способ изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий

Формула изобретения

Способ изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий, включающий получение антигенов, инактивацию, внесение адъюванта, проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции, раздельно выращивают культуры Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Streptococcus fecalis в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см ³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 ч, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к вакцинам, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения ассоциированной вакцины для профилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными бактериями (патент РФ на изобретение №2035189 от 02.01.86, МКИ А 61 К 39/125, 39/135). Данный способ включает раздельное выделение протективных антигенов, из штамма Staphylococcus aureus № Б-243 выделяют цитоплазматический антиген, из токсинопродуцирующего штамма Pseudomonas aeruginosa НИИЭМ №PA-7 получают анатоксин синегнойной палочки, из клинических штаммов Proteus mirabilis №6, 8, 40, 508, 1115, 4641 выделяют растворимые антигены путем контролируемого протеолиза, полученные антигены смешивают в физрастворе из расчета содержания их в 1 мл вакцины 0,15-0,2 мг белка, 15-30 мкг белка, 10-20 мкг белка соответственно, и в смесь дополнительно добавляют коммерческий стафилококковый анатоксин и гидроокись алюминия в количестве 5-10 ЕС и 1-2 мг соответственно. Технология получения вакцины очень сложная, для профилактики инфекционных болезней нутрий не применяется.

Известен способ получения поливалентной вакцины против кишечных инфекций (патент РФ на изобретение №2080875 от 18.03.92, МКИ А 61 К 39/125, 39/135). Данный способ получения поливалентной вакцины включает раздельное выращивание культур Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B, Shigella Flexneria, Shigella Sonne, отделение биомассы от питательной среды, экстракцию антигенов проводят водно-солевым раствором при шуттелировании в присутствии антибиотика и мелкораздробленного стекла в течение 1-1,5 ч, полученные экстракты центрифугируют, очистке подвергают супернатанты и после смешивания получают целевой продукт в виде смеси клеточных стенок, содержащих O-антигены используемых культур, со жгутиками, содержащими Н-антигены, и растворимыми Vi-антигенами сальмонелл. Технология получения данной вакцины очень сложная и для профилактики инфекционных болезней нутрий не рекомендуется.

Известен способ получения вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий (патент РФ на изобретение №2099083 от 30.09.94, МКИ А61К 39/125, 39/135). Данный способ предусматривает раздельное выращивание в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммов Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015 в течение 18-24 часов, полученные культуральные среды подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3-0,4%-ным раствором формалина, объединяют их в равных соотношениях по объему и последовательно вносят гидроокись алюминия. Данный способ позволяет получать вакцину против стрептококкоза и пастереллеза нутрий. После введения данной вакцины у животных возникают поствакцинальные осложнения (воспаление на месте введения, абсцессы, хромата). Данная вакцина не защищает нутрий от колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции.

Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности повышение специфичности, эффективности способа изготовления вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий, путем введения новых культур возбудителей, компонентов, исключая отрицательное и побочное влияния.

Решение задачи достигается тем, что в способе изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий, включающем получение антигенов, инактивацию, внесение адъюванта, проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции, раздельно выращивают культуры Escherichia coli. Salmonella typhimurium, Streptococcus fecalis в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см ³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания и гибели нутрий от колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции, приготавливают суспензию из патологического материала, выделают чистые культуры возбудителей посевом на дифференциально-диагностические среды. Используют при раздельном выращивании чистых культур Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Streptococcus fecalis мясопептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2% и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд в 1 см³ . Инактивируют культуры возбудителей формалином до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов и смешивают чистые культуры в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против трех инфекций. Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, более специфичной вакцины для защиты нутрий от колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия "промышленная применимость", то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: формолквасцовая вакцина против паратифа (сальмонеллеза) телят ТУ 46-21-166-75, утверждено 10.05.75 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 28.03.80 г.; вакцина против паратифа (сальмонеллеза) поросят ТУ 46-21-952-74, утверждено 15.07.74 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины, утверждена Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 23.10.96 г.; ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины, утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.; вакцина против энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят ТУ 10.09-91-90, утверждено 15.12.90 г.; инструкция по изготовлению и контролю формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят, утвержденная ГУВ МСХ СССР 26.04.1984 г. Однако для нутрий эти вакцины не применяются.

