этих антител крайне мал.

Использование для анализа одного и того же образца биологического материала нескольких биочипов, на которых проводятся определение разных видов коэкспрессии антигенов с помощью разных видов меченных антител или определение разных генетических признаков с использованием разных видов меченных полинуклеотидных зондов, повышает информативность исследования и расширяет спектр признаков определяемых во взаимосвязи друг с другом.

Возможно качественное полуколичественное или количественное определение плотности связывания клеток (отношения количества клеток к площади участка на которой они связались) в области участков биочипа, содержащих иммобилизованные антитела. Исходя из величины плотности связывания, может быть определено содержание в образце клеток, имеющих определяемые с помощью биочипа поверхностные антигены.

Может быть определена доля клеток, имеющих коэкспрессию антигенов, а также доля клеток, имеющих определяемые генетические признаки от числа клеток, связавшихся в исследуемой области любого тестового участка биочипа с иммобилизованными антителами. Это позволяет оценить содержание в исследуемом образце клеток, одновременно имеющих любой из определяемых (с помощью биочипа) поверхностных антигенов и его коэкспрессию с дополнительно определяемым антигеном (одним или нескольким) и (или) один или несколько определяемых генетических признаков. Использование данного подхода существенно повышает информативность анализа.

Заявленный способ может быть использован, например, для определения иммунологических субпопуляций опухолевых клеток, имеющих ту или иную генетическую (цитогенетическую) аномалию, что, позволит повысить точность диагностических исследований и избежать некоторых противоречий при постановке диагноза. Данный способ также может быть использован для решения многих других задач, в частности, для проведения протеомических исследований.

Заявленный способ поясняется иллюстрациями, где

на фиг.1 представлена диаграмма, демонстрирующая результат исследования клеток больного И., 75 лет. Диагноз хронический В-клеточный лимфоцитарный лейкоз (В-ХЛЛ).

Фиг.2 представлена диаграмма, демонстрирующая результат исследования клеток больного П., 59 лет. Диагноз: лимфома из клеток мантийной зоны. Лейкемизация.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Перед проведением анализа в кювете или на платформе (патент на полезную модель RU 90213) закрепляют биочип, представляющий собой прозрачную пластину, на которой в строго определенных тестовых участках (пятнах) иммобилизованы антитела, специфичные к поверхностным антигенам клеток. (Пример описания биочипа данного класса см. в работе: А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток», Биологические мембраны, 2008, том 25, № 4, с.277-284). Осуществляют блокирование сайтов неспецифического связывания подложки, если этого не было сделано на этапе изготовления биочипа. Для этого биочип инкубируют с белковым раствором (например, раствором обезжиренного сухого молока или бычьего сывороточного альбумина), после чего выполняют отмывку раствором детергента (например, 0,05% раствором детергента «Tween-20» в фосфатном буфере). Далее осуществляют инкубацию биочипа с исследуемой клеточной суспензией. При этом клетки оседают на поверхность биочипа и приходят в контакт с иммобилизованными антителами. Если клетки имеют соответствующие поверхностные антигены, происходит их связывание в тестовых участках (пятнах) на поверхности биочипа.

Затем осуществляют отмывку биочипа для устранения клеток, неспецифически связавшихся с его подложкой. Для этого биочип несколько раз ополаскивают изотоническим буферным раствором. После завершения отмывки в области пятен биочипа остаются связанными только те клетки, которые имеют соответствующие поверхностные антигены. Контроль качества отмывки осуществляют с помощью микроскопического исследования. Отмывка является завершенной, если за пределами пятен биочипа (в фоновых участках) связанные клетки отсутствуют. После проведения отмывки может быть выполнена инкубация биочипа со средой RPMI-1640, что в целом ряде случаев приводит к значительному повышению прочности связывания оставшихся клеток с подложкой.

Затем осуществляют фиксацию биочипов, например, смесью этанола и уксусной кислоты (3:1) в течение 10 минут и в 1% растворе параформальдегида в течение 1 минуты. Вместо этого может быть выполнена фиксация 4% раствором пароформальдегида или проведена обработка иными веществами.

