способ выявления орнитобактериоза у сельскохозяйственной птицы

Формула изобретения

1. Способ выявления орнитобактериоза у сельскохозяйственной птицы, включающий отбор проб биоматериала, выделение ДНК и выявление геномной ДНК Ornithobacterium rhinotracheale с помощью ПЦР с использованием специально подобранных праймеров с последующей детекцией продуктов реакции, отличающийся тем, что для выявления геномной ДНК в ПЦР используют два праймера: прямой 5'-TGGGATTACCGCAAAATACC-3' и обратный 5'-AAACGGAGTGGTTACGCTCA-3 и при выявлении амплификационного фрагмента ДНК размером 142 п.н. делают заключение о наличии геномной ДНК Ornithobacterium rhinotracheale в исследуемой пробе.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что продукты ПНР анализируют с помощью электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к способам контроля инфицированности сельскохозяйственной птицы бактериальными инфекциями.

Известен способ выявления орнитобактериоза (Ornithobacterium rhinotracheale), включающий выделение чистой культуры из патологического материала и последующую идентификацию бактерий с использованием биохимических тестов и специфических сывороток (Paul van Empel, Han Van den Bosch, Peter Loeffen and Paul Storm «Identification and Serotyping of Ornithobacterium rhinotracheale» / Journal of clinical microbiology, Feb. 1997, p.418-421). Однако данный способ технически трудоемок и предназначен для идентификации уже выделенной чистой культуры.

Наиболее ближайшим по технической сущности к заявляемому способу - прототипом является способ выявления Ornithobacterium rhinotracheale, включающий отбор проб биоматериала, выделение чистой культуры, выделение геномной ДНК и проведение ПЦР с использованием универсальных олигонуклеотидных праймеров с последующей идентификацией вида и штамма бактерий на основе анализа результатов фингерпринтинга (Alongkorn Amonsin, James F.X. Wellehan, Ling-Ling Li, Peter Vandamme, Cynthia Lindeman, Marilyn Edman, Robert A. Robinson and Vivek Kapur «Molecular Epidemiology of Ornithobacterium rhinotracheale» / Journal of clinical microbiology, nov.1997, p.2894-2898, vol.35, no.11).

Известный способ основан на неспецифической амплификации фрагментов геномной ДНК микроорганизма Ornithobacterium rhinotracheale. Недостатком известного способа является его сложность и многостадийность, необходимость предварительного выделения чистой культуры, невозможность количественной оценки орнитобактериоза, в связи с чем он не может быть использован в практической ветеринарной медицине. Низкая специфичность используемого способа связана с вероятностью появления неспецифических положительных реакций, обусловленных синтезом неспецифических амплификационных фрагментов (ампликонов), а использование неспецифических праймеров требует использования ДНК чистой культуры Ornithobacterium rhinotracheale без примесей посторонней ДНК.

Технической задачей заявляемого решения является упрощение способа и повышение его специфичности, а также расширение его функциональных возможностей.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Пробы биоматериала кур или индеек с патологическими изменениями выделяют любым пригодным для последующей постановки ПЦР способом. Выделение ДНК производят любым известным способом, например стандартным силико-сорбционным методом.

Для постановки ПЦР реакцию проводят на любом амплификаторе с использованием канала с заданным температурным режимом. В реакции используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями:

прямой 5'-TGGGATTACCGCAAAATACC-3',

обратный 5'-AAACGGAGTGGTTACGCTCA-3'

ПЦР проводят в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис- НСl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl2; 0,01% Твин 20; 0,2 мM дНТФ; 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, прямой 5'-TGGGATTACCGCAAAATACC-3', обратный 5'-AAACGGAGTGGTTACGCTCA-3' и 1ED Taq-полимеразы. Реакцию проводят на любом реалтайм-амплификаторе с начальной денатурацией при 95°С 3 мин, далее в течение 45 циклов с денатурацией при 95°С 10 сек, отжигом при температуре 65°С в течение 10 сек и синтезом при 72°С 10 сек. Финальная элонгация проводилась при 72°С 3 мин.

