противоаллергический агент, его применение для облегчения аллергии и способ облегчения (уменьшения симптомов) аллергии

Формула изобретения

1. Противоаллергический агент, включающий в качестве активного ингредиента молочнокислую бактерию штамма, выбранного из Lactobacillus acidophilus CL0062 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4980), Lactobacillus acidophilus CL92 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4981) и Lactobacillus fermentum СР34 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-8383), а также их комбинаций.

2. Применение молочнокислой бактерии, выбранной из штамма Lactobacillus acidophilus CL0062 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4980), Lactobacillus acidophilus CL92 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4981) и Lactobacillus fermentum СР34 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-8383), а также их комбинаций для облегчения аллергии.

3. Применение по п.2, где указанная аллергия является аллергическим ринитом.

4. Способ уменьшения симптомов аллергии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективной дозы противоаллергического активного ингредиента, включающего молочнокислую бактерию, выбранную из штамма Lactobacillus acidophilus CL0062 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4980), Lactobacillus acidophilus CL92 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4981) и Lactobacillus fermentum СР34 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-8383), а также их комбинаций.

5. Способ по п.4 уменьшения симптомов аллергии, связанной с повышенным уровнем IgE, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективной дозы противоаллергического активного ингредиента, включающего молочнокислую бактерию, выбранную из штамма Lactobacillus acidophilus CL0062 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4980), Lactobacillus acidophilus CL92 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4981) и Lactobacillus fermentum СР34 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-8383), а также их комбинаций.

6. Противоаллергический агент для уменьшения симптомов аллергии, связанной с повышенным уровнем IgE, включающий в качестве активного ингредиента молочнокислую бактерию, выбранную из штамма Lactobacillus acidophilus CL0062 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4980), Lactobacillus acidophilus CL92 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4981) и Lactobacillus fermentum СР34 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-8383), а также их комбинацию.

7. Применение молочнокислой бактерии, выбранной из штамма Lactobacillus acidophilus CL0062 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4980), Lactobacillus acidophilus CL92 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-4981) и Lactobacillus fermentum СР34 (депонированного в Международном Патентном Депозитарии организмов, под номером FERM ВР-8383), а также их комбинаций для уменьшения симптомов аллергии введением в продукт питания или смешением с ним.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к противоаллергическому агенту. Изобретение также относится к применению противоаллергических агентов для облегчения аллергии и способу уменьшения симптомов аллергии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Количество пациентов, страдающих аллергией, увеличивается каждый год во многих странах, включая Японию, и сообщается о высокой частоте случаев аллергии у взрослых, один из трех в Японии. Аллергические заболевания делятся на четыре типа, типы I-IV, в зависимости от их механизма действия. Некоторые виды аллергического ринита, такие как поллиноз, бронхиальная астма и атопический дерматит являются аллергией типа I, опосредованной иммуноглобулином Е (IgE), где повышение уровня антиген-специфического IgE в крови повышает риск развития аллергических симптомов.

Механизм развития аллергии I типа следующий. Когда антиген, такой как пыльца, домашняя пыль или клещи попадают в организм, образуются антитела IgE, специфические к такому антигену, которые связываются с тучными клетками или рецепторами Fc на поверхности базофилов и сенсибилизируют субъект. Когда антиген затем проникает в тело, антиген связывается с антителом IgE с образованием комплекса. Это вызывает дегрануляцию, когда химические медиаторы в гранулах, такие как гистамин и лейкотриены, высвобождаются с развитием аллергических симптомов.

В последнее время аллергические заболевания лечат главным образом антагонистами химических медиаторов, такими как антигистамины и стероиды, используемые в качестве противовоспалительных агентов. Однако, оба из этих типов агентов обеспечивают только симптоматическую терапию и стероиды ингибируют общий иммунный ответ, приводя к побочным эффектам. Альтернативно, агенты для ингибирования высвобождения химических медиаторов путем ингибирования дегрануляции также используют, но не обнаружено фундаментальных терапевтических агентов для специфического снижения IgE антител, которые являются главным фактором развития аллергии.

Кроме того, для необходимого хронического введения желательными являются противоаллергические агенты, которые легко принимать и являющиеся высокобезопасными. Соответственно, требуются новые противоаллергические агенты, имеющие такие свойства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является обеспечение противоаллергического агента, который способен облегчать аллергический диатез путем снижения уровня IgE, который вовлечен в развитие аллергии типа I, который легко принимать и высокобезопасный, а также способа уменьшения аллергии.

