способ получения растений рапса in vitro

Формула изобретения

Способ получения растений рапса in vitro, включающий выращивание растений, отбор листочков для получения каллуса на питательной среде с последующей пересадкой их на среды, способствующие формированию почек и развитию из них растений, отличающийся тем, что помещают листочки на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту) в концентрации 1-5 мг/л и кинетина 1-5 мг/л, и после образования каллусов их пересаживают на среду Мурасиге и Скуга, содержащую 6-бензиламинопурин в концентрации 3,0 мг/л и нафтилуксусную кислоту 0,5 мг/л, а образовавшиеся на каллусах почки переносят на разбавленную агаризованную среду Мурасиге и Скуга без гормонов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в биотехнологии и селекции, в исследованиях по физиологии и фитопатологии и морфогенезу растений.

Известен способ регенерации растений рапса in vitro из семядольных листочков, по которому изолированные семядольные листочки помещают на питательную среду Гамборга (В5) (пропись). Для получения растений добавляют следующие гормональные вещества: 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 3,0 мг/л и нафтилуксусную кислоту (НУК) 0,5 мг/л.

Через 2-3 недели на каллусах появляются единичные зеленые зоны, из которых появляются побеги, их отделяют от семядолей и пересаживают на безгормональную среду, на которой формируются зеленые растения (Ивашута С.И., Мазин В.В. Регенерация озимого рапса in vitro для проведения генетической трансформации. / Физиология растений. - 1994. - Т.41. - № 3. - С.440-442).

Недостатком способа является зависимость регенерации растений от фазы развития донорных (маточных, материнских) растений, низкий выход эмбриоидов и побегов.

Наиболее близким к заявленному является способ регенерации растений люцерны in vitro, включающий отбор ценных материнских растений, изолирование их частей (листьев), стерилизацию поверхности листового эксплантата в 0,1%-ном водном растворе диацида, трехкратную промывку в стерильной дистиллированной воде, делают на каждом из них ряд надрезов по всей площади пластинки и помещают на модифицированную питательную среду Гамборга (МВ5) (пропись) с фитогормонами 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) 8-16 мг/л, кинетином 6-10 мг/л, НУК 0,1-0,5 мг/л с доведением рН среды до 5,8-6,0 и концентрацией сахарозы 3%, инкубация 3-4 недели при непрерывном освещении люминесцентными лампами. Через 2-3 недели развившиеся каллусы делят на 3-5 частей и переносят на питательную органогенную среду, в которой гормоны заменены на 6-БАП из расчета 0,2 мг/л, и культивируют для получения эмбриоидов при тех же условиях в течение 2-4 недель. Появившиеся на каллусах через 2-3 недели единичные почки, эмбриоиды переносят на агаризованную питательную регенерационную среду МВ5, разбавленную водой вдвое, без гормонов. По мере развития растений-регенерантов на этой среде и появления у них 2-3 тройчатых листьев и корней их пересаживают в почву, акклиматизируют и выращивают в обычных условиях (Мезенцев А.В. Авторское свидетельство № 679190 с приоритетом 22.03.77).

Недостатками этого способа являются низкий выход (3 шт. на один каллус) эмбриоидов и зеленых растений, высокие концентрации фитогормонов.

Цель изобретения - увеличение выхода эмбриоидов растений-регенерантов из каллусной ткани рапса.

Поставленная цель достигается тем, что в способе регенерации растений рапса in vitro, включающем отбор материнских растений, изолирование листьев, стерилизацию поверхности, промывку стерильной водой, разрезание на кусочки (сегменты, эксплантанты), частичное повреждение (поранение) поверхности, посадку производят на каллусогенную питательную среду Мурасиге и Скуга (пропись), содержащую 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в концентрации 1-5 мг/л и кинетина 1-5 мг/л, инкубирование до получения каллуса, деление его на кусочки и пересадку на органогенную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 6-бензиламинопурин (6 БАП) - 3,0 мг/л и нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0,5 мг/л для получения эмбриоидов, пересадку их на агаризованную, регенерационную, безгормональную среду Мурасиге и Скуга, разбавленную водой вдвое, пересадку растений-регенерантов в почву, их акклиматизацию.

