синергетическая антимикробная система

Формула изобретения

1. Антимикробная композиция для консервирования пищевых продуктов, включающая количество низина и -поли-L-лизина, эффективное для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевом продукте на порядок 1 log или менее через 3 дня после добавления антимикробной композиции к пищевому продукту при температуре от 0 до 50°С.

2. Антимикробная композиция по п.1, включающая от 5 до 10 млн^-1 низина и от 10 до 1000 млн^-1 -поли-L-лизина.

3. Антимикробная композиция по п.1, в которой -поли-L-лизин имеет структуру



где n равно от 25 до 35.

4. Антимикробная композиция для консервирования пищевых продуктов по п.1, включающая количество -поли-L-лизина, эффективное для поддержания активности низина в пищевом продукте 90% или более от начальной активности низина через 14 дней после добавления антимикробной композиции к пищевому продукту, где начальная активность низина выражена в МЕ/г.

5. Пищевой продукт, включающий количество низина и -поли-L-лизина, эффективное для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевом продукте на порядок 1 log или менее через 3 дня после добавления низина и -поли-L-лизина к пищевому продукту при температуре от 0 до 50°С.

6. Пищевой продукт по п.5, где пищевой продукт включает количество -поли-L-лизина, эффективное для поддержания активности низина в пищевом продукте 90% или более от начальной активности низина через 14 дней после добавления антимикробной композиции к пищевому продукту, где начальная активность низина выражена в МЕ/г.

7. Пищевой продукт по п.5, включающий 5-10 млн ^-1 низина и 10-1000 млн^-1 -поли-L-лизина от веса пищевого продукта.

8. Пищевой продукт по п.5, в котором -поли-L-лизин имеет структуру



где n равно от 25 до 35.

9. Пищевой продукт по п.5, где пищевой продукт выбран из группы, состоящей из приправ, соусов, маринадов, молочных продуктов, пастообразных продуктов, маргарина, мяса, макаронных изделий, лапши, готового риса, рисового пудинга, овощей и напитков.

10. Способ предотвращения увеличения микробных чисел в пищевом продукте, включающий смешивание низина и -поли-L-лизина с пищевым продуктом в количестве, эффективном для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевом продукте на порядок 1 log или менее через 3 дня после добавления антимикробной композиции к пищевому продукту.

11. Способ по п.10, в котором низин и -поли-L-лизин добавляют к пищевому продукту вместе.

12. Способ по п.10, в котором низин и -поли-L-лизин добавляют к пищевому продукту отдельно.

13. Способ по п.10, в котором низин и -поли-L-лизин являются эффективными для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевом продукте, имеющем температуру от 0 до 50°С.

14. Способ по п.10, в котором количество низина от 5 до 10 млн^-1 и количество -поли-L-лизина от 10 до 1000 млн^-1 от общего веса пищевого продукта.

15. Способ по п.10, в котором -поли-L-лизин имеет структуру



где n равно от 25 до 35.

16. Способ по п.10, где пищевой продукт выбран из группы, состоящей из приправ, соусов, маринадов, молочных продуктов, пастообразных продуктов, маргарина, мяса, макаронных изделий, лапши, готового риса, рисового пудинга, овощей и напитков.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к антимикробной композиции, эффективной для предотвращения роста микробиологических загрязняющих веществ в пищевых продуктах. Более конкретно предлагается антимикробная композиция, которая представляет собой смесь низина и -поли-L-лизина. Низин и -поли-L-лизин действуют синергетически для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевых продуктах.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящее время технологи пищевой промышленности используют множество физических, химических и биологических процессов и средств для консервирования пищи. Существует много химических композиций, которые убивают или ингибируют бактерии и/или другие микроорганизмы, таким образом консервируя пищу и предотвращая порчу.

Консервирование пищи ингибированием роста микробиологических загрязняющих веществ часто является трудным. Химическая композиция, добавленная к пищевым продуктам, должна быть эффективной для предотвращения увеличения микробного числа и не должна придавать пище нежелательные запахи или нежелательные органолептические свойства. Две композиции, как известно, используемые отдельно в пищевых продуктах для ингибирования роста микроорганизмов, представляют собой низин и -поли-L-лизин.