Может быть выполнена обработка раствором протеазы в кислой среде в течение 5 минут с последующей двукратной отмывкой PBS. После этого проводят дегидратирование путем последовательной обработки этиловым спиртом с увеличением концентрации (70%, 85%, и 96% или абсолютным) по 2 мин при +4°С, после чего биочип высушивают на воздухе.

Затем на поверхность биочипа помещают каплю растворов, меченных ДНК зондов, и накрывают ее покровным стеклом. Если биочип был закреплен в платформе (патент на полезную модель RU 90213), ее съемный бортик при этом удаляют. Осуществляют инкубацию при +70°С - +78°С (оптимальное значение температуры для конкретного набора зондов устанавливают экспериментально) в течение 10-15 минут, а затем выдерживают при +37°С в течение 8-12 часов. Данную процедуру выполняют при 100% влажности воздуха. Выполняют отмывку биочипа разбавленным цитратным буфером (SSC). Под слоем буфера аккуратно снимают покровное стекло. Затем биочип обрабатывают в SSC буфере с добавлением реагента PN-40 (0,4х SSC/0,3% PN-40) 2 минуты при +73 и 2 минуты (2х SSC/0,1% PN-40) при комнатной температуре и высушивают. Может быть выполнено дополнительное окрашивание ДНК раствором 4',6-диамин-2-фенилиндола (DAPI).

На биочип наносят каплю так называемого антифейд (anti-fade) раствора, уменьшающего «выцветание» меток, происходящее под действием ультрафиолетового излучения. Сверху прикладывают покровное стекло.

После выполнения всех манипуляций биочип исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа. При этом получают микрофотографии каждого пятна при обычном освещении, а также при ультрафиолетовом освещении с использованием необходимых наборов светофильтров.

Затем осуществляют обработку результата. На микрофотографиях пятен биочипа, выполненных на малом увеличении микроскопа при обычном освещении, определяют плотность связывания клеток (количество клеток, связавшихся на единице площади поверхности участка подложки биочипа).

Исходя из значений плотности связывания клеток в области пятен биочипа, может быть определено содержание в суспензии клеток, имеющих соответствующие антигены. Для этого определяют отношение плотности связывания клеток в конкретном тестовом участке биочипа к максимально возможной плотности связывания клеток (определяемой расчетным путем) или к плотности связывания клеток в контрольном участке, обеспечивающем связывание любых типов исследуемых клеток, присутствующих в образце. (Например, при исследовании лейкоцитов в качестве контрольного участка биочипа может использоваться тестовый участок (пятно) с иммобилизованными антителами, специфичными к антигену CD45, который присутствует на поверхности всех типов лейкоцитов). Полученные значения, выраженные в процентах, численно совпадают со значениями процентного содержания в образце клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены. Данное соответствие выполняется, в случае если инкубация биочипа с клеточной суспензией выполняется без перемешивания.

На микрофотографиях нескольких полей зрения, выполненных на большом увеличении микроскопа при ультрафиолетовом освещении (с использованием необходимых наборов светофильтров) в каждом пятне биочипа определяют наличие клеток, имеющих соответствующие метки (комбинации из несколько меток). Определяют отношение числа таких клеток к общему числу клеток в данных полях зрения. Исходя из этого, рассчитывают содержание клеток, имеющих соответствующий поверхностный антиген (определяемый с помощью биочипа), и при этом имеющих определяемый с помощью in citu гибридизации генетический признак.

Процесс считывания и обработки результата может быть автоматизирован.

При выполнении генетического исследования связавшихся с биочипом клеток возможно также использование полинуклеотидных зондов конъюгированных (меченных) не с флуоресцентной меткой, а с биотином (или с авидином), либо с ферментом, например, с пероксидазой, либо с иным веществом (см. «Молекулярная клиническая диагностика. Методы»./ Под редакцией С.Херингтона и Дж.Макги, М.: «Мир», 1999). В этом случае используют другие протоколы in-situ гибридизации и визуализации. Отличие будет сводиться к тому, что по данным протоколам будут обрабатывать не мазки или отпечатки, а биочипы со связанными клетками.

