получение пептидов соматостатина

Формула изобретения

1. Способ получения соединения формулы I



в которой

R₁ обозначает -С₂-С₆алкилен-NR₃R₄ , где R₃ и R₄ каждый независимо друг от друга обозначает Н или ацил, и

R₂ обозначает



где R₅ обозначает фенил, или его соли,

заключающийся в том, что осуществляют циклизацию линейного аналога соматостатина формулы II



в которой R₁ и R₂ имеют указанные выше значения,

R₁₁ и R₁₂ каждый независимо друг от друга обозначает аминозащитную группу, при этом, когда R₁ содержит концевую NH₂ -группу, то концевая NH₂-группа также защищена аминозащитной группой, и при необходимости удаляют защитную(ые) группу(ы), и восстанавливают полученное таким образом соединение формулы I в свободной форме или в форме соли.

2. Способ по п.1, в котором осуществляют циклизацию линейного аналога и соматостатина формулы II



в которой R₁ обозначает -СН ₂-СН₂-NR₃R₄, R₂ обозначает 4-бензилоксифенил и R₃,

R ₄, R₁₁ и R₁₂ имеют значения, указанные в п.1,

при этом, когда R₁ содержит концевую NH₂-группу, то концевая NH₂-группа также защищена аминозащитной группой,

и при необходимости удаляют защитную(ые) группу(ы),

и восстанавливают полученное таким образом соединение формулы I в свободной форме или в форме соли, где R₁ обозначает -CH₂-CH₂ -NR₃R₄ и R₂ обозначает 4-бензилоксифенил.

3. Соединение формулы II



в которых R₁ и R₂ имеют значения, указанные в п.1,

R₁₁ и R₁₂ каждый независимо друг от друга обозначает аминозащитную группу, при этом, когда R₁ содержит концевую NH₂ -группу, то концевая NH₂-группа также защищена аминозащитной группой, или его соль.

4. Соединение формулы II по п.3, в которой R₁ обозначает -CH₂-CH₂ -NR₃R₄, R₂ обозначает 4-бензилоксифенил и R₁₁ и R₁₂ каждый независимо друг от друга обозначает аминозащитную группу, при этом, когда R₁ содержит концевую NH₂-группу, то концевая NH₂ -группа также защищена аминозащитной группой, или его соль.

5. Соединение формулы II по п.3, выбранное из ряда, включающего Н-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH,

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-DTrp-Lys(Boc)-OH и

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Pro-Phg-DTrp(Boc)Lys(Boc)-OH, или его соль.

6. Способ получения соединения формулы II,



в которой R₁ обозначает -С ₂-С₆алкилен-NR₃R₄, где R₃ и R₄ каждый независимо друг от друга обозначает Н или ацил,

R₂ обозначает



где R₅ обозначает фенил,

R ₁₁ и R₁₂ каждый независимо друг от друга обозначает аминозащитную группу, при этом, когда R₁ содержит концевую NH₂-группу, то концевая NH₂-группа также защищена аминозащитной группой, заключающийся в том, что связывают друг с другом с помощью амидной связи два пептидных звена, каждое из которых содержит по меньшей мере одну аминокислоту в защищенной или незащищенной форме, где амидная связь расположена так, чтобы получить требуемую аминокислотную последовательность, указанную в формуле II, и при необходимости удаляют по меньшей мере одну защитную группу, и выделяют полученное таким образом соединение формулы II в свободной форме или в форме соли.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу получения циклических аналогов соматостатина и к промежуточным продуктам, которые применяют в этом способе.

Более конкретно изобретение относится к способу получения циклического аналога соматостатина формулы I

в которой

R₁ обозначает -С₂-C₆алкилен-NR₃ R₄, -С₂-C₆алкиленгуанидин или -С₂-C₆алкилен-СООН, где R₃ и R₄ каждый независимо друг от друга обозначает Н, С ₁-С₄алкил, -гидрокси-С₂-С₄алкилен или ацил или R₃ и R₄ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическую группу, которая может содержать дополнительный гетероатом, и

R ₂ обозначает Z₁-CH₂-R₅ , -CH₂-CO-O-CH₂-R₅

или

где Z₁ обозначает О или S и R ₅ обозначает необязательно замещенный фенил, или его соли.

Ацил может представлять собой любой ацил, например R_aCO-, где R_a обозначает Н, C₁ -C₄алкил, С₂-С₄алкенил, С ₃-С₆циклоалкил или бензил. Когда NR₃ R₄ образует гетероциклическую группу, то такая группа может быть ароматической или насыщенной и может содержать один атом азота или один атом азота и второй гетероатом, выбранный из азота и кислорода. Предпочтительно гетероциклическая группа представляет собой, например, пиридил или морфолиногуппу. С ₂-С₆алкилен предпочтительно обозначает -СН ₂-СН₂-. Когда R₅ обозначает замещенный фенил, то фенильное кольцо может быть замещено галогеном, метилом, этилом, метоксигруппой или этоксигруппой, например, в орто- и/или пара-положении. Предпочтительно R₅ обозначает незамещенный фенил.