Низин представляет собой пептидоподобное антибактериальное вещество, продуцируемое микроорганизмами, такими как Lactococcus lactis subsp. lactis (ранее известный как Streptococcus lactis). Его использовали для улучшения стабилизации различных пищевых продуктов, и его структура показана в патенте США 5527505 Yamauchi et al. Препараты низина с самой высокой активностью содержат приблизительно 40 миллионов международных единиц (МЕ) на грамм. Как известно, низин не обладает токсичным воздействием на людей и широко используется в различных приготовленных молочных продуктах.

Также было описано использование низина при консервировании других пищевых продуктов. Подробности данных применений описаны в патенте США № 5527505 ( Process for the Manufacture of Fermented Milk ); патенте США № 5015487 ( Use of Lanthionines for Control of Postprocessing Contamination in Processed Meat ); Chung et al. (Appl. Envir. Microbiol., 55, 1329-1333 (1989)); патенте США № 4584199 ( Antibotulinal Agents for High Moisture Process Cheese Products ), Muriana et al. (J. Food Protection, 58:1109-1113 (1995)); патенте США № 6136351 ( Stabilization of Fermented Dairy Compositions Using Whey from Nisin-Producing Cultures ); патенте США № 6113954 ( Stabilization of Mayonnaise Spreads Using Whey from Nisin-Producing Cultures ); патенте США № 6110509 ( Stabilization of Cream Cheese Compositions Using Nisin-Producing Cultures ); патенте США № 6242017 ( Stabilization of Cooked Meat and Vegetable Compositions Stabilized by Nisin-Containing Whey and Methods of Making ); патенте США № 6613364 ( Stabilization of Cooked Meat and Vegetable Compositions Using Whey From Nisin-Producing Cultures and Products Thereof ); заявка на патент США порядковый номер 09/779756 ( Stabilization of Cooked Pasta Compositions Using Whey From Nisin-Producing Cultures ); Scott V. N. and Taylor S. L. Effect of nisin on the outgrowth of Clostridium botulinum spores J. Food Sci., 46: 117-120 (1981); Scott V. N. and Taylor S. L. Temperature, pH and spore load effects on the ability of nisin to prevent the outgrowth of Clostridium botulinum spores J. Food Sci., 46:121-126 (1981); и Broughton, J.D. Nisin and its uses as a food preservative. Food Technology, 11, 100-17 (1990). Данные патенты и ссылки включены в описание в виде ссылок.

Антибактериальное действие -поли-L-лизина хорошо известно. -Поли-L-лизин использовали для предотвращения пролиферации микроорганизмов в пище смешиванием его с пищей или непосредственно напылением его на пищу (патент США № 5759844). Однако в случае непосредственного добавления -поли-L-лизина в пищу его количество в основном ограничивается приблизительно 100 мг на кг пищи или менее, так как более высокие количества неблагоприятно действуют на вкус пищи и физические свойства.

Способы получения -поли-L-лизина и его использование описаны в патенте США № 6294183 ( Antimicrobial Resin Composition and Antimicrobial Resin Molded Article Comprising Same ); патенте США № 5294552 ( Stain mass-producing -poly-L-lysine ); патенте США № 5434060 ( Method for Producing -poly-L-lysine ); патенте США № 5759844 ( Antibacterial Articles and Methods of Producing the Articles ); патенте США № 5900363 ( Process for producing -poly-L-lysine with immobilized Streptomyces albulus ); патенте США № 5453420 ( Food preservative and production thereof ); патенте США № 5009907 ( Method for Treating Food to Control the Growth of Yasts ); патенте США № 4597972 ( Nisin as an Antibotulinal Agent for Food Products ) и патенте США № 4584199 ( Antibotulinal Agents for High Moisture Process Cheese Products ). Данные патенты включены в описание в виде ссылок.