С целью достижения вышеуказанной цели авторы настоящего изобретения создали модель на мышах, где уровень антиген-специфических IgE был значительно повышен без значительного повышения уровня IgG. Используя данную модель, авторы провели исследования эффекта снижения уровня IgE различными штаммами молочнокислых бактерий, которые могут влиять на кишечную иммунную систему, для обнаружения среди различных исследуемых молочнокислых бактерий определенных бактерий, имеющих особенно сильный ингибирующий эффект на продукцию IgE, таким образом создав настоящее изобретение.

В соответствии с настоящим изобретением обеспечивают противоаллергический агент, включающий в качестве активного ингредиента молочнокислую бактерию, выбираемую из группы, состоящей из молочнокислой бактерии вида Lactobacillus acidophilus, молочнокислой бактерии вида Lactobacillus fermentum и их комбинаций.

В соответствии с настоящим изобретением также обеспечивают противоаллергический агент, упомянутый выше, где указанная молочнокислая бактерия вида Lactobacillus acidophilus является бактерией штамма, выбираемого из группы, состоящей из Lactobacillus acidophilus CL0062 (депонированной в Международном Патентном Депозитарии организмов под номером FERM BP-4980), Lactobacillus acidophilus CL92 (депонированной в Международном Патентном Депозитарии организмов под номером FERM BP-4981), и их комбинаций.

В соответствии с настоящим изобретением также обеспечивают противоаллергический агент, упомянутый выше, где указанная молочнокислая бактерия вида Lactobacillus fermentum является штаммом Lactobacillus fermentum CP34 (депонированным в Международном Патентном Депозитарии организмов под номером FERM BP-8383).

В соответствии с настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается противоаллергический агент, упомянутый выше, который снижает, при назначении перорально, уровень антиген-специфического IgE в крови в модели ринита у мышей, где уровень антиген-специфического IgE в крови был повышен путем назальной непрерывной антигенной стимуляции мыши.

В соответствии с настоящим изобретением также предлагается применение определенной молочнокислой бактерии, упомянутой выше, в получении лекарственного средства для уменьшения аллергии.

В соответствии с настоящим изобретением, кроме того, предлагается способ облегчения аллергии, включающий введение эффективной дозы противоаллергического агента, упомянутого выше, субъекту, нуждающемуся в таком облегчении.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 показаны графики, представляющие изменения уровня иммуноглобулина в крови у мышей с повышенным IgE в примере 1.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий результаты экспериментов снижения уровня OVA-IgE у мышей с повышенным IgE путем введения кисломолочного продукта, проводимых в примере 2.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий результаты экспериментов подавления уровня OVA-IgE у мышей с повышенным уровнем IgE путем введения кисломолочного продукта, проводимых в примере 3.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий результаты экспериментов подавления уровня OVA-IgE у мышей с повышенным IgE путем введения кисломолочного продукта, проводимых в примере 4.

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий результаты экспериментов подавления аллергических симптомов у людей путем введения кисломолочного продукта, проводимых в примере 5.

Фиг. 6 представляет собой график, показывающий результаты экспериментов подавления аллергических симптомов у людей путем введения кисломолочного продукта, проводимых в примере 5.

ВАРИАНТЫ ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Противоаллергический агент по настоящему изобретению содержит в качестве активного ингредиента молочнокислую бактерию, выбираемую из группы, состоящей из молочнокислой бактерии вида Lactobacillus acidophilus, молочнокислой бактерии вида Lactobacillus fermentum и их комбинаций.

Молочнокислая бактерия вида Lactobacillus acidophilus может особенно предпочтительно быть штаммом Lactobacillus acidophilus CL0062 (депонированным в Международном Патентном Депозитарии организмов Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan под номером хранения FERM BP-4980 от 4 марта 1994), штаммом Lactobacillus acidophilus CL92 (депонированным в Международном Патентном Депозитарии организмов под номером хранения FERM BP-4981 от 4 марта 1994), или их комбинацией. Молочнокислая бактерия вида Lactobacillus fermentum может особенно предпочтительно быть штаммом Lactobacillus fermentum CP34 (депонированным в Международном Патентном Депозитарии организмов под номером хранения FERM BP-8383 от 23 мая 2002). Эти три бактериальных штамма хранятся по Будапештскому соглашению о международном депонировании микроорганизмов с целью процедуры Патентования. Все ограничения общественной доступности штамма Lactobacillus fermentum CP34 будут окончательно сняты после получения патента. Штаммы Lactobacillus acidophilus CL0062 и CL92 уже являются общедоступными.