Аминокислоты в положении 2 и/или 5 могут иметь D- или L-конфигурацию. Предпочтительно каждая из них имеет L-конфигурацию.

Соединения формулы I могут находиться, например, в свободной форме или в форме соли. Соли представляют собой кислотно-аддитивные соли, образованные, например, с органическими кислотами, полимерными кислотами или неорганическими кислотами, например, с соляной кислотой, уксусной кислотой, молочной кислотой, аспарагиновой кислотой, бензойной кислотой, янтарной кислотой или памоновой кислотой, или, например, соли щелочных металлов, когда R₁ несет СООН-группу. Кислотно-аддитивные соли могут представлять собой одно- или двухвалентные соли, например, в зависимости от того 1 или 2 кислотных эквивалента добавляют к соединению формулы I в форме свободного основания. Предпочтительными солями являются двухвалентный аспартат или одновалентный памоат.

Способ получения, предлагаемый в изобретении, включает стадию циклизации соответствующего линейного пептида в защищенной форме. При создании изобретения неожиданно было установлено, что стадия циклизации зависит прежде всего от выбора двух концевых аминокислот соответствующего линейного пептида. При создании изобретения неожиданно было установлено, что из 6 возможных сайтов циклизации циклизация между аминокислотами 3 и 4 или 4 и 5, или 6 и 1 приводит к очень важным результатам. Циклизация между аминокислотами 4 и 5 является наиболее предпочтительной. Циклизация, предлагаемая в изобретении, между аминокислотами 3 и 4 или 4 и 5, или 6 и 1 приводит к улучшенному выходу с пониженной изомеризацией в хиральных сайтах. Кроме того, стадии циклизации можно осуществлять в менее жестких условиях и с использованием менее сильных реактантов: например, можно исключать циклизацию с использованием азида.

Первым вариантом осуществления изобретения является способ получения указанного выше соединения формулы I или его соли, заключающийся в том, что осуществляют циклизацию линейного аналога соматостатина формулы II

или формулы III

или формулы IV

в которых R₁ и R₂ имеют указанные выше значения,

R₁₁ и R₁₂ каждый независимо друг от друга обозначает аминозащитную группу, причем, когда R₁ содержит концевую NH₂-группу, то эта концевая NH₂-группа также защищена аминозащитной группой, и при необходимости удаляют защитную(ые) группу(ы) и выделяют соединение формулы I, полученное таким образом, в свободной форме или в форме соли.

Приемлемые аминозащитные группы описаны, например, в «Protective Groups in Organic Synthesis», Т.W.Greene и др., изд-во John Wiley & Sons Inc., 2-e изд., 1991. Примерами таких аминозащитных групп являются, например, ацетил или аминогруппы, которые используют в пептидном синтезе, например, трет-бутоксикарбонил, карбобензоксигруппа (КБО), флуоренилметоксикарбонил, аллоксикарбонил, 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)этил, 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил, 4-метилтритил (W.C.Chan и P.D.White, Fmoc solid Phase Peptide Synthesis, изд-во Oxford University Press, 2000).

Циклизацию удобно осуществлять в присутствии производного аминия или фосфония для активации карбоксигруппы in situ, например, гексафторфосфата O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония, гексафторфосфата бензотриазол-1-илокситрис(пирролидино)фосфония, N-оксида тетрафторбората N-[(1Н-бензотриазол-1-ил)(диметиламино)метилен]-N-метилметанаминия, N-[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридин-1-илметилен]-N-метилметанаминия, гексафторфосфата 7-азабензотриазол-1-илокситрис(пирролидино)фосфония. Предпочтительно реакцию можно осуществлять в присутствии основания, например, органического амина, например, N-этилдиизопропиламина, N-метилморфолина, триэтиламина или трибензиламина, и в присутствии вспомогательного нуклеофила, например, 1-гидроксибензотриазола, N-гидроксисукцинимида, 3-гидрокси-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазин-4-она или 1-гидрокси-7-азабензотриазола.

Циклизация соединения формулы II, III или IV приводит к получению соединения формулы I в защищенной форме, т.е. соединения формулы I, в котором одна или несколько или все аминогруппы, присутствующие в молекуле, защищены аминозащитной группой. Примерами таких соединений являются, например, цикло[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-], цикло[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-] и цикло[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-DPhg-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-].

