онкологический сенсибилизатор, содержащий глюкозамин, производные глюкозамина или их соли

Формула изобретения

1. Онкологический сенсибилизатор, содержащий соединение, выбранное из глюкозамина, производного глюкозамина, представленного следующей формулой 2:



или их соли, где онкологический сенсибилизатор ингибирует хеморезистентность раковых клеток, и

где R представляет собой ацильную группу, имеющую 2-18 атомов углерода, или алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, имеющую 1-5 атомов углерода.

2. Композиция для ингибирования хеморезистентности, содержащая соединение, выбранное из глюкозамина, производного глюкозамина, представленного следующей формулой 2:



или их соли, и фармацевтически приемлемый носитель, и где R представляет собой ацильную группу, имеющую 2-18 атомов углерода, или алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, имеющую 1-5 атомов углерода.

3. Противораковая композиция, содержащая композицию по п.2 и противораковый агент, где противораковый агент выбирают из группы, состоящей из мехлорэтамина, хлорамбуцила, фенилаланина, иприта, циклофосфамида, ифосфамида, кармустина (BCNU), ломустина (CCNU), стрептозотоцина, бусульфана, тиотепы, цисплатина, карбоплатина, дактиномицина (актиномицина D), доксорубицина (адриамицина), даунорубицина, идарубицина, митоксантрона, пликамицина, митомицина, блеомицина С, винкристина, винбластина, паклитаксела, доцетаксела, этопозида, тенипозида, топотекана и иринотекана.

4. Способ ослабления хеморезистентности, включающий введение онкологического сенсибилизатора по п.1 или композиции по п.2.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к онкологическому сенсибилизатору, содержащему глюкозамин, производное глюкозамина или их соли, а более конкретно к использованию глюкозамина, производного глюкозамина или их соли в качестве онкологического сенсибилизатора, который может сделать раковые клетки восприимчивыми к противораковым агентам и понизить стойкость раковых клеток к противораковым агентам, тем самым увеличивая терапевтическое воздействие противораковых агентов.

Уровень техники

Несмотря на их большое количество, противораковые агенты, разработанные к настоящему времени, могут излечивать полностью только немногие виды рака. Причина того, почему большинство видов рака не может излечиваться полностью, заключается в том, что рак является стойким к противораковым агентам или что опухоли уменьшаются в размерах на ранних стадиях химиотерапии, но становятся стойкими к противораковым агентам во время химиотерапии или после нее. Для эффективного лечения рака с помощью противораковых агентов, следовательно, должна быть преодолена хеморезистентность, то есть стойкость раковых клеток к химикалиям.

Глюкозамин представляет собой главный компонент хитина, структурного полисахарида, обнаруживаемого в больших количествах в экзоскелетах ракообразных, таких как оболочки морских крабов и креветок, и является безопасным для организма. Таким образом, предпринимались попытки применения глюкозамина в косметических композициях (заявка на патент Кореи № 10-2005-7014642) и для разработки терапевтических препаратов против артрита (заявки на патент Кореи № № 10-2005-009182 и 10-2004-0057849). Однако в настоящем изобретении впервые описывается, что, когда противораковые агенты вводятся вместе с глюкозамином, повышается восприимчивость раковых клеток к противораковым агентам и таким образом глюкозамин может использоваться в качестве онкологического сенсибилизатора.

Приведшие к настоящему изобретению интенсивные и тщательные исследования в области эффективной химиотерапии, осуществляемые авторами настоящего изобретения, привели к обнаружению того, что глюкозамин или его производные могут понижать хеморезистентность раковых клеток.

Описание изобретения

По этой причине целью настоящего изобретения является создание онкологического сенсибилизатора, содержащего глюкозамин, его производное или их соль.

Другой целью настоящего изобретения является создание способа разрушения хеморезистентности раковых клеток, включающего в себя введение глюкозамина, производного глюкозамина или их соли.

Кроме того, целью настоящего изобретения является создание композиции для ингибирования хеморезистентности раковых клеток, содержащей глюкозамин, производное глюкозамина или их соль в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Кроме того, еще одной целью настоящего изобретения является создание противораковой композиции, которая может ингибировать хеморезистентность раковых клеток, содержащей композицию для понижения хеморезистентности и, по меньшей мере, один противораковый агент.