Существует необходимость в композициях, которые могут быть добавлены к пищевым продуктам, которые являются эффективными для консервирования пищи и предотвращения порчи без неблагоприятного воздействия на вкус пищи и физические свойства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагается антимикробная композиция, которая включает эффективное для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевом продукте количество низина и -поли-L-лизина. Низин и -поли-L-лизин действуют синергетически для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевых продуктах без воздействия на вкус пищи и физические свойства. Данная синергетическая антимикробная композиция может быть использована для ингибирования общеизвестных пищевых патогенов и микроорганизмов, вызывающих порчу, таких как Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Streptococcus spp. и т.д. Данные, приведенные в примерах, показали, что композиция особенно эффективна против пищевых патогенов C. botulinum и бактерии, вызывающей порчу Lactobacillus plantarum. Во многих случаях (см. примеры), где низин и -поли-L-лизин особенно неэффективны при использовании отдельно, комбинация обеспечивает очень эффективную антимикробную композицию.

Комбинация низина и -поли-L-лизина является эффективной для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевых продуктах приблизительно на порядок 1 log или менее через приблизительно 3 дня. Комбинация также обладает бактерицидным действием в некоторых пищевых системах, так как она является эффективной для снижения микробных чисел в некоторых пищевых продуктах до 1 КОЕ/г или менее через 5 дней. Антимикробная композиция включает по меньшей мере приблизительно 1 часть на миллион (чнм) низина и, по крайней мере, приблизительно 10 чнм -поли-L-лизина по отношению к весу антимикробной композиции. Важным аспектом изобретения является то, что антимикробная композиция включает приблизительно от 1 до приблизительно 100 чнм, предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 10 чнм низина, и приблизительно от 10 до приблизительно 1000 чнм, предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 500 чнм -поли-L-лизина, от веса антимикробной композиции. Концентрация низина также может быть рассчитана в международных единицах на г (МЕ/г) при 1 чнм низина, соответствующей 40 МЕ/г.

Другим аспектом является предложение антимикробной композиции, которая включает количество низина и -поли-L-лизина, эффективное для поддержания активности низина в пищевом продукте через приблизительно 14 дней приблизительно 90% или более от начальной активности низина. Антимикробная композиция включает по меньшей мере приблизительно 1 чнм низина и, по крайней мере, приблизительно 10 чнм -поли-L-лизина по отношению к весу антимикробной композиции. Важным аспектом изобретения является то, что антимикробная композиция включает от приблизительно 1 до приблизительно 100 чнм, предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 10 чнм низина, и от приблизительно 10 до приблизительно 1000 чнм, предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 500 чнм -поли-L-лизина, от веса антимикробной композиции.

Низин и -поли-L-лизин могут быть включены в пищевые продукты либо как смесь, либо отдельно. Пищевой продукт включает количество низина и -поли-L-лизина, эффективное для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевом продукте приблизительно на порядок 1 log или менее через приблизительно 3 дня. В данном аспекте пищевой продукт может включать, по крайней мере, приблизительно 1 чнм низина, предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 10 чнм низина, и, по крайней мере, приблизительно 10 чнм -поли-L-лизина, предпочтительно от приблизительно 50 до 500 чнм -поли-L-лизина, все по отношению к общему весу пищевой композиции. Пищевые продукты, к которым могут быть добавлены низин и -поли-L-лизин, включают приправы, соусы, маринады, молочные продукты, пастообразные продукты, маргарин, мясо, макаронные изделия, лапшу, готовый рис, рисовый пудинг, овощи и напитки .