Аминозащитные группы можно удалять с помощью методов, хорошо известных в данной области, например, путем отщепления, например, с помощью трифторукусусной кислоты; 3М HCl, EtOAc; Ме₃CCl, феонола, СН₂Cl₂; 10%-ной H₂SO₄, диоксана; бромкатехолборана.

Соединения формул II, III и IV или их соли являются новыми и являются частью изобретения. Эти соединения можно получать, связывая вместе с помощью амидной связи два пептидных звена, каждое из которых содержит по меньшей мере одну аминокислоту в защищенной или незащищенной форме, где амидная связь расположена так, чтобы получить требуемую аминокислотную последовательность, указанную в формулах II, III или IV.

Синтез можно осуществлять с помощью методов, известных в данной области, например, в растворе или путем твердофазного синтеза, начиная процесс с первой аминокислоты. При твердофазном синтезе первую аминокислоту связывают со смолой, например, с поступающей в продажу смолой на основе полистирола, необязательно с помощью приемлемого линкера, например, линкера, который может отщепляться в мягких условиях, оставляя при этом неповрежденной защиту боковой цепи, например, с использованием необязательно замещенного тритильного линкера, например, 4-(гидроксилдифенилметил)бензойной кислоты, при этом одна из фенильных групп необязательно может быть замещена, например, с помощью Cl. Построение требуемой пептидной цепи, либо в растворе, либо в помощью твердофазного синтеза, можно осуществлять общепринятым методом, например, используя аминокислоты, при этом концевые аминогруппы являются Fmoc-защищенными, боковые цепи аминогрупп, если они присутствуют, защищены различными аминозащитными группами, например, Вос или КБО.

Когда синтез осуществляют с помощью твердофазного синтеза, то синтезированный пептид затем отщепляют от смолы с помощью методов, известных в данной области, например, с помощью уксусной кислоты; трифторуксусной кислоты; смеси уксусная кислота-трифторэтанол-дихлорметан; гексафторизопропанола в дихлорметане. Предпочтительным методом отщепления синтезированного пептида от твердой фазы, например, при использовании нехлорированного тритильного линкера, является, например, обработка метанолом/дихлорметаном, предпочтительно при комнатной температуре, или обработка кетоном, например этилметилкетоном, предпочтительно при температуре примерно 50°С.

Примерами соединений формул II, III и IV являются, например,

H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Tyr(Вос)-ОН,

H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH ₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Tyr-ОН,

H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH,

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH ₂-NH-CO-O)-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH,

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Pro-Phg-DTrp-Lys(Boc)-OH,

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH.

Соединения формулы II, III или IV могут находиться в форме соли, как указано выше для соединений формулы I.

Соединения формулы I являются ценными агонистами соматостатина и обладают важными фармакологическими свойствами, которые описаны, например, в WO 97/01579 или WO 02/10192, содержание которых, касающееся фармакологических свойств, включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительным соединением является цикло[{(4-NH ₂-С₂Н₄-NH-CO-O)-Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-бензил)-Phe] или его соль. Предпочтительными солями являются аспартат (моно- или диаспартат) или памоат.

При использовании способа, предлагаемого в изобретении, с помощью циклизации можно получать соответствующий линейный пептид формулы II, III или IV с выходом, превышающим 70%.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах. Все температуры даны в °С.

Использовали следующие сокращения:

Bzl	- бензил
ДЭАМ	- диэтиламин
ДИКИ	- диизопропилкарбодиимид
ДМФ	- N,N-диметилформамид
ДФФА	- дифенилфосфорилазид
ЭДИПА	- N-этилдиизопропиламин
ГБТУ	- гексафторфосфат O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-
	тетраметилурония
ГОБТ	- 1-гидроксибензотриазол
ИПС	- изопропиловый спирт
Phg	- фенилглицин
КТ	- комнатная температура
МТБЭ	- простой метил-трет-бутиловый эфир

Пример 1: [H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-Lys(Boc)-OH]

10,4 г (FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OH) растворяют в 100 мл ДМФ. При КТ добавляют 2,0 мл диэтиламина и перемешивание продолжают в течение 4 ч при КТ. Прозрачный раствор желтого цвета упаривают при 40°. К остатку добавляют 150 мл изопропилацетата. Вносят затравку и перемешивают в течение 18 ч при КТ, фильтруют и промывают 20 мл изопропилацетата. Сушат при 40°. ЖХВР 87,5% b.a. (17,6 мин). ESI-MC: 1287,5 (M+Na)^{+ 1}Н-ЯМР (ДМСО) ( , ДМСО): 1,14(2Н, m), 1,33(2Н, m), 1,37(18Н, m), 1,53(1Н, m), 1,64(1Н, m), 2,06(1Н, m), 2,22(1Н, m), 2,78-3,15(12Н, m), 3,38(1Н, m), 3,79(2Н, br), 4,12(1Н, m), 4,55-4,75(3Н, m), 5,06(2Н, s), 5,15(1H, d), 5,54(1H, d), 6,75(1H, br), 6,83(1H, br), 6,89(2H, d), 6,94(1Н, t), 6,99(1H, s), 7,43(2Н, d), 7,10-7,50(аром.Н), 7,59(1Н, d), 8,14(1Н, d), 8,45-8,55(2Н, m), 8,60(1Н, d), 10,71(1Н, br).