Методы выделения и характеристика сальмонелл описаны в методических указаниях "Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды". Москва, ВО "Агропромиздат", 1990 г., а также в справочнике "Определитель зоопатогенных микроорганизмов" под редакцией профессора Сидорова М.А., М.: Колос, 1995, стр.201-204, в "Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии" авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: Колос, 2001, на стр.222-231.

Методы выделения чистой культуры возбудителя колибактериоза и характеристика описаны в "Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных", утвержденных 27.07.2000 г. №13-7-2/2117, Департаментом ветеринарии МСХ РФ, описана характеристика эшерихий в справочнике "Определитель зоопатогенных микроорганизмов" под редакцией профессора Сидорова М.А., М.: Колос, 1995, стр.196-201, а также в "Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии", авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: Колос, 2001, на стр.219-222.

Методы выделения и характеристика стрептококков представлены в "Методических указаниях по лабораторной диагностике стрептококкоза животных", утвержденных 25.09.1990 г. Главным управлением ветеринарии с государственной инспекцией при Государственной комиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам, а также в справочнике "Определитель зоопатогенных микроорганизмов" под редакцией профессора Сидорова М.А., М.: Колос, 1995, стр.90-95.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, приготавливают суспензию из патологического материала, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей инфекционных болезней колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции, раздельно выращивают чистые культуры возбудителей Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Streptococcus fecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

Для изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания их колибактериозом, сальмонеллезом и энтерококковой инфекцией, из которых приготавливают суспензию, и проводят бактериологические исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя колибактериоза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, что характерно для E.coli.

Для определения культуральных свойств возбудителя колибактериоза нутрий E.coli делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясо-пептонный бульон (МПБ), на среду Эндо, на мясо-пептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-24 часов. На чашках Петри с МПА вырастают влажные колонии с ровными краями и гладкой поверхностью серого цвета. В пробирках с МПБ наблюдали равномерное помутнение питательной среды с небольшим осадком, разбивающимся при встряхивании. В чашках Петри, на среде Эндо наблюдают рост колоний малиново-красного цвета с розовым ободкам диаметром 2-3 мм, характерные для E.coli.

При определении биохимической активности чистых баккультур проводят посевы на дифференциально-диагностические среды с различным набором компонентов. Для E.coli характерно расщепление глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы.

Патогенность чистых выделенных культур определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели мышей из паренхиматозных органов павших мышей приготавливают мазки-отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа в препаратах видны толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, характерные для E.coli. Серологическую типизацию кишечной палочки проводят в реакции агглютинации с набором типоспецифических сывороток по общепринятой методике в пробирках.

В реакции агглютинации исследуемая культура кишечной палочки реагирует с колисывороткой и виден хлопьевидный осадок (положительный результат) при отрицательном контроле.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя сальмонеллеза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают тонкие палочки красного цвета, расположенные одиночно, характерные для рода Salmonella.

Для определения культуральных свойств возбудителя сальмонеллеза нутрий делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясопептонный бульон (МПБ), на дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина, висмут-сульфитный агар), на мясопептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-24 часов. На чашках Петри с МПА вырастают гладкие, прозрачные, бесцветные колонии с ровными краями. В пробирках с МПБ наблюдают диффузное помутнение питательной среды. В чашках Петри, на среде Эндо наблюдают прозрачные бесцветные колонии, на среде Левина - голубоватые, на висмут-сульфитном агаре - черные колонии с характерным металлическим блеском, что характерно для рода Salmonella.

При определении биохимической активности чистых культур проводят посевы на дифференциально-диагностические среды с различным набором углеводов и компонентов.

Выделенная чистая культура возбудителя сальмонеллеза характерная для представителей рода сальмонелл (ферментирует глюкозу, манит, не утилизирует лактозу, сахарозу, не расщепляет мочевину, не образует индол, не разжижает желатину).

Патогенность и специфичность чистой выделенной культуры определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели белых мышей из паренхиматозных органов павших мышей готовят мазки-отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа наблюдают тонкие палочки красного цвета, расположенные одиночно, характерные для рода Salmonella.