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают материнские растения с ценными признаками. Изолируют листочки, стерилизуют в стерилизующем растворе, например 5-10%-ном водном растворе Domestos, в течение 7-10 минут и трижды промывают стерильной дистиллированной водой. Использование концентрации Domestos менее 5% приводит к сохранению бактерий и спор грибов, что приводит к инфицированию посадочного материала, а применение высоких концентраций приводит к гибели не только бактерий, спор грибов, но и растительных тканей. Затем листочки делят на кусочки (сегменты, эксплантанты) размером 5×5 мм, делают на каждом из них частичные повреждения (поранения) по всей поверхности листового кусочка, помещают на агаризованную каллусогенную питательную среду Мурасиге и Скуга с добавлением фитогормонов 2,4-Д в концентрации 1-5 мг/л и кинетина 1-5 мг/л. Материал инкубируют до получения каллуса в течение 3-5 недель, при непрерывном освещении люминесцентными лампами (0,5-4,0 тыс. лк) при 24-28°С. На среде Мурасиге и Скуга формируется максимальная частота морфогенного каллуса (фиг.1). Использование 2,4-Д и кинетина в концентрациях меньше 1 мг/л замедляют время образования каллусной ткани. Добавление в среду концентраций более 5 мг/л приводит к формированию комбинированного типа каллуса, который содержит не морфогенный (рыхлый, зернистый) и морфогенный (глобулярный) типы. Развившиеся из листочков-сегментов (эксплантантов) каллусы делят на 3-4 части и переносят на агаризованную питательную органогенную среду, т.е. на ту же по составу питательную среду, что и каллусогенная, содержащая 6-БАП в концентрации 3,0 мг/л и НУК - 0,5 мг/л. Использование меньших концентраций 6-БАП и НУК увеличивает время формирования эмбриоидов и их частоту, а концентрации выше рекомендуемых приводят к формированию вторичных эмбриоидов или к их дедифференциации. Культивирование морфогенного каллуса в течение 2-4 недель при условиях с 16-ти часовым фотопериодом способствует формированию эмбриоидов и почек более 7 штук (фиг.2), что подтверждает достижение указанной цели. Появившиеся на каллусах эмбриоиды, почки переносят на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга, разбавленную водой вдвое и без гормонов.

Заявленный способ позволяет повысить получение растений-регенерантов рапса из каллусной ткани.

Прописи питательных сред представлены в таблице.

Таблица
Компоненты среды	Гамборга (В5)	МВ5	Мурасиге и Скуга	Линсмайера и Скуга	Блейдза
содержание компонентов мг/л
NH4NO3	-	-	1650	3300	1000
KNO 3	1000	2500	1900	1900	1000
CaCl 2·2H2O	150	750	440	440	-
Са(NO 3)2	-	150	-	-	347
MgSO 4·7H2O	270	250	370	370	-
MgSO 4	-	-	-	-	35
КН2РO4	-	-	170	170	300
КСl	300	-	-	-	65
NaH 2PO4·H2O	90	150	-	-	-
Na 2HPO4	30	-	-	-	-
(NH 4)2SO4	30	134	-	-	-
Н3 ВО3	3,0	3,0	6,2	6,2	1,6
MnSO 4	-	-	-	-	4,4
MnSO4H 2O	10	10	-	-	-
MnSO 4·4H2O	-	-	22,3	22,3	-
CoCl 2·6H2O	0,25	0,025	0,025	0,025	0,25
ZnSO4·7H2O	3,0	2,0	8,6	8,6	1,5
Na 2MoO4·2H2O	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
KI	0,75	0,75	0,83	0,83	0,8
CuSO4	-	0,025	-	-	-
CuSO4·5H 2O	0,25	-	0,025	0,025	0,025
FeSO4·7H2O	27,8	27,8	27,8	27,8	27,8
Nа 2ЭДТА·2Н2O	37,3	37,3	37,3	37,3	37,3
Тиамин-HCl	1,0	10,0	0,1	0,4	0,1
Пиридоксин-HCl	0,1	1,0	0,5	-	0,1
Никотиновая кислота	0,1	1,0	0,5	-	0,5
Мезоинозит	100	100	100	100	-
Глицин	2	2	2	2	2
Сахароза	3000	3000	3000	3000	3000
РН	5,6-5,8