Применяемое в качестве исходного продукта соединение получают следующим образом:

a) Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

К раствору, содержащему 23,7 г Z-D-Trp-ОН в 230 мл ТГФ, добавляют при КТ 9,5 г ГОБТ. Образуется прозрачный бесцветный раствор. Затем добавляют при КТ 20,8 г H-Lys(BOC)-OMe×HCl, а затем 7,7 мл N-метилморфолина.

Тонкую суспензию охлаждают до 0° и добавляют 11,4 мл диизопропилкарбодиимида. Перемешивают в течение 1 ч при 0°, затем 3 ч при КТ. К суспензии добавляют раствор, содержащий 7,0 г конц. серной кислоты в 120 мл воды. Экстрагируют 150 мл этилацетата, разделяют фазы и органическую фазу промывают последовательно 100 мл насыщенного соляного раствора, 100 мл 25%-ного соляного раствора, 5%-ным раствором бикарбоната натрия. Затем органическую фазу сушат над MgSO₄ и упаривают. Остаток растворяют в 250 мл изопропилацетата и перемешивают 2 ч при КТ. После фильтрации и сушки при 40° получают 40,9 г Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe в виде вещества белого цвета. Условия ЖХВР: MN Nucleosil 100 А/С18; 5 мкм; 250×4 мм; фаза А: 0,24%-ная фосфорная кислота, фаза Б ацетонитрил; градиент: от 20 до 80% Б в течение 30 мин; длина волны 220 нм; скорость потока 1,3 мл/мин; температура 35°; чистота

97,8% b.a. (24,2 мин).

б) H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

19,8 г (34,1 ммоля) Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe растворяют в 220 мл метанола, добавляют 2,2 г катализатора (10% PdC) и гидрируют при КТ. Гидрирование прекращают после выдерживания в течение 1 ч при КТ, катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают при 30°; получают твердое вещество белого цвета. ЖХВР: 98,1% b.a. (16,2 мин).

в) Z-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

17,0 г H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe смешивают с 80 мл ТГФ. К суспензии серого цвета добавляют при КТ 9,2 г Z-Phg-OH. Добавляют 4,4 г ГОБТ, промывают 20 мл ТГФ. Мутный раствор желтого цвета охлаждают до 0° и добавляют в течение 10 мин раствор, содержащий 5,3 мл ДИКИ в 15 мл ТГФ. Перемешивают в течение 2 ч при 0°, затем 2 ч при КТ. Затем добавляют раствор, содержащий 3,6 г серной кислоты в 57 мл воды, экстрагируют 70 мл этилацетата, промывают водой, насыщенным соляным раствором, 5%-ным бикарбонатом натрия, 25%-ным соляным раствором, сушат над MgSO₄ и упаривают. Остаток белого цвета перемешивают с 125 мл изопропилацетата в течение 2 ч при 40° и суспензию фильтруют. Остаток сушат при 40°: получают субстанцию желтоватого цвета ЖХВР: 96,3% b.a. (25,3 мин).

г) H-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

23,4 г (23,8 ммоля) (Z-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe) растворяют в 260 мл метанола, добавляют 2,6 г 10%-ного Pd/C и гидрируют при КТ и нормальном давлении. Через 3 ч катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают при 30°: получают твердое вещество белого цвета. ЖХВР 95,9% b.a. (17,6 мин).

д) Z-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

11,1 г бензилового эфира 2-карбоновой кислоты (2S,4R)-4-(2-трет-бутоксикарбониламиноэтилкарбамоилокси)пирролидин-1-карбоновой кислоты и 19,0 г H-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe растворяют в 290 мл ТГФ при КТ. Добавляют 3,32 г ГОБТ и мутный раствор охлаждают до 0°. Добавляют раствор, содержащий 4,56 мл ДИКИ в 90 мл ТГФ. Перемешивают в течение 24 ч при 0°. Затем при КТ добавляют раствор, содержащий 2,2 г серной кислоты в 22 мл воды, слегка опалесцирующий раствор перемешивают в течение 15 мин и вносят по каплям в 500 мл воды. Суспензию белого цвета упаривают при 50° до прекращения отгонки ТГФ. Суспензию фильтруют и остаток промывают 4 раза водой, используя каждый раз по 80 мл, затем 250 мл метанола и затем дважды метанолом, используя всего 80 мл. Сушат в течение ночи при 50°. ЖХВР 91,0% b.a. (19,5 мин).