Штамм Lactobacillus acidophilus CL0062 имеет следующие бактериологические характеристики:

(Морфологические свойства)

1) форма клетки; палочка,

2) подвижность; нет,

3) образование спор; нет,

4) окраска по Граму; положительная,

(Физиологические свойства)

1) продукция каталазы; отрицательная,

2) продукция индола; отрицательная,

3) восстановление нитрата; отрицательное,

4) аэробный рост; факультативные анаэробы,

5) рост при 15°С; нет,

6) образование DL-молочной кислоты из глюкозы путем гомомолочно-кислого брожения без образования газов,

7) образование кислот из углеводов

Глюкоза; +	Мелибиоза; +
Лактоза; +	Раффиноза; +
Манноза; +	Маннит; -
Фруктоза; +	Сорбит; -
Галактоза; +	Эскулин; +
Сахароза; +	Салицин; +
Арабиноза; -	N-ацетилглюкозамин; +
Мальтоза; +	Амигдалин; +
Ксилоза; -	Гентиобиоза; +
Рамноза; -	Мелизитоза; -
Целлобиоза; +	Декстрин; +
Трегалоза; +	Крахмал; -

Штамм Lactobacillus acidophilus CL92 имеет следующие бактериальные характеристики:

(Морфологические свойства)

1) форма клетки; палочка,

2) подвижность; нет,

3) образование спор; нет,

4) окраска по Граму; положительная,

(Физиологические свойства)

1) продукция каталазы; отрицательная,

2) продукция индола; отрицательная,

3) восстановление нитрата; отрицательное,

4) аэробный рост; факультативные анаэробы,

5) рост при 15°С; нет,

6) образование DL-молочной кислоты из глюкозы путем гомомолочно-кислого брожения без образования газов,

7) образование кислот из углеводов

Глюкоза; +	Мелибиоза; -
Лактоза; +	Раффиноза; +
Манноза; +	Манит; -
Фруктоза; +	Сорбит; -
Галактоза; +	Эскулин; +
Сахароза; +	Салицин; +
Арабиноза; -	N-ацетилглюкозамин; +
Мальтоза; +	Амигдалин; +
Ксилоза; -	Гентиобиоза; +
Рамноза; -	Мелизитоза; -
Целлобиоза; +	Декстрин; -
Трегалоза; +	Крахмал; -

Штамм Lactobacillus fermentum CP34 имеет следующие бактериальные характеристики:

(Морфологические свойства)

1) форма клетки; палочка,

2) подвижность; нет,

3) образование спор; нет,

4) окраска по Граму; положительная,

(Физиологические свойства)

1) продукция каталазы; отрицательная,

2) аэробный рост; факультативные анаэробы,

3) образование DL-молочной кислоты из глюкозы путем гомомолочно-кислого брожения без образования газов (+),

4) разложение углеводов

Арабиноза; -	Целлобиоза; -
Ксилоза; -	Лактоза; +
Мелибиоза; -	Трегалоза; -
Рамноза; -	Амигдалин; -
Рибоза; +	Раффиноза; -
Глюкоза; +	Мелизитоза; -
Манноза; -	Маннит; -
Фруктоза; +	Сорбит; -
Сахароза; +	Эскулин; -
Мальтоза; +	Салицин; -

Содержание вышеупомянутых молочнокислых бактерий в противоаллергическом агенте по настоящему изобретению особо не ограничено и может соответствующим образом быть установлено в зависимости от удобства получения и предпочтительной суточной дозировки. Например, когда агент находится в жидкой композиции, предпочтительное содержание бактерий составляет от 1 × 10⁷ клеток/мл до 1 × 10 ¹⁰ клеток/мл.

Противоаллергический агент по настоящему изобретению может необязательно содержать другие компоненты, в добавление к молочнокислым бактериям. Примеры таких других компонентов могут включать добавки, такие как вспомогательные вещества или компоненты среды, которые будут обсуждены ниже.

Противоаллергический агент по настоящему изобретению может быть получен путем культивирования молочнокислых бактерий в среде.

Любая среда может быть использована для культивирования, если молочнокислые бактерии могут в ней расти; может быть использовано молоко животных, снятое молоко, молочная сыворотка, среда MRS, среда GAM, среда BL, Briggs Liver Broth или другая синтетическая среда. Температура для культивирования может составлять от 25°С до 50°С, предпочтительно от 35°С до 42°С. Время культивирования может составлять от 3 часов до 48 часов, предпочтительно от 8 часов до 12 часов. Культуральная среда может быть использована в качестве противоаллергического агента по настоящему изобретению с или без дальнейшей обработки. Например, бактериальные клетки, собранные с культивированной среды путем центрифугирования или фильтрования, их лиофилизированный продукт, их продукт, обработанный теплом, или измельченные бактериальные клетки могут быть использованы в качестве противоаллергического агента по настоящему изобретению. Кроме того, бактериальные клетки в вышеуказанных формах могут, кроме того, быть сформулированы (введены в состав) или смешаны с различными пищевыми веществами, такими как напитки, таблетки, пасты или хлеб, перед применением в качестве противоаллергического агента по настоящему изобретению.