Для установления серотиповой принадлежности выделенной чистой культуры Salmonella ставят реакцию агглютинации (РА) на стекле по общепринятой методике. Выделенную чистую культуру проверяют с О-комплексными и монореценторными О- и Н-агглютинирующими сыворотками в реакции агглютинации. Для этого выделенную чистую культуру выращивают на скошенном МПА в течение 18-24 ч при температуре 37°С. РА на стекле ставят с каждой из О-комплексных сывороток последовательно, до получения положительного результата с двумя сыворотками. Положительный результат РА наблюдают в виде с трудом разбивающихся хлопьев с выделенной культурой Salmonella typhimurium.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя энтерококковой инфекции готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Streptococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясопептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ), в чашки Петри с мясопептонным агаром (МПА) с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают в МПБ рост в виде диффузного помутнения среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост мелких росинчатых, слегка мутноватых с ровными краями колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Streptococcus fecalis. На энтерококковой дифференциально-диагностической среде через 14-18 часов инкубирования наблюдают рост колоний вишнево-красного цвета, что характерно для возбудителя энтерококковой инфекции Str.fecalis.

Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки, в отличие от стрептококков, образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.

В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультуры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков группы D. Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые, преципитирующие сыворотки. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации (РП) в капиллярах. Патогенность подтверждают биопробой на молодых белых мышках.

Выделенные таким образом чистые культуры возбудителей колибактериоза Escherichia coli, сальмонеллеза Salmonella typhimurium и энтерококковой инфекции Streptococcus fecalis используют для получения баксырья. Выращивание чистых культур возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции проводят раздельно в мясо-пептонном бульоне,

При получении чистой культуры возбудителя колибактериоза для заражения берут 1-2 см³ свежей культуры E.coli и засевают 80-100 см³ жидкой питательной среды и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 5-6 млрд в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,5-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании.

При получении чистой культуры возбудителя сальмонеллеза для заражения берут 5 см ³ свежей чистой культуры возбудителя сальмонеллеза Salmonella typhimurium на 1000 см³ мясо-пептонной питательной среды с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании.

При получении чистой культуры возбудителя энтерококковой инфекции для заражения берут 5 см ³ чистой культуры возбудителя энтерококковой инфекции Streptococcus fecalis на 1000 см³ жидкой питательной среды с добавлением 0,2% глюкозы и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд в 1 см³. Инактивацию баксырья проводят раздельно внесением формалина 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, смешивают инактивированные баккультуры в равных соотношениях. Затем к смеси баккультур добавляют раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, колибактериоза и энтерококковой инфекции нутрий чистых культур возбудителей Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Streptococcus fecalis, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать более специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих трех опасных инфекционных болезней: колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий. Раздельное выращивание возбудителей с содержанием 0,2% глюкозы позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 4 млрд в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования. Использование формалина для инактивации в 0,4-0,6%-ной конечной концентрации позволяет в течение 72-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование трех антигенов на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых нутрий формирование напряженного иммунитета против колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения нутриям внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений (таблица).

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Таблица Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу
№ п/п	Отличительные признаки	Прототип	Предлагаемый способ
1.	Возбудители	Штаммы Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015	Чистые баккультуры возбудителей колибактериоза Escherichia coli, сальмонеллеза Salmonella typhimurium и энтерококковой инфекции Streptococcus fecalis, выделенные из местного эпизоотического очага
2.	подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкую фракцию	Обязательно проводится	Не проводится
3.	Инактивация бактериальной массы	0,3-0,4%-ный раствор формалина, выдерживают в течение 44-50 ч	0,4-0,6%-ной концентрации формалина в течение 72-96 часов при температуре 37°С
4.	Адъювант	3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 10% к объему	гидроокись алюминия 20% к объему
5.	Поствакцинальные осложнения	У нутрий после введения вакцины хромота, воспалительные процессы	Нет
6.	Длительность иммунитета	6 мес	9 мес

Таким образом, данные таблицы показывают преимущества предлагаемого способа изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза и энтерококковой инфекции нутрий по сравнению с имеющимся прототипом.