e) H-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH ₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-TrD-Lys(BOC)-Оме

22,0 г (12,7 ммоля) Z-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe растворяют в 220 мл ДМФ и добавляют 4,4 г 10%-ного Pd/C. Гидрируют в течение 4 ч при КТ. Затем катализатор отфильтровывают и фильтрат добавляют к смеси, содержащей 600 г льда и 400 мл воды. Осадившийся продукт отфильтровывают и промывают водой. Сушат при 30°, получая твердое вещество серого цвета. ЖХВР: 97,0% b.a. (12,3 мин).

ж) Z-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH ₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-Ome

5,1 г Z-Phe-OH и 16,5 г H-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-Ome растворяют в 250 мл ТГФ, добавляют 2,29 г ГОБТ и темный раствор охлаждают до 0°. 3,1 мл ДИКИ растворяют в 80 мл ТГФ и добавляют к реакционной смеси при 0°. Перемешивают в течение 24 ч при 0°. Реакционную смесь добавляют к 200 мл 10%-ной серной кислоты, осадившиеся твердые частицы отфильтровывают и промывают водой. После фильтрации остаток смешивают с 200 мл метанола и суспензию фильтруют. Сушат при 40°. ЖХВР: 97,2% b.a. (21,1 мин).

з) (H-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂ -CH_2-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe)

8,5 г Z-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe растворяют в 180 мл ДМФ, добавляют 4,25 г 10%-ного Pd/C и смесь гидрируют при КТ в течение 6 ч. Затем катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают при 40°. К остатку (30 г) добавляют по каплям при КТ 600 мл метил-трет-бутилового эфира, суспензию фильтруют и остаток промывают 300 мл МТБЭ. Сушат при 40°. ЖХВР 93,1% b.a. (16,6 мин).

и) FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe

6,5 г H-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe и 3,1 г FMOC-Tyr(Bzl)-OH и 0,86 г ГОБТ суспендируют в 180 мл ТГФ и охлаждают до 0°. Добавляют 5,5 г LiBr и затем 20 мл ТГФ. Затем добавляют 1,18 мл ДИКИ, растворенного в 50 мл ТГФ, и темную суспензию перемешивают при 0° в течение 2 ч. Охлаждающую баню удаляют и перемешивание продолжают в течение 24 ч. Затем добавляют раствор, содержащий 0,65 г серной кислоты и 6,5 мл воды, а затем добавляют 160 мл воды. Упаривают при 40°, фильтруют остаток, промывают водой до тех пор, пока значение рН последнего водного смыва не достигает 4,0. Осадок на фильтре перемешивают в 30 мл метанола, суспензию фильтруют и остаток промывают 10 мл метанола. Сушат при 35°, получая вещество серого цвета. ЖХВР 95,4% b.a. (26.0 мин).

к) FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OH

13,0 г FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe суспендируют в 250 мл ТГФ. Добавляют 7,3 г LiBr и 75 мл ТГФ. Затем медленно в течение 20 мин добавляют при КТ 8,7 мл 1М NaOH. Перемешивание при КТ продолжают в течение 3 ч, затем в течение последующих 15 ч добавляют еще 5 мл 1М NaOH. Конечный реакционный раствор добавляют к раствору, содержащему 1,7 г серной кислоты в 34 мл воды. Полученную двухфазную смесь добавляют в 50 мл этилацетата. После разделения фаз органическую фазу трижды промывают соляным раствором и затем упаривают. К остатку добавляют 25 мл DIF. Образовавшийся прозрачный DIF-раствор добавляют в 260 мл воды. Полученную суспензию фильтруют и осадок на фильтре промывают трижды водой и сушат в течение ночи при 40°. ЖХВР 71,9% b.a. (28,6 мин).

Пример 2:

Получение 4-(хлор(дифенил)метил)бензоиламинометилполистироловой смолы

Синтез осуществляют в управляемом вручную 1-литровом реакторе с периодической загрузкой с мешалкой, снабженном фриттой из спекшегося стекла в атмосфере азота. Поступающую в продажу аминометилполистироловую смолу (30,4 г, 41,07 ммоля), предварительно обработанную ДМФ, подвергают взаимодействию при КТ в течение ночи с раствором, содержащем 4-(гидроксилдифенилметил) бензойную кислоту (15,0 г, 49,28 ммоля, 1,2 экв.), гидроксибензотриазолом (ГОБТ) (7,54 г, 49,28 ммоля, 1,2 экв.) и ДИКИ (12,43 г, 98,57 ммоля, 2,4 экв.) в ДМФ (140 мл). Растворитель удаляют фильтрацией через фритту при пониженном давлении и смолу последовательно промывают 5 раз ДМФ и 5 раз метанолом. После сушки в вакууме при 40° получают 44,69 г смолы. Эту смолу используют в качестве исходного продукта для следующего синтеза гексапептидов.