С другом аспекте предлагается способ, в котором низин в сочетании с -поли-L-лизином в количествах, эффективных для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевых продуктах, таких как соусы, приправы, напитки, включая напитки, содержащие чай, маринады, молочные продукты, пастообразные продукты, маргарины, мясо и подобные. Способ эффективен для предотвращения увеличения микробных чисел в пищевом продукте приблизительно на порядок 1 log или менее через приблизительно 3 дня. Способ включает добавление смеси приблизительно от 1 чнм до приблизительно 100 чнм низина и от приблизительно 10 до приблизительно 500 чнм -поли-L-лизина к пищевому продукту. К пищевому продукту может быть добавлена смесь низина и -поли-L-лизина, или низин и -поли-L-лизин могут быть добавлены отдельно. Низин и -поли-L-лизин эффективны для предотвращения увеличения или снижения микробных чисел в пищевых продуктах, имеющих температуру в пределах от приблизительно 0°С до приблизительно 50°С.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Комбинации низина и -поли-L-лизина действует синергетически как антимикробная композиция, которая является эффективной для консервирования пищи и для предотвращения порчи пищи. Низин и -поли-L-лизин могут быть смешаны или добавлены непосредственно к пищевым продуктам или содержаться в среде, в которую упакованы пищевые продукты, такие как, например, вода для упаковки овощей. Антимикробная композиция является эффективной при низких температурах, так как она может предотвращать увеличения антимикробных чисел в пищевом продукте приблизительно на порядок 1 log или менее через приблизительно 3 дня при температуре приблизительно от 0 до приблизительно 50°С. Композиция так же является бактерицидной для некоторых пищевых продуктов, так как она эффективна при снижении микробных чисел до 1 КОЕ/г или менее. Могут быть использованы коммерчески доступные препараты низина и -поли-L-лизина.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

«Предохранение пищи», данный термин, используемый в описании, включает способы, которые замедляют или предотвращают порчу пищи, вызванную микроорганизмами. Консервирование пищи сохраняет пищу пригодной для потребления и ингибирует или предотвращает порчу пищи или органолептические изменения, происходящие с пищей, которые делают ее менее вкусной.

«Порча пищи», данный термин, используемый в описании, включает любое изменение состояния пищи, которое делает ее менее вкусной, включая изменения вкуса, запаха, текстуры или внешнего вида.

НИЗИН

В настоящих композициях могут быть использованы коммерческие препараты низина. Например, Nisaplin®, содержащий приблизительно 2,5% чистого низина, эквивалентные 1 миллиону МЕ на грамм, выпускаемые Aplin & Barrett Ltd., Trowbridge, England и Danisco A/S (Denmark). Chrisin®, также содержащий приблизительно 1 миллион МЕ низина на грамм, выпускает Chr. Hanson A/S (Denmark). Nisaplin® представляет собой очищенный препарат низина, который представляет собой натуральную антимикробную композицию, обычно включающую 2,5% низина, 77,5% хлорида натрия, 12% белка, 6% углевода и 2% влаги при активности низина приблизительно 1х10⁶ МЕ/г. Концентрация низина в продукте может быть выражена в чнм или МЕ/г, при этом 1 чнм равна 40 МЕ/г.

-Поли-L-лизин

-Поли-L-лизин может быть использован в свободном виде или в виде соли неорганической кислоты, такой как хлористоводородная кислота, серная кислота или фосфорная кислота, или органической кислоты, такой как уксусная кислота, пропионовая кислота, фумаровая кислота, яблочная кислота или лимонная кислота. Оба типа данных солей неорганических кислот или органических кислот, также как вещество в свободном виде, обладают антибактериальным действием.

-Поли-L-лизин имеет структуру:

где n равно приблизительно от 25 до приблизительно 35.

-Поли-L-лизин выпускается под товарным знаком Save-ory GK128 Chisso Corporation, Japan. Коммерческий препарат содержит 1,0% -поли-L-лизина в качестве активного антимикробного агента, 30% глицерина, 68,8% воды, незначительное количество органических кислот для регулирования рН и эмульгатор. Продукты Save-ory использовали в суши и готовом рисе для увеличения продолжительности срока хранения в Японии.

ПРЕПАРАТ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ КОМПОЗИЦИЙ

Антимикробная композиция может быть получена смешением низина и -поли-L-лизина в количествах, эффективных для обеспечения композиции с от приблизительно 1 чнм до приблизительно 100 чнм, предпочтительно от 5 чнм до приблизительно 10 чнм низина, и приблизительно от 10 до приблизительно 1000 чнм, предпочтительно от 50 до приблизительно 500 чнм -поли-L-лизина, от общего веса композиции. Данная антимикробная композиция может быть добавлена к пищевым продуктам в количествах, эффективных для обеспечения уровня, по крайней мере, приблизительно 1 чнм, предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 10 чнм низина, и, по крайней мере, приблизительно 10 чнм, предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 500 чнм -поли-L-лизина в пище, весовые проценты должны быть по отношению к общему весу пищевого продукта. Альтернативно низин и -поли-L-лизин могут быть добавлены к пищевому продукту отдельно в количествах, эффективных для обеспечения тех же уровней концентраций.