Краткое описание чертежей

Указанные выше и другие цели, признаки и другие преимущества настоящего изобретения будут поняты более четко из следующего далее подробного описания, взятого в сочетании с прилагаемыми чертежами, на которых:

Фиг.1 представляет собой график, показывающий цитотоксичность противоракового агента на хеморезистентной линии клеток MCF/DOX в присутствии глюкозамина;

Фиг.2 представляет собой график, показывающий цитотоксичность противоракового агента на хеморезистентной линии клеток MDA231 в присутствии глюкозамина; и

Фиг.3 показывает воздействие глюкозамина на активность NF- B и деградацию I- B в клетках MCF7/DOX и MDA231.

Наилучший способ осуществления изобретения

В соответствии с одним из его аспектов настоящее изобретение относится к онкологическому сенсибилизатору, содержащему глюкозамин, производное глюкозамина или их соль.

Как здесь используется, термин "онкологическая сенсибилизация", как предполагается, имеет такое же значение, как "химическая сенсибилизация", включая воздействие при химиотерапии для улучшения или повышения цитотоксичности противораковых агентов на раковых клетках в присутствии вместо отсутствия онкологического сенсибилизатора, то есть воздействие понижения стойкости раковых клеток к химическим средствам, такой как хеморезистентность, с помощью онкологического сенсибилизатора для повышения терапевтического воздействия противораковых агентов. В настоящем изобретении глюкозамин или производные глюкозамина функционируют, делая раковые клетки чувствительными к противораковым агентам, и уменьшают стойкость раковых клеток к противораковым агентам, тем самым увеличивая терапевтическое воздействие противораковых агентов. По этой причине термин "онкологическая сенсибилизация" используют здесь как имеющий значение, эквивалентное "химической сенсибилизации".

Под термином "хеморезистентность", как здесь используется, подразумевается, что противораковые лекарственные средства, когда вводятся, вообще не могут уничтожать раковые клетки или могут регулировать раковые клетки только до небольшой степени в основном из-за стойкости раковых клеток к химическим лекарственным средствам. В целом, термин "стойкость к химическим лекарственным средствам", как предполагается, означает, что, когда пациенты, больные раком, лечатся с помощью противораковых лекарственных средств, терапевтических воздействий нет, или терапевтическое воздействие противораковых лекарственных средств, хотя и является высоким на ранних стадиях химиотерапии, во все большей степени ослабляется при непрерывном лечении. В данной области хорошо известно, что терапевтическое воздействие противораковых лекарственных средств постепенно уменьшается при увеличении количества его введений. Хеморезистентность приписывается появлению стойких к лекарственным средствам клеток.

Глюкозамин представляет собой главный компонент хитина, структурного полисахарида, обнаруживаемого в больших количествах в экзоскелетах ракообразных, таких как оболочки морских крабов и креветок. Вместе с хитином хитозан представляет собой главный структурный компонент экзоскелетов. Хитин представляет собой полимер, состоящий из 2-ацетамидо-2-дезокси- -D-глюкозы (N-ацетилглюкозамины), и хитозан представляет собой поли( -(1,4)-глюкозамин), полисахарид, который может быть получен посредством деацетилирования хитина. Глюкозамин имеет структуру, представленную следующей далее химической формулой 1.

Химическая формула 1

Как здесь используется, термин "производное глюкозамина", как предполагается, относится к глюкозамину, имеющему ацильный или алкильный остаток, замещающий водород гидроксильной группы, как представлено следующей далее химической формулой 2.

Химическая формула 2

где R представляет собой C2-C18 ацил или C1-C5 алкил с прямой или разветвленной цепью. Предпочтительно, R выбирается из ацильной группы, состоящей из ацетила, пропионила, бутирила, пентаноила, гексаноила, гептаноила, октаноила, нонаноила, деканоила, ундеканоила, лаурила, тридеканоила, миристила, пентадеканоила, пальмитоила, маргарила и стеарила, или из алкильной группы, состоящей из метила, этила, пропила, бутила, пентила, изопропила, изобутила и втор-бутила.

Как описано выше, введение гидрофобных групп в группы спиртов глюкозамина в положениях 1, 3, 4 и 6 без изменений в аминовой группе, которая, как предполагается, является ответственной за физиологическую активность глюкозамина, приводит к получению производных глюкозамина, которые хорошо разлагаются естественным путем, являются нетоксичными, хорошо адсорбируют тяжелые металлы и являются сильными ингибиторами для бактерий, в то же время сохраняя их собственную физиологическую активность.

Обнаружено, что, когда противораковый агент вводится в сочетании с глюкозамином, раковые клетки, которые демонстрируют хеморезистентность, индуцируются, чтобы они подвергались апоптозу в два раза чаще, чем когда он вводится сам по себе, как видно на фигурах 1 и 2. Эти результаты демонстрируют, что глюкозамин и его производные осуществляют онкологическую сенсибилизацию.