Процесс синтеза защищенного линейного пептида

Вручную осуществляют сборку связанных со смолой линейных гексапептидов в направлении от С- к N-концу с помощью повторяющихся реакций сочетания в реакторе с периодической загрузкой с мешалкой, снабженном фриттой из спекшегося стекла, в атмосфере азота. 4-(Хлор(дифенил)метил)бензоиламинометилполистироловую смолу используют в качестве исходного продукта и применяют стандартный протокол, который заключается в повторяющихся циклах удаления N -защитных групп (20 об.% диэтиламин (ДЭАМ) в ДМФ), повторяющихся последовательных отмывках с помощью ДМФ и IPK и осуществлении реакций сочетания (DIPCI/ГОБТ, ЭДИПА и ДМФ) при КТ. Небольшим изменением этой процедуры сочетания является то, что предпринимали специальные меры для минимизации рацемизации фенилглицина, для чего сочетание этой аминокислоты проводили при 0°. Перед отщеплением от смолы полностью собранного защищенного линейного пептида удаляли защиту N -Fmoc.

Fmoc-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂ -CH₂-NH-CO-O)-Pro-OH синтезируют согласно методу, описанному в WO 02/101192. Все другие аминокислоты поступают в продажу.

Синтез H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH

а) Синтез Fmoc-Lys(Boc)-О-смолы

4-(Хлор(дифенил)метил)бензоиламинометилполистироловую смолу (20 г, 19,4 ммоля), предварительно обработанную толуолом, обрабатывают в течение 4 ч ацетилхлоридом (7,6 т, 97 ммолей) в толуоле при КТ. После фильтрации процедуру повторяют в течение ночи, после чего смолу фильтруют и промывают толуолом и дихлорметаном. Сочетание осуществляют в смеси Fmoc-Lys(Boc)-ОН (18,2 г, 38,8 ммоля; 2 экв.) и N-метилморфолина (3,94 г, 38,8 ммоля, 2 экв.) в течение 4 ч при КТ. После фильтрации смолу последовательно трижды промывают ДМФ и ИПС и сушат в вакууме, получая 26,5 г Fmoc-Lys(Boc)-О-смолы в виде продукта желтоватого цвета, производительность 0,566 ммоля/г (определено с помощью Fmoc-метода).

(Литература: Fmoc-method: Meienhofer J.; Waki M; Heimer E.P.; Lambros T.J.; Makofske R.C.; Chang C.D. Int. J. Pep. Prot. Res.13, 1979, с.35)

б) Смола-О-Lys(Boc)-D-TrD(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH_2-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H

Fmoc-Lys(Boc)-O-смолу (28,0 г, 19,96 ммоля) суспендируют в ДМФ и обрабатывают раствором ДЭАМ в ДМФ (20 об.%) в течение 10 мин при КТ. После фильтрации процедуру повторяют и затем последовательно трижды промывают ДМФ и ИПС, а затем трижды промывают ДМФ. Эту процедуру удаления защитной группы N -Fmoc и промывки повторяют после каждой стадии сочетания.

Реакцию сочетания осуществляют в смеси аминокислоты, ГОБТ и ДИКИ, которую перемешивают в течение 30 мин при КТ и затем в виде одной порции добавляют к смоле. Реакцию сочетания продолжают до завершения, т.е. до полного исчезновения остаточных аминогрупп, что определяют по отрицательному результату нингидринового теста «Kaiser». После осуществления реакции сочетания смолу 5 раз промывают ДМФ, после чего она готова для защиты с помощью Fmoc-группы.

Следующие производные аминокислот последовательно подвергают сочетанию:

Fmoc-D-Trp(Boc)-OH (16.81 г, 31,92 ммоля, 2 экв.), DIF (100 мл), ГОБТ (4,93 г, 32,24 ммоля, 2,02 экв.), ДИКИ (5,35 г, 42,45 ммоля, 2,66 экв.). Fmoc-Phe-OH (11,92 г, 31,92 ммоля, 2 экв.), ТГФ (70 мл), ГОБТ (4,93 г, 32,24 ммоля, 2,02 экв.), ДИКИ (5,35 г, 42,45 ммоля, 2,66 экв.). Предпринимают специальные меры для минимизации рацемизации фенилглицина, осуществляя сочетание этой аминокислоты при 0°С.