Сравнительная синергетическая антимикробная активность, обеспеченная комбинацией низина и -поли-L-лизина в различных пищевых продуктах, приведена ниже.

Пищевой продукт или среда	Низин	-поли-L-лизин	Низин + -поли-L-лизин
Напитки	+	+	+++
Зеленостручковая фасоль, упакованная в воде	-	-	+++
Острый крем	+	-	++
Хот-доги	+	-	+
Сердечно-мозговой инфузионный агар (BHI)	+/-	-	+++
Бульон BHI	-	-	+++
+ означает наличие антимикробной активности, мульти+ означает наличие повышенной антимикробной активности; - означает отсутствие антимикробной активности.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Ингибирование роста спор Clostridium botulinum низином и -поли-L-лизином

Рост спор бактерий до вегетативных клеток в основном включает следующие стадии: прорастание спор, разрушение стенок спор, разрастание в вегетативные клетки и клеточное деление. Различные консерванты при предотвращении роста спор бактерий до вегетативных клеток, способных к делению, оказывают действие на различных стадиях. В данном примере для определения общих антимикробных активностей низина и -поли-L-лизина при предотвращении роста спор С. botulinum до вегетативных клеток использовали тест-систему с лунками в агаре. В качестве индикаторов использовали четыре различных штамма Clostridium botulinum. Данные штаммы включали штамм, несущий ген протеолитического токсина типа А, штамм, несущий ген протеолитического токсина типа В, штамм, несущий ген непротеолитического токсина типа В, и штамм, несущий ген непротеолитического токсина типа Е. Для приготовления чашек Петри использовали среду на основе сердечно-мозгового инфузионного агара (BHI), содержащую споры С. botulinum с уровнем концентрации приблизительно 10⁴ -10⁵ спор/мл. Перед добавлением индикаторных штаммов к среде препараты спор сначала подвергали тепловому шоку для активации спор и для устранения возможно присутствующих вегетативных клеток. Лунки 6 мм в диаметре стерильно продавливали в среде на основе агара.

Растворы низина и низина и -поли-L-лизина готовили разбавлением коммерческого препарата низина Nisaplin® (Danisco) и коммерческого продукта -поли-L-лизина (Chisso) водой до желаемых концентраций.

Образцы помещали в лунки пипеткой при соотношении 40 мкл на лунку. Так же рН раствора доводили до 5,5 (для устранения любого ингибирующего действия рН) с использованием NaOH и HCl. Затем чашки Петри инкубировали при 30°С в течение 24 часов в анаэробных условиях. После инкубирования индикаторный штамм вырос, и измеряли видимые зоны ингибирования. В таблице 1 показаны зоны ингибирования, образованные образцами низина и -поли-L-лизина, а так же их сочетаниями.

Результаты показывают, что ни низин, ни -поли-L-лизин отдельно при данных уровнях не показали ясных или сильных зон ингибирования всех штаммов С. botulinum, подвергнутых тестированию. Они не были способны ингибировать рост С. botulinum из спор при оптимальных условиях инкубирования. Однако в сочетании они четко ингибировали прорастание спор всех штаммов С. botulinum, подвергнутых тестированию. Эти данные предполагают сильное синергетическое действие данных двух антимикробных компонент при предотвращении прорастания из спор Clostridium botulinum и последующего образования токсина.