Продукты ПЦР анализируют при помощи электрофореза в 6% полиакриламидном геле и при выявлении амплифицикационного фрагмента ДНК (ампликона) с длиной 142 п.н. делают заключение о наличии геномной ДНК Ornithobacterium rhinotracheale в исследуемой пробе.

Для количественного выявления геномной ДНК Ornithobacterium rhinotracheale в ПЦР смесь вносят краситель SibrGreen II из расчета 0,5 мкл на пробу, при этом количество геномной ДНК Ornithobacterium rhinotracheale проверяют в сравнении со стандартными образцами с заведомо известными концентрациями бактерий путем сравнения Ct у контрольных и опытных образцов.

Способ обеспечивает высокую чувствительность и специфичность к микроорганизму Ornithobacterium rhinotracheale, что позволяет достоверно определять наличие последнего в исследуемых пробах.

Определяющим отличием заявляемого способа от прототипа является то, что для выявления геномной ДНК микроорганизма Ornithobacterium rhinotracheale в ПЦР используют два праймера: прямой 5'-TGGGATTACCGCAAAATACC-3' и обратный 5'-AAACGGAGTGGTTACGCTCA-3', что позволяет получить более короткий ампликон (амплификационный фрагмент ДНК размером 142 п.н.), обеспечивающий повышение эффективности протекания реакции (ПЦР).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Осуществление заявленного способа проводили в производственных условиях 4-х птицефабрик, на которых отмечалась повышенная смертность птицы в возрасте 90-120 суток.

При микроскопии мазков отпечатков с печени, селезенки и легких, окрашенных по Леффлеру метиленовым синим, отмечалось наличие тонких неоднородно окрашенных палочек. При окраске по Грамму палочки были грамотрицательными.

При патогистологических исследованиях патологического материала в легких фиксировали острую серозно-фибринозную пневмонию, пораженная ткань была инфильтрирована гетерофилами. В селезенке, помимо признаков спленита, отмечалось наличие очаговых некрозов в сочетании с локализацией бактерий в этих же участках.

Всего было обследовано 4 птицефабрики. От птицы, павшей на обследуемых птицефабриках, был отобран биоматериал - пробы легких, печени, селезенки (35 проб). Дополнительно были взяты образцы от птицы на птицефабрике, где не наблюдалось вышеупомянутых изменений (10 проб легких). Выявление орнитобактериоза проводили заявляемым способом.

Выделение ДНК из проб патологического материала проводили стандартным силико-сорбционным методом.

ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис. - НСl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl2; 0,01% Твин 20; 0,2 мM дНТФ; 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, прямой 5'-TGGGATTACCGCAAAATACC-3', обратный 5'-AAACGGAGTGGTTACGCTCA-3' и 1ED Taq-полимеразы. Реакцию проводили на амплификаторе «Терцик» с начальной денатурацией при 95°С 3 мин, далее в течение 45 циклов с денатурацией при 95°С 10 сек, отжигом при температуре 65°С в течение 10 сек и синтезом при 72°С 10 сек. Финальная элонгация проводилась при 72°С 3 мин.

Анализ результатов исследования проводили путем оценки размеров амплифицированных фрагментов ДНК (ампликонов), полученных методом электрофореза в 6% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием водным раствором бромистого этидия, и при выявлении ампликона с длиной 142 п.н. делали заключение о наличии геномной ДНК Ornithobacterium rhinotracheale в исследуемой пробе.

В результате во всех пробах патологического материала, отобранных на неблагополучных птицефабриках (35 проб), были обнаружены положительные образцы, а на благополучной птицефабрике все 10 проб были отрицательными.

Таким образом, предлагаемый способ обладает достаточной специфичностью для массовой диагностики и мониторинга орнитобактериоза сельскохозяйственной птицы.