Fmoc-(2S,4R)4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-OH (17,26 г, 31,92 ммоля, 2 экв.), DIF (100 мл), ГОБИ (4,93 г, 32,24 ммоля, 2,02 экв.), ДИКИ (5,35 г, 42,45 ммоля, 2,66 экв.).

Fmoc-Phe-OH (12.36 г, 31,92 ммоля, 2 экв.), DIF (100 мл), ГОБТ (4,93 г, 32,24 ммоля, 2,02 экв.), ДИКИ (5,35 г, 42,45 ммоля, 2,66 экв.). Fmoc-Tyr(Bzl)-OH (15,75 г, 31,92 ммоля, 2 экв.), DIF (100 мл), ГОБТ (4,93 г, 32,24 ммоля, 2,02 экв.), ДИКИ (5,35 г, 42,45 ммоля, 2,66 экв.).

Перед отщеплением полностью собранного защищенного линейного пептида от подложки из смолы удаляют защиту N -Fmoc, обрабатывая смолу раствором ДЭАМ в ДМФ (20 об.%) в течение 10 мин при КТ. После фильтрации процедуру повторяют и последовательно трижды промывают ДМФ и ИПС, а затем трижды промывают ДМФ.

(После сушки смолы в вакууме при 40°С получают смолу желтоватого цвета).

в) Отщепление линейного пептида от подложки из смолы:

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH

ва) Метод с использованием АсОН/СН₂Cl₂/Н₂ О 45/45/5 об./об./об.

Полностью собранный защищенный линейный пептид смола-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H(24,5 г) суспендируют в смеси AcOH/CH₂Cl₂/H₂O 45/45/5 об./об./об. (150 мл) и перемешивают в течение 1 ч при КТ, фильтруют и промывают СН₂Cl₂. Фильтрат упаривают досуха, остаток перемешивают в течение 1 ч в смеси МТБЭ и гептана 7/3 об./об., фильтруют и сушат в вакууме. Получают твердый продукт желтоватого цвета; содержание: 93,5% по данным ЖХВР г/г; чистота 91,6% по данным (F)-ЖХВР и содержание D-Phg-эпимера 2,5% по данным (F)-ЖХВР.

Смолу (4-(хлор(дифенил)метил)бензоиламинометилполистироловая смола) промывают трижды метанолом и сушат, после чего ее можно использовать повторно.

вб) Метод с использованием СН₂Cl₂ и МеОН

Полностью собранный защищенный линейный пептид смола-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H(6,2r) суспендируют в смеси СН₂Cl₂/МеОН 1/1 об./об. (115 мл) и перемешивают в течение 3 дней при КТ, фильтруют и промывают CH₂Cl₂. Фильтрат упаривают досуха, остаток перемешивают в течение 1 ч со смесью МТБЭ и гептана 7/3 об./об. (60 мл), фильтруют и сушат в вакууме. Содержание: 93,5% по данным ЖХВР г/г; чистота 92,6% по данным (F)-ЖХВР и содержание D-Phg-эпимера 1,1% по данным (F)-ЖХВР.

Смолу (4-(хлор(дифенил)метил)бензоиламинометилполистироловая смола) промывают трижды метанолом и сушат, после чего ее можно использовать повторно.

вв) Метод с использованием этилметилкетона/МеОН

Полностью собранный защищенный линейный пептид смола-O-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H(4,0 г) суспендируют в смеси с диэтилметилкетоном 1/1 об./об. (24 мл) и перемешивают в течение 15 ч при 50°С, фильтруют и промывают МеОН. Фильтрат упаривают досуха, остаток перемешивают в течение 1 ч в смеси МТБЭ и гептана 7/3 об./об. (60 мл), фильтруют и сушат в вакууме. Содержание: 88,1% по данным ЖХВР г/г; чистота 95,2% по данным (Р)-ЖХВР и содержание D-Phg-эпимера 1,8% по данным (F)-ЖХВР.

Смолу (4-(хлор(дифенил)метил)бензоиламинометилполистироловая смола) промывают трижды метанолом и сушат, после чего ее можно использовать повторно.

Очистка

Для аналитических целей линейные пептиды очищают с помощью хроматографии с обращенной фазой (ОФ).

Характеристики

Структуру аналитического образца, очищенного с помощью ОФ-хроматографии подтверждают с помощью FAB-MC, ЖХ-МС и ЯМР (ДМСО в част/млн, 1,16, 1,34, 1,55, 1,61 (3Н), 1,66, 2,05, 2,20, 2,51, 2,83 (2Н), 2,91, 2,96, 2,98, 3,02, 3,41, 3,78, 4,13, 4,61, 5,13, 5,51, 6,74, 6,83, 6,88 (2Н), 7,01 (2Н), 7,11 (2Н), 7,38, 7,42 (2Н), 7,49, 7,72, 8,01, 8,29, 8,48, 8,62, 8,75).