ТАБЛИЦА 1
Ингибирование роста спор С. botulinum низином и -поли-L-лизином при 30°С
Образец	Зона ингибирования (мм) индикаторных штаммов С.botulinum
Токсин типа А (протеолитический)	Токсин типа В (протеолитический)	Токсин типа В (непротеолитический)	Токсин типа Е
Низин (250 МЕ/мл)	0	0	7,98	0
-поли-L-лизин (50 чнм)	0	0	0	0
Низин (МЕ/мл)+ -поли-L-лизин (50 чнм)	8,85	9,88	11,76	10,68

Пример 2. Ингибирование роста вегетативных клеток С. botulinum низином и -поли-L-лизином

В данном примере для определения антимикробных активностей низина и -поли-L-лизина при предотвращении роста вегетативных клеток С. botulinum использовали тест-систему с лунками в агаре, как описано в примере 1. В качестве индикаторов использовали четыре различных штамма Clostridium botulinum. Данные штаммы включали штамм, несущий ген протеолитического токсина типа А, штамм, несущий ген протеолитического токсина типа В, и два штамма, несущие ген непротеолитического токсина типа Е. Споры данных штаммов, активированные нагреванием, инкубировали в бульоне ВНI при 30°С в течение 24 часов и затем переносили в новую среду на основе бульона ВНI для инкубирования при 30°С в течение ночи для получения вегетативных клеток. Среду на основе агара ВНI, содержащую данные вегетативные клетки С. botulinum при уровне концентрации приблизительно 3×10⁶ КОЕ/мл, использовали для приготовления чашек Петри. Лунки 6 мм диаметром продавливали в среде на основе агара. Образцы низина и -поли-L-лизина получали согласно процедуре, описанной в примере 1, рН доводили до 5,5 (для устранения любого ингибирующего действия рН) с использованием NaOH и HCl. Они были помещены пипеткой в лунки при соотношении 40 мкл на лунку. Затем чашки инкубировали при 30°С в течение 24 часов в анаэробных условиях. После инкубирования индикаторный штамм вырос, и измеряли видимые зоны ингибирования. В таблице 2 показаны зоны ингибирования, образованные образцами низина и -поли-L-лизина и комбинациями.

ТАБЛИЦА 2
Ингибирование вегетативных клеток С. botulinum низином и -поли-L-лизином при 30°С
Образец	Зона ингибирования (мм) индикаторных штаммов С. botulinum
33А (протеолитический)	53В (протеолитический)	Alaska Е (непротеолитический)	Beluga E (непротеолитический)
Низин (МЕ/мл)	0	0	7,95	0
-поли-L-лизин (50 чнм)	0	0	0	0
Низин (250 МЕ/мл)+ -поли-L-лизин (50 чнм)	9,67	9,55	10,99	11,30

Результаты предполагают, что низин или -поли-L-лизин отдельно не показали ясного или сильного ингибирования роста штаммов С. botulinum из вегетативных клеток в оптимальных условиях роста, но их комбинация проявляет четкое ингибирование всех штаммов С. botulinum, подвергнутых тестированию. Эти данные предполагают сильный синергизм низина и -поли-L-лизина против роста вегетативных клеток С. botulinum.

Пример 3. Ингибирование роста вегетативных клеток С. botulinum при низкой температуре низином и -поли-L-лизином

В некоторых случаях температура будет влиять на эффективность противомикробных препаратов при ингибировании роста бактерий. В данном примере способы биологического тестирования были такими же, как описано в примере 2, исключая другие условия инкубирования. Штаммы, подвергнутые тестированию, включали только штаммы, несущие ген непротеолитического токсина типа Е. Образцы низина и -поли-L-лизина так же готовили, как описано в примере 2, и их помещали с помощью пипетки в лунки при соотношении 40 мкл на лунку. Затем чашки инкубировали в анаэробных условиях при 13°С в течение 48 часов. После инкубирования индикаторный штамм вырос, и измеряли видимые зоны ингибирования. В таблице 3 показаны зоны ингибирования, образованные образцами низина и -поли-L-лизина и комбинациями.

ТАБЛИЦА 3
Ингибирование вегетативных клеток С. botulinum низином и -поли-L-лизином при 13°С
Образец	Зона ингибирования (мм) индикаторных штаммов С. botulinum
Alaska Е	Beluga E	Смешанные штаммы Е
Низин (250 МЕ/мл)	7,95	0	8,38
-поли-L-лизин (50 чнм)	0	0	0
Низин (250 МЕ/мл)+ -поли-L-лизин (50 чнм)	11,61	12,16	12,01

Подобно наблюдениям в примере 1 и 2, комбинации низина и -поли-L-лизина проявляли четкое синергетическое действие при ингибировании роста непротеолитического С. botulinum при 13°С.