Непонятный по существу механизм онкологической сенсибилизации у глюкозамина и его производных предположительно приписывается ингибиторной активности против фермента или ферментов, играющих критическую роль в обострении раковых заболеваний. То есть предполагается, что глюкозамин или его производные ингибируют ферментативную активность, ответственную за злокачественность рака, уменьшая факторы, играющие роль при хеморезистентности, тем самым делая раковые клетки восприимчивыми к противораковым лекарственным средствам.

Не накладывается конкретных ограничений на вид ракового заболевания, для которого глюкозамин или производные глюкозамина могут использоваться в качестве онкологического сенсибилизатора. То есть глюкозамин или производные глюкозамина могут эффективно применяться для лечения рака независимо от вида рака. По этой причине вид рака, к которому может применяться композиция, содержащая противораковое лекарственное средство и глюкозамин или его производное или соль в соответствии с настоящим изобретением, зависит от противоракового лекарственного средства. Например, глюкозамин, производные глюкозамина или их соли могут использоваться в качестве онкологического сенсибилизатора в сочетании с цисплатином для лечения рака яичка, рака яичников, рака легких, рака головы и шеи, опухоли шейного отдела спинного мозга, нейробластомы, остеосаркомы и тому подобного в сочетании с доксорубицином для лечения рака груди, эндометриального рака, рака головы и шеи, саркомы Юинга, остеосаркомы, лейкемии и тому подобного в сочетании с этопозидом для лечения рака легких, рака яичка, остеосаркомы, лейкемии, нейробластомы и тому подобного.

В композиции по настоящему изобретению глюкозамин или производные глюкозамина могут находиться в форме фармацевтически приемлемых солей. Примеры фармацевтически приемлемых солей, полезных в настоящем изобретении, включают в себя сульфаты, гидрохлораты, ацетаты, цитраты и малеаты глюкозамина или производных глюкозамина, но без ограничения. Предпочтительными являются сульфаты глюкозамина или производных глюкозамина.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция может дополнительно содержать антиоксидант для поддержания стабильности фармацевтически приемлемых солей глюкозамина или производных глюкозамина и для предотвращения окисления аминогруппы или фармацевтически приемлемую соль металла, предпочтительно соль натрия или калия и глюкозамина или производных глюкозамина.

В соответствии с другим его аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования хеморезистентности (повышения химической сенсибилизации), содержащей глюкозамин, производное глюкозамина или их соль и фармацевтически приемлемый носитель. Эта композиция может приготавливаться вместе с носителем в виде дозированных форм. Примеры пероральных дозированных форм, пригодных для фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают в себя таблетки, пастилки, лепешки, водные или эмульсифицированные суспензии, порошок, гранулы, эмульсии, твердые или мягкие капсулы, сиропы и эликсиры, но без ограничения. Пригодными для приготовления таблеток или капсул фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением являются связующее вещество, такое как лактоза, сахароза, сорбитол, маннитол, крахмал, амилопектин, целлюлоза или желатин, вспомогательное вещество, такое как дикальций фосфат, разрыхлитель, такой как кукурузный крахмал или крахмал батата, и смазывающее вещество, такое как стеарат магния, стеарат кальция, натрий стеарилфумарат или воск полиэтиленгликоля, сами по себе или в сочетании. Для капсул жидкий носитель, такой как липид, может дополнительно использоваться в дополнение к рассмотренным выше соединениям.

Для неперорального введения фармацевтическая композиция, содержащая глюкозамин или производные глюкозамина в соответствии с настоящим изобретением может приготавливаться в виде инъекций для внутривенного или внутримышечного способа введения, суппозиториев или спреев, вдыхаемых через респираторный тракт, таких как аэрозоли. Препараты для инъекций могут быть получены посредством растворения или суспендирования глюкозамина или его производного вместе со стабилизатором или буфером в воде и упаковки раствора или суспензии в стандартных единичных ампулах или флаконах. Суппозитории, как правило, изготавливают из основы для суппозитория, такой как масло какао или другой глицерид, или терапевтическое слабительное, в котором разбавляют активное вещество, то есть глюкозамин или его производное. Для спреев, таких как аэрозоль, пропеллент для распыления диспергированного в воде концентрата или смачиваемого порошка может использоваться в сочетании с добавкой.