Конфигурацию аминокислот определяют с помощью анализа аминокислот: соединение гидролизуют в кислотных условиях, превращают в производные и конфигурацию каждой индивидуальной аминокислоты оценивают путем энантиоселективной газовой хроматографии/масс-спектрометрии с химической ионизацией.

Дополнительное подтверждение структуры осуществляют путем превращения различных линейных пептидов в циклический пептид с хорошо известными характеристиками.

С помощью описанного метода синтезируют следующие соединения.

H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Tyr(Вос)-ОН,

H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH ₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-ОН,

H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH,

H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Try(Bzl)-OH,

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH.

Пример 3: Циклизация линейных защищенных пептидов для синтеза

Цикло[(2S,4R)-4-(Вос-NH-СН₂-СН₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Tyr(Вос)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-]

Циклизация H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-OH

Азидный метод

Для циклизации линейный фрагмент (2,5 г, 1,83 ммоля) растворяют в ДМФ (391 мл), охлаждают до -5°, обрабатывают ЭДИПА (0,47 г, 3,66 ммоля, 2 экв.) и ДФФА (0,75 г, 2,75 ммоля, 1,5 экв.) и перемешивают при указанной температуре до завершения реакции (примерно 20 ч). К реакционной смеси по каплям добавляют воду (391 мл), осадок фильтруют и промывают водой до тех пор, пока содержание азида не снизится до уровня, ниже обнаруживаемого. Получают 4,9 г смоченного водой твердого вещества белого цвета (значение Rf при ЖХВР идентично стандарту), которое применяют в реакции удаления защитной группы без дополнительной очистки. Соединение характеризуют с помощью ЖХВР путем непосредственного сравнения с соединением-стандартом.

Циклизация H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH

а) ГБТУ-метод

Для циклизации линейный фрагмент (6,0 г, 3,5 ммоля) растворяют в ДМФ (780 мл), охлаждают до -5°, обрабатывают ЭДИПА (1,13 г, 8,75 ммоля, 2,5 экв.), ГОБТ (1,18 г, 8,75 ммоля, 2.5 экв.), ГБТУ (3,3 г, 8,78 ммоля, 2,5 экв.) и перемешивают при указанной температуре до завершения реакции (примерно 2 ч). К реакционной смеси по каплям добавляют воду (391 мл), осадок фильтруют и промывают водой и гептаном и сушат в вакууме в течение ночи. Получают 5,4 г твердого вещества желтовато-белого цвета. Соединение характеризуют с помощью ЖХВР путем непосредственного сравнения с соединением-стандартом. Содержание 55 мас.%. по данным ЖХВР, чистота 78 (А%)-ЖХВР.

б) ГБТУ-метод б

Для циклизация линейный фрагмент (6,0 г, 4,16 ммоля) растворяют в ДМФ (60 мл) и добавляют по каплям в смесь ГОБТ (4,15 г, 10,4 ммоля, 2,5 экв.), ГБТУ (4,15 г, 10,4 ммоля, 2,5 экв.) и ЭДИПА (1,41 г, 10,4 ммоля, 2,5 экв.) в ДМФ (135 мл) при -5° и перемешивают при указанной температуре до завершения реакции (примерно 2 ч). К реакционной смеси по каплям добавляют воду (559 мл) при КТ, осадок фильтруют и промывают водой и гептаном и сушат в вакууме в течение ночи. Получают твердое вещество желтовато-белого цвета. Соединение характеризуют с помощью ЖХВР путем непосредственного сравнения с соединением-стандартом. Содержание 77 мас.% по данным ЖХВР, чистота 84 (А%)-ЖХВР.

Следующие линейные пептиды циклизуют с помощью вышеописанной процедуры:

H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH ₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Tyr(Вос)-ОН,

H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH ₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-ОН,

H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH,

H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Try(Bzl)-OH,

H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂-CH₂ -NH-CO-O)-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH.

Пример 4: Синтез трифторацетата цикло[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH₂ -CH₂-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe-]

Для завершения удаления защитной группы остаток (1,5 г, 0,79 ммоля) растворяют при 0° в смеси ТФК/Н ₂О, 95:5 (8,3 мл) и смесь перемешивают при охлаждении в течение 30 мин. Холодную реакционную смесь вносят по каплям в смесь МТБЭ (29 мл) и гептана (13 мл) при КТ и перемешивают в течение 2 ч. Осадок фильтруют, промывают смесью МТБЭ /гептан, 1:1 (об./об.) и сушат в вакууме. Получают твердое вещество бежевого цвета, содержание 53 мас.% по данным ЖХВР, чистота: 79 (А%)-ЖХВР.