Пример 4. Действие -поли-L-лизина на наблюдаемую активность низина

В данном примере для определения активности низина использовали стандартную тест-систему с лунками в агаре, так же как прямые зоны ингибирования для индикаторного штамма Lactococcus lactis subsp. cremoris. В стандартной тест-системе с лунками в агаре активируемые в течение ночи Lactococcus lactis subsp. cremoris перемешивали в среде на основе агара ВНI при концентрации 10 ⁶ КОЕ/мл и затем среду использовали для приготовления чашек. В каждую чашки Петри (90×15 мм) помещали 20 мл среды. На каждой чашке делали от шести до семи лунок размером 6 мм. Образцы низина и -поли-L-лизина получали согласно процедуре, описанной в примере 1. Перед добавлением образцов в лунки их разбавляли в 5× буфером рН 2,0 и кипятили в течение 15 мин. После охлаждения до комнатной температуры 40 мкл образцов добавляли в каждую лунку чашки. Также для точного сравнения стандартные растворы низина были получены таким же образом. Затем чашки инкубировали анаэробно при 30°С в течение ночи и измеряли размер зон ингибирования. Активность низина рассчитывали на основании стандартной кривой, полученной с помощью стандартных растворов, предполагая линейное соотношение между концентрацией низина и логарифмом диаметра зоны. В прямой тест-системе с лунками чашки и лунки получали таким же образом, как описано для стандартной тест-системы с лунками, но образцы низина и -поли-L-лизина получали, как описано в примере 2, и добавляли непосредственно в лунки при уровне 40 мкг/лунка. Чашки инкубировали анаэробно при 30°С в течение ночи и считывали зоны ингибирования. В таблице 4 показаны результаты анализа с помощью прямой тест-системы с лунками и стандартного анализа активности низина.

ТАБЛИЦА 4
Действие -поли-L-лизина на наблюдаемую активность низина против Lactococcus lactis
Образец	Зона ингибирования (мм)	Наблюдаемая активность низина (МЕ/мл)
Низин (200 МЕ/мл)	16,84	200
-поли-L-лизин (50 чнм)	0	-
Низин (200 МЕ/мл)+ -поли-L-лизин (50 чнм)	19,35	540

В таблице 4 показано, что наблюдаемая активность низина была значительно повышена -поли-L-лизином.

Пример 5. Ингибирование роста Lactobacillus plantarum в воде для упаковки зеленостручковой фасоли

Для подтверждения наблюдений синергизма низина и -поли-L-лизина, полученных биологическим тестированием чашек, и для подтверждения их возможностей их потенциального применения в пищевых продуктах использовали простую модель пищевой системы. В данном примере штамм Lactobacillus plantarum общеизвестных микроорганизмов, вызывающих порчу, выделенный из приправы к салату, выбрали в качестве целевого штамма и воду для упаковки зеленостручковой фасоли (автоклавировано, рН 5,2) использовали в качестве модельной жидкой пищевой системы. Активированные клетки L. plantarum инокулировали в воду для упаковки зеленостручковой фасоли при уровне 1,0×10 ⁶ КОЕ/мл. Вода для упаковки содержала различные концентрации низина и/или -поли-L-лизина. Инокулированные образы инкубировали при 30°С в течение одной недели. Живые клетки L. plantarum подсчитывали через определенные промежутки времени на чашках ВНI. Результаты суммированы в таблице 5.

Данные в таблице 5 предполагают, что низин или -поли-L-лизин отдельно обладают очень ограниченным ингибированием при начальном росте L. plantarum, в лучшем случае существенное ингибирование исчезало через 7 дней инкубирования. Комбинация низина и -поли-L-лизина значительно ингибировала рост L. plantarum в данной модельной жидкой системе. Данные результаты подтвердили изыскания экспериментов биологического тестирования, предполагая сильную синергетическую антимикробную активность низина и -поли-L-лизина против конкретной патогенной бактерии и бактерии, вызывающей порчу. Результаты для жидкой пищевой модели также предполагают возможности потенциального применения синергетической антимикробной системы для контролирования патогенных организмов и порчи пищевых и питьевых продуктов.