Противоаллергический агент по настоящему изобретению может вводиться любым путем, но пероральное введение является предпочтительным. Доза может быть не ниже, чем 2×10⁹ клеток в день, предпочтительно 2×10¹⁰ клеток в день для перорального введения человеку. Данная доза агента может вводиться в однократной дозе или в виде множества доз в день.

Противоаллергический агент по настоящему изобретению эффективно подавляет уровень IgE, что будет продемонстрировано в примерах, и ожидается, что он будет высокобезопасным, т.к. активным ингредиентом данного агента являются бактериальные клетки, принимаемые в качестве еды.

Способ для облегчения аллергии в соответствии с настоящим изобретением включает стадию введения эффективной дозы противоаллергического агента, упомянутого выше, субъекту, нуждающемуся в таком облегчении. Субъектом могут быть животные, такие как человек или другие млекопитающие.

Противоаллергический агент по настоящему изобретению эффективно подавляет уровень IgE в живых организмах, его легко принимать и он является высокобезопасным. Следовательно, настоящий агент является применимым для облегчения аллергии, включающей избыточный уровень IgE.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет объяснено более детально со ссылками на примеры, которые являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

Пример 1

(Получение мышей с повышенным IgE)

Самцов мышей BALB/c получали от Charles River Japan, и выращивали со свободным доступом к CE-2 (CLEA Japan, Inc.) в качестве питания. 10 мкг яичного альбумина (сокращенного как OVA ниже, производимого SIGMA CHEMICAL CO.) и 2 мг гидроксида алюминия (WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) в качестве вспомогательного вещества, суспендировали в 300 мкл физиологического раствора. Десяти из вышеуказанных мышей в возрасте шести недель вводили интраперитонеально данную суспензию на первый день сенсибилизации и на 4 день для первичной сенсибилизации. Для вторичной сенсибилизации, нос каждой мыши смачивали раствором OVA антигена, содержащим 25 мг OVA/мл физиологического раствора в течение трех секунд и эту операцию смачивания повторяли три раза в качестве одного цикла. Два цикла смачивания проводили в день и ежедневное смачивание проводили с 10 дня по 16 день для получения мышей с повышенным IgE.

Образцы крови получали из глазных вен мышей с повышенным IgE на первый день и день 17 сенсибилизации и получали образцы сыворотки. OVA-специфические IgE (сокращенные как OVA-IgE ниже), общий IgE и общий IgG в образцах сыворотки измеряли в соответствии со способами, описанными ниже. Результаты показаны на фиг. 1(а)-1(с).

Из результатов, показанных на фиг. 1(а)-1(с) понятно, что повышение уровня общего IgE и OVA-IgE в крови было значительно выше, чем таковое уровня IgE в результате сенсибилизации. Соответственно, была создана модель аллергии мыши, где уровень IgE и антиген-специфического IgE в крови были повышены без изменений всей иммунной системы.

(Измерение OVA-IgE крови)

Уровень OVA-IgE в крови измеряли методом ELISA (сэндвич-методом). 100 мкл физиологического раствора, содержащего 10 мкг/мл овечьего поликлонального антитела против мышиного IgE (торговое наименование ААМ11, производимое DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO.,LTD.) добавляли к каждой ячейке 96-луночного иммунопланшета (от CORNING INCORPORATED) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет промывали три раза фосфатным буфером (содержащим 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na ₂HPO₄ и 1,5 мМ KH ₂PO₄, сокращенном как PBS ниже), покрывали 0,5% казеином-PBS и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. После промывания планшета три раза PBS 100 мкл 1/10 разведенного PBS образца сыворотки добавляли к каждой ячейке, и подвергали реакции в течение ночи при 4°С. После промывания планшета четыре раза PBS 100 мкл 0,5% раствора казеина-PBS, содержащего 10 мкг/мл OVA, который был биотинилирован с использованием набора для биотинилирования (производимого AMERICAN QUALEX INTERNATIONAL INC.) (биотин-меченный OVA) добавляли к каждой ячейке и подвергали реакции в течении 2 часов при комнатной температуре. После промывания планшета пять раз PBS, 100 мкл раствора PBS, содержащего 1 мкг/мл стрептавидин-пероксидазы (производимой SIGMA CHEMICAL Co.) и 0,5% казеина добавляли к каждой ячейке и подвергали реакции в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания планшета пять раз 0,1% Твин 20 в PBS, 100 мкл 0,2 М лимоннокислого буфера (полученного путем смешивания 0,2 М лимонной кислоты и 0,2 М цитрата тринатрия и доведения рН до 5), содержащего 600 мкг/мл 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (сокращенной как ABTS ниже, производимой BOERINGER MANNHEIM) и 0,006% перекиси водорода, добавляли к каждой ячейке и накрывали в течение 3 часов при 37°С для окраски. После завершения реакции измеряли OD₄₀₅ и OD ₄₉₂ и истинную оптическую плотность получали значение OD ₄₀₅ - значение OD₄₉₂.