В соответствии с его дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к противораковой композиции, содержащей противораковый агент и фармацевтическую композицию. Термин "противораковый агент" или "противораковое лекарственное средство", как здесь используется, предназначен для упоминания химического средства, которое может уничтожать раковые клетки. Большинство противораковых агентов или лекарственных средств играют критическую роль в блокировании и репликации, транскрипции и/или трансляции ДНК в раковых клетках. Вид противоракового агента или лекарственного средства, который может использоваться в композиции по настоящему изобретению, не является как-либо ограниченным. Противораковые агенты или лекарственные средства могут выбираться по стандартным соображениям, таким как вид раковых клеток, скорость поглощения лекарственного средства (период времени лечения и способ введения), положение и размер опухолей и тому подобное. Например, противораковые агенты, пригодные для использования в настоящем изобретении, могут представлять собой агенты для алкилирования ДНК, такие как мехлорэтамин, хлорамбуцил, фенилаланин, иприт, циклофосфамид, ифосфамид, кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), стрептозотоцин, бусульфан, тиотепа, цисплатин и карбоплатин. Противораковые антибиотики также используются в настоящем изобретении, например дактиномицин (актиномицин D), доксорубицин, митоксантрон, пликамицин, митомицин и блеомицин С. Примеры растительных алкалоидов в качестве противораковых агентов или лекарственных средств, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают в себя винкристин, винбластин, паклитаксел, доцетаксел, этопозид, тенипозид, топотекан и иринотекан. Однако противораковые агенты или лекарственные средства, пригодные для использования в настоящем изобретении, не ограничиваются приведенными выше соединениями.

В соответствии с еще одним его аспектом настоящее изобретение относится к способу повышения восприимчивости раковых клеток к противораковым лекарственным средствам посредством введения онкологического сенсибилизатора, содержащего глюкозамин, производное глюкозамина или их соль.

Термин "введение", как здесь используется, предназначен для упоминания введения онкологического сенсибилизатора по настоящему изобретению пациентам с раковым заболеванием соответствующим способом. Постольку поскольку он приводит онкологический сенсибилизатор к желаемой ткани, может быть принят любой способ введения. Например, введение онкологического сенсибилизатора может использовать пероральный, внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, чрескожный, подкожный, интраназальный, интрапульмонарный, ректальный, интратекальный и/или интрадуральный способы, но не ограничиваясь этим. Онкологический сенсибилизатор в соответствии с настоящим изобретением может вводиться одновременно с противораковым агентом или лекарственным средством или отдельно от него. В последнем случае онкологический сенсибилизатор может вводиться через заданные интервалы времени до или после введения противоракового агента. Предпочтительно, онкологический сенсибилизатор может вводиться после противораковых агентов. Онкологический сенсибилизатор по настоящему изобретению может вводиться один раз в день, или два, или три раза в день через заданные интервалы.

При рассмотрении различных факторов, включая виды рака, способы введения, терапевтические воздействия и химическую сенсибилизацию, онкологический сенсибилизатор или противораковая композиция в соответствии с настоящим изобретением может вводиться соответствующим образом.

Лучшее понимание настоящего изобретения может быть получено с помощью следующих далее примеров, которые приводятся для иллюстрации, но не должны рассматриваться в качестве ограничений настоящего изобретения.

Пример 1: Приготовление клеток, стойких к противораковому лекарственному средству, и их культуры

Линию клеток рака груди человека MDA-231 (стойкую к доксорубицину) покупают у ATCC. MCF-7/DOX (стойкую к доксорубицину) получают от Dr. Kenneth H. Cowan (University of Nebraska Medical Center, 986805 Nebraska Medical Center, Omaha, NE 68198-6805, USA). Эти линии клеток поддерживают в средах, дополненных 10% фетальной сывороткой теленка (Gibco BRL), 1 мМ пирувата натрия (Gibco BRL) и 100 ед./мл пенициллина-стрептомицина (Gibco BRL) при 37°C во влажной атмосфере, 5% CO₂, и субкультивируют каждые два или три дня.

Пример 2: Анализ цитотоксичности

Анализ с помощью MTT осуществляют посредством колориметрического анализа при восстановлении желтой соли тетразолия до пурпурного формазана в митохондриях жизнеспособных клеток. Клетки высевают при популяции 1×10⁵ клеток/лунка в 24-луночных планшетах. После инкубирования в течение 24 часов клетки экспонируют для доксорубицина. Этот противораковый агент вводят при дозе 90 мкМ для MCF 7/DOX и 5 мкМ для MDA 231. Контроль не обрабатывают доксорубицином. В день анализа культурную среду в каждой лунке заменяют свежей средой, содержащей MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий) (Sigma) при концентрации 0,5 мг на мл с последующим инкубированием в ней в течение дополнительных 4 часов. После удаления среды добавляют 500 мкл ДМСО в каждую лунку, и кристаллы формазана растворяют с использованием орбитального шейкера. Выживаемость клеток представляют как процент исследуемой группы по отношению к контролю. Эти эксперименты осуществляют для трех образцов и повторяют, по меньшей мере, три раза. Для каждого эксперимента приводится среднее для трех независимых экспериментов и стандартные отклонения.