Пример 2

Для изучения специфичности предложенного способа использовали пробы биоматериала от птицы, инфицированной Ornithobacterium rhinotracheale (что было установлено на основании результатов патологоанатомического вскрытия и иммуноферментного анализа), пробы ДНК культур Pasteurella multocida, Pseudomonas sp.. Bacillus pumilus, Echerichia coli, Salmonella enterica.

Выделение ДНК из проб патологического материала проводили стандартным силико-сорбционным методом.

ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис. - НСl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl2; 0,01% Твин 20; 0,2 мM дНТФ; 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, прямой 5'-TGGGATTACCGCAAAATACC-3', обратный 5'-AAACGGAGTGGTTACGCTCA-3' и 1ED Taq-полимеразы. Реакцию проводили на амплификаторе «Терцик» с начальной денатурацией при 95°С 3 мин, далее в течение 45 циклов с денатурацией при 95°С 10 сек, отжигом при температуре 65°С в течение 10 сек и синтезом при 72°С 10 сек. Финальная элонгация проводилась при 72°С 3 мин.

По окончании ПЦР пробы исследовали методом вертикального электрофореза в 6% полиакриламидном геле и при выявлении амплицированного фрагмента ДНК размером 142 п.н. делали заключение о наличии геномной ДНК Ornithobacterium rhinotracheale в исследуемой пробе.

Результаты исследования отражены в таблице 1.

Таблица 1
Вид биоматериала	Результат ПНР
Pasteurella multocida	Отрицательно
Pseudomonas sp.	Отрицательно
Bacillus pumilus	Отрицательно
Echerichia coli	Отрицательно
Salmonella enterica	Отрицательно
Проба легких от птицы, инфицированной Ornithobacterium rhinotracheale	Положительно
Проба селезенки от птицы, инфицированной Ornithobacterium rhinotracheale	Положительно
Проба печени от птицы, инфицированной Ornithobacterium rhinotracheale	Положительно
Отрицательный контроль	Отрицательно

Из таблицы 1 видно, что способ обладает достаточной специфичностью.

Дополнительно для проверки специфичности положительной реакции образцы амплификационных фрагментов подвергали рестрикции рестриктазой Alu1. Электрофорез позволил обнаружить фрагменты рестрикции размерами 90 и 52 п.н., что соответствовало расчетам.

Пример 3

С целью проверки эффективности использования предложенных оптимальных праймеров для количественного определения концентрации Ornithobacterium rhinotracheale при постановке ПЦР в режиме реального времени с красителем SibrGreen проводили следующий эксперимент. Пробу ДНК из патологического материала, содержащую ДНК Ornithobacterium rhinotracheale в количестве 1×10⁶ ГЕ/мл раститровывали в ТЕ буфере с шагом 1:10. Получившиеся разведения вносили в ПЦР планшету в 3-х повторах каждое. ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис- HCl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl2; 0,01% Твин 20; 0,2 мM дНТФ; 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, прямой 5'-TGGGATTACCGCAAAATACC-3', обратный 5'-AAACGGAGTGGTTACGCTCA-3' и 1ED Taq-полимеразы, 0,5 мкл SibrGreen II. Реакцию проводили в реалтайм амплификаторе с температурным режимом, отраженным в таблице 2.

Таблица 2
№ п/п	Температура, °С	Время, сек	Наименование этапа
1	92	10	Денатурация
2	65	10	Отжиг
3	80	15	Элонгация
4	85	2	Чтение на канале РАМ
Количество циклов	Х42

Изучение линейности теста с раститрованным контрольным образцом показало высокую линейность в диапазоне от 1×10¹ ГЕ/5 мкл до 1×10⁴ ГЕ/5 мкл. Зависимость Ct от концентрации геномной ДНК Ornithobacterium rhinotracheale в пробе составила r=0.99. Полученные данные свидетельствуют о том, что используемые праймеры обеспечивают высокую эффективность протекания реакции (ПЦР).

Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для массовой диагностики и мониторинга орнитобактериоза сельскохозяйственной птицы.