Образец крови получали от мыши, которая получала инъекцию интраперитонеально 25 мг/мл OVA в физиологическом растворе пять раз (один раз в неделю). Из образца крови получали образец сыворотки как стандартную сыворотку. Данную стандартную сыворотку разводили 1/10 PBS и полученное разведение далее пошагово разводили в два раза неиммунизированной сывороткой для получения рабочих разведений. Данные рабочие разведения подвергали измерениям значений окраски в соответствии с вышеуказанной методикой, для получения рабочей кривой. На основании данной рабочей кривой уровень OVA-IgE в образцах сыворотки получали, как относительные количества по отношению к уровню OVA-IgE в стандартной сыворотке, расцениваемой как 1.

(Измерение общего IgE в крови)

50 мкл физиологического раствора, содержащего 10 мкг/мл овечьего поликлонального антитела против мышиного IgE (торговое наименование ААМ11, производимого DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD.) добавляли к каждой ячейке 96-луночного иммунопланшета (производимого CORNING INCORPORATED) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет промывали три раза PBS, покрывали 0,5% казеином-PBS и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. После промывания планшета три раза PBS, 50 мкл 1/25 разведения образца сыворотки в 0,5% казеине-PBS добавляли к каждой ячейке, и подвергали реакции в течение ночи при 4°С. После промывания планшета четыре раза PBS, 50 мкл раствора PBS, содержащего 2 мкг/мл меченного биотином антитела против мышиного IgE (производимого YAMASA CORPORATION) и 0,5% казеина добавляли к каждой ячейке и подвергали реакции в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания планшета пять раз 0,1% Твин 20 в PBS, 50 мкл раствора PBS, содержащего 1 мкг/мл стрептавидин-пероксидазы и 0,5% казеина, добавляли к каждой ячейке и подвергали реакции в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания планшета пять раз 0,1% Твин 20 в PBS 50 мкл 0,2 М лимоннокислого буфера (рН5), содержащего 300 мкг/мл ATBS и 0,006% перекиси водорода добавляли к каждой ячейке и накрывали в течение 20-30 минут при комнатной температуре для реакции. Затем измеряли OD ₄₀₅.

С другой стороны, мышиный анти-DNP-IgE (производимый YAMASA CORPORATION), вместо образцов сыворотки, растворяли в 0,5% казеине-PBS в различных концентрациях, и подвергали таким же процедурам, что указаны выше, для получения рабочей кривой. На основании этой рабочей кривой рассчитывали уровни общего IgE в образцах сыворотки.

(Измерение общего IgG в крови)

50 мкл физиологического раствора, содержащего 1 мкг/мл козьего антитела против мышиного IgE (H + L) (торговое наименование 62-6500, производимое ZYMED LABORATORIES, INC.) добавляли к каждой ячейке 96-луночного планшета (производимого CORNING INCORPORATED) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет промывали три раза PBS, покрывали 0,5% казеином-PBS и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. После промывания планшета три раза PBS, 50 мкл 1/1000 разведения образца сыворотки в 5% казеине-PBS добавляли к каждой ячейке и подвергали реакции в течение ночи при 4°С. После промывания планшета четыре раза PBS, 50 мкл раствора PBS, содержащего 2 мкг/мл антитела против мышиного IgG( ), меченного пероксидазой (производимого CAPPEL LABORATORIES, INC.), и 0,5% казеина добавляли к каждой ячейке, и подвергали реакции в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания планшета пять раз 0,1% Твин 20 в PBS, 50 мкл 0,2 М лимоннокислого буфера (рН5), содержащего 300 