Пример 3: Воздействие глюкозамина на восприимчивость к противораковому агенту

Анализ с помощью MTT осуществляют для исследования того, повышает ли глюкозамин восприимчивость клеток рака груди к противораковым агентам. Линии клеток MCF 7/DOX и MDA 231 обе являются стойкими к противораковым агентам, их обрабатывают доксорубицином и глюкозамином (1,0-10 мМ) в течение 24 часов.

Контроли не обрабатывают глюкозамином, в то время как доксорубицин вводят при концентрациях 5 мкМ для MDA-MB 231 и при концентрациях 90 мкМ для MCF-7/DOX.

Как измеряется посредством анализа с помощью MTT, почти все MCF 7 и MDA 468, оба они восприимчивы к противораковому агенту, погибают, при этом апоптоз имеет место примерно у 50% линий клеток, стойких к противораковым агентам. При обработке глюкозамином линии клеток MCF 7/DOX и MDA 231 становятся в два раза (более чем в два раза = три раза) более восприимчивыми к доксорубицину, чем без обработки глюкозамином.

Пример 4: Воздействие глюкозамина на активность NF- B и I- B

Линии клеток MCF7/DOX и MDA231 культивируют в средах, дополненных 10% фетальной сыворотки теленка (Gibco BRL), 1 мМ пирувата натрия (Gibco BRL) и 100 ед./мл пенициллина-стрептомицина (Gibco BRL) при 37°C во влажной атмосфере, 5% CO₂ . Вектор pNF- B-SEAP трансфицируют в клетки. Через 24 часа после трансфицирования клетки культивируют в присутствии или в отсутствие глюкозамина (представлен GM, 5 мМ) в течение 24 часов. Культуру клеток подвергают анализу SEAP, и клетки после харвестирования подвергают анализу на -галактозидазу. Значения, полученные в течение анализа SEAP, корректируют для эффективности трансфицирования с помощью плазмиды pGAL (1 мкг). Активность -галактозидазы измеряют для коррекции активности SEAP. Анализ SEAP осуществляют в соответствии с процедурой, приведенной производителем (BD Biosciences Clontech, Co.). Как обнаружено, MCF7/DOX и MDA231 имеют высокие проценты экспрессии TGазы 2. Результаты этого анализа показаны на Фиг.3A. Эти эксперименты осуществляют на трех образцах и повторяют, по меньшей мере, три раза. Значения для каждого эксперимента представляют собой среднее от трех независимых экспериментов и стандартные отклонения.

Глюкозамин анализируют на его воздействие на деградацию I- B . Для этого клетки MCF7/DOX и MDA231 культивируют в течение 1 часа и фракции цитоплазмы собирают для Вестерн-блоттинга по отношению к I- B . Результаты Вестерн-блоттинга показаны на верхней панели Фиг.3B. Вестерн-блоттинг определяют количественно с использованием денситометра, и результаты показаны на нижней панели на фигуре 3B. Для каждого значения приводятся среднее для трех независимых экспериментов и стандартные отклонения.

Введение глюкозамина, как понятно из данных на фигурах 3, заставляет линии клеток рака груди человека (MDA-231, MCF-7/DOX) уменьшать активность NF- B и увеличивать уровень I- B , и это показывает, что хеморезистентные линии клеток восприимчиво реагируют на противораковые агенты в момент гибели, когда глюкозамин индуцирует уменьшение активности NF- B (фигуры 2 и 3).

Промышленное применение

Как описано ранее, глюкозамин, встречающийся в природе, безвредный материал, или производные глюкозамина могут использоваться в качестве онкологического сенсибилизатора, который делает раковые клетки в высшей степени восприимчивыми к противораковым агентам без оказания конкретных побочных воздействий, в противоположность обычным химическим сенсибилизаторам.

Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны для иллюстративных целей, специалисты в данной области заметят, что возможны различные модификации, дополнения и замены, без отклонения от рамок и духа настоящего изобретения, как описывается в прилагаемой формуле изобретения.