Возможно использование радиоизотопных меток. Но данный подход не приемлем для большинства лабораторий в силу необходимости применения повышенных мер безопасности.

При наличии соответствующего оборудования и программного обеспечения представляется возможным получение трехмерного изображения связавшихся с биочипом клеток. Для этого необходимо получить серию снимков клеток, связавшихся в области каждого пятна биочипа, со смещением объектива микроскопа с определенным шагом и выполнить соответствующую компьютерную обработку изображения.

По факту связывания в том или ином пятне биочипа на каждой отдельно взятой клетке определяется только один антиген, но на разных клетках определяется множество поверхностных антигенов (равное количеству видов антител, иммобилизованных на биочипе). Если необходимо на каждой отдельно взятой клетке определить наличие более чем одного антигена, то на этапе, предшествующем гибридизации с полинуклеотидными зондами, осуществляют обработку биочипа меченными антителами, специфичными к одному или нескольким антигенам (в последнем случае используют антитела, конъюгированные с разными метками). Перед этим биочип 10 минут фиксируют в ацетоне и высушивают на воздухе. Фиксация ацетоном осуществляется только в том случае, если в нем не растворяется подложка биочипа. Может осуществляться фиксация путем обработки раствором параформальдегида в буфере или фиксация с использованием других реагентов. В некоторых случаях допустимо выполнение исследования без фиксации на данном этапе. Затем в течение 30 минут осуществляют инкубацию с соответствующим раствором антител (одного или нескольких видов) и проводят отмывку. Помимо прямого иммуноцитохимического исследования может быть выполнено исследование одним из непрямых методов, позволяющее добиться значительно большей чувствительности. (См., например, «Молекулярная клиническая диагностика. Методы». Под редакцией С.Херингтона и Дж.Макги, М.: «Мир», 1999). Необходимо, чтобы использовался один и тот же способ для визуализации результатов определения коэкспрессии антигенов и результатов in situ гибридизации с полинуклеотидными зондами (например, и в том и другом случае использовались флуорохромные метки).

Если определение нескольких полинуклеотидных последовательностей с помощью зондов (меченных разными метками) или дополнительное определение коэкспрессии нескольких антигенов с помощью нескольких видов меченных антител (меченных разными метками) по тем или иным причинам не может быть выполнено на клетках, связанных на одном биочипе, используют комплекс из нескольких биочипов.

Примеры использования изобретения.

Пример 1.

С помощью двух биочипов были исследованы опухолевые клетки, выделенные из крови больного И., 75 лет, страдающего хроническим В-клеточным лимфоцитарным лейкозом (В-ХЛЛ). Каждый биочип содержал тестовые участки с иммобилизованными антителами, специфичными к антигенам CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD16, CD19, CD20, CD22, CD23, CD56, CD44, CD45. Перед проведением анализа биочипы были закреплены в кюветах. Выделение лейкоцитарной фракции клеток осуществляли путем центрифугирования в градиенте плотности (раствор фиколла и урографина). Клетки ресуспензировали в фосфатном буфере (PBS) с добавлением инактивированной нагреванием человеческой сыворотки (15% по объему).

Затем в течение 30 минут осуществляли инкубацию биочипов с клеточной суспензией, после чего была выполнена их отмывка от не связавшихся с антителами клеток. Для этого биочипы ополаскивали изотоническим раствором NaCl, забуференным PBS. Контроль качества отмывки осуществляли с помощью инвертированного микроскопа. После этого биочипы инкубировали 15 минут в среде RPMI-1640 и трижды отмывали 0,9% раствором NaCl забуференным PBS.

Затем осуществляли фиксацию биочипов, в 4% растворе параформальдегида в течение 10 минут и дважды отмывали PBS. Затем в течение 5 минут обрабатывали раствором протеазы в кислой среде и дважды отмывали PBS. После этого проводили дегидратирование путем последовательной обработки этиловым спиртом с увеличением концентрации (70%, 85%, и абсолютный). Затем биочипы высушивание на воздухе.