ТАБЛИЦА 5
Ингибирование Lactobacillus plantarum в воде для упаковки зеленостручковой фасоли низином и -поли-L-лизином при 30°С
Обработка	Число на чашке (КОЕ/мл)
1 день	5 дней	7 дней
Контроль	2,3×109	1,0×109	1,0×108
Низин (250 МЕ/мл)	5,0×108	7,1×108	1,2×108
Низин (500 МЕ/мл)	1,5×105	5,4×108	2,4×108
-поли-L-лизин (50 чнм)	6,3×108	2,5×108	1,6×108
-поли-L-лизин (100 чнм)	1,0×107	2,1×108	1,7×108
Низин (250 МЕ/мл)+ -поли-L-лизин (50 чнм)	19	<1	<1
Низин (500 МЕ/мл)+ -поли-L-лизин (50 чнм)	<1	<1	<1
Низин (500 МЕ/мл)+ -поли-L-лизин (100 чнм)	<1	<1	<1

Пример 6. Повышенная антимикробная активность низина и -поли-L-лизина в молочных продуктах

Для тестирования эффективности данного изобретения в пищевой системе на молочной основе был выбран молочный продукт (т.е. острый крем). Антимикробные компоненты добавляли к смеси обычных ингредиентов для получения острого крема. Активность низина определяли согласно стандартному способу биологического тестирования, как описано в примере 4. В таблице 6 показаны результаты измеряемой активности низина в остром креме, содержащем низин и -поли-L-лизин отдельно и в комбинации. Данные предполагают, что -поли-L-лизин повысил измеряемую активность низина в данном молочном продукте, но степень не превышала таковой для немолочной системы (т.е. для воды для упаковки зеленостручковой фасоли, как наблюдалось в примерах 4 и 5). Это может происходить благодаря взаимодействию молочных белков с -поли-L-лизином, снижая, таким образом, их эффективность, как выражено для немолочной системы. Данные результаты показывают, что применение изобретения в пищевых системах может иметь конкретные ограничения. Оказалось, что она работает намного лучше в не- или низкопротеиновой пище и, возможно, в системах с низким содержанием жира и может иметь более высокий потенциал для применения в таких пищевых продуктах, как овощи, пищевые продукты на основе крахмала, фруктовые соки, напитки и т.д.

ТАБЛИЦА 6
Антимикробная активность низина и -поли-L-лизина в остром креме, хранящемся при 30°С
Обработка	Наблюдаемая активность низина (МЕ/г)
2 дня	4 дня	5 дней	7 дней	14 дней
Низин (1000 МЕ/г)	1003	1073	1062	883	801
-поли-L-лизин (100 чнм)	0	0	0	0	0
Низин (1000 МЕ/г)+ -поли-L-лизин (100 чнм)	1204	1249	1174	1015	1147

Пример 7. Антимикробная активность низина, повышенная -поли-L-лизином в напитках, готовых к употреблению

Для проверки возможности наблюдения синергетической антимикробной активности в данном примере низин и -поли-L-лизин добавляли к напитку, готовому к употреблению (НГУ), содержащему фруктовый сок. Антимикробную активность наблюдали с использованием стандартной диффузионной тест-системы с лунками на чашке, как описано в примере 1. Результаты показаны в таблице 7.

ТАБЛИЦА 7
Синергетическое действие антимикробной активности низина и -поли-L-лизина в НГУ напитках
Образец	Зона ингибирования (мм)	Наблюдаемая активность (МЕ/мл)
Низин (250 МЕ/мл)	11,59	223
-поли-L-лизин (50 чнм)	0	-
Низин (250 МЕ/мл)+ -поли-L-лизин (50 чнм)	13,73	493

Результаты в таблице 7 ясно демонстрировали, что наблюдаемая активность низина значительно повышена в присутствии очень низких уровней -поли-L-лизина в НГУ.