Далее на поверхность биочипов наносили растворы (пробы), содержащие меченные ДНК зонды. Поверхность биочипов накрывали покровными стеклами. При этом на биочип № 1 наносили пробы для идентификации локусов на хромосомах 17р и 11q (меченные флуорохромами, дающими оранжевое и зеленое свечение соответственно). На биочип № 2 наносили пробы для идентификации локусов: 1) 12р11 (меченную флуорохромом, дающим зеленое свечение), 2) 13q14 (меченную флуорохромом, дающим оранжевое свечение) 3) 13q34 (меченную флуорохромом, дающим зелено-голубое свечение). Использовались реагенты производства фирмы «Abott-Vysis».

Осуществляли инкубацию при +78°С в течение 10 минут, а затем выдерживали при +37°С в течение ночи. Затем биочипы 2 минуты при +73 обрабатывали раствором, содержащим SSC буфер с добавлением реагента PN-40 (на 100 мл 2xSSC 20 мл, вода 80 мл, PN-40 300 мкл). Под слоем буфера аккуратно снимали покровные стекла. Затем биочипы в течение 2 минут при комнатной температуре обрабатывали раствором, также содержащим SSC буфер с добавлением реагента PN-40 (на 100 мл 2xSSC 99,9 мл, PN-40 100 мкл) и высушивали. На каждый биочип наносили каплю антифейд-раствора. Сверху прикладывали покровное стекло.

После выполнения всех манипуляций биочипы исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа. При этом получали микрофотографии каждого пятна при обычном освещении, а также при ультрафиолетовом освещении с использованием необходимых наборов светофильтров.

Выполняли микрофотографирование тестовых участков биочипа при обычном и ультрафиолетовом освещении. На микрофотографиях, выполненных при обычном освещении, на малом увеличении (увеличение объектива микроскопа х10) определяли плотность связывания клеток (количество клеток, связавшихся на участке заданной площади) в области каждого тестового участка биочипа. Исходя из этого, оценивали содержание в исследуемом образце клеток, имеющих каждый из определяемых антигенов. На микрофотографиях тестовых участков биочипа, выполненных при ультрафиолетовом освещении при большом увеличении (объектив х90) в различных полях зрения, определяли наличие клеток, имеющих искомые диагностически значимые комбинации флуоресцентных меток.

У данного больного была обнаружена трисомия хромосомы 12. Это выражалось в том, что часть клеток, связанных с биочипом № 2 имела по 3 сигнала (флуоресцирующих участка) зеленого цвета. Других генетических нарушений (диагностически значимых комбинаций меток), выявляемых с помощью данных наборов зондов (делений 17р, 11q, а также 13q14 и 13q34), обнаружено не было.

Определяли отношение количества клеток, имеющих признак трисомии 12 хромосомы, к общему числу клеток на данных микрофотографиях пятен биочипа. Исходя из этого, определяли содержание в образце клеток, имеющих соответствующий признак.

Полученные результаты приводятся на фиг.1

Пример 2.

С помощью биочипа, содержащего тот же набор иммобилизованных антител, были исследованы клетки больного П., 59 лет, имеющего диагноз «лимфома из клеток мантийной зоны». У данного больного отмечалась лейкемизация. Исследование проводилось точно так же, как это было описано в примере 1. Использовалась проба для определения транслокации t(11;14)(q13;q32). Зонд, связывающийся с геном CCND1, был конъюгирован с меткой, имеющей оранжевую флуоресценцию, а зонд, связывающийся с геном IgH, был конъюгирован с меткой, имеющей зеленую флуоресценцию.

У значительной части исследованных клеток данного больного была выявлена эта транслокация. В клетках, не имеющих данной транслокации, определялось 4 отдельных сигнала: 2 оранжевых и 2 зеленых. В клетках, имеющих данную транслокацию, отмечалось 2 желтых сигнала (слитных) и 2 раздельных сигнала - 1 зеленый и 1 оранжевый. Так же, как в примере 1, было установлено содержание клеток, экспрессирующих каждый из определяемых с помощью биочипа антигенов и при этом имеющих данный признак. Полученные результаты приводятся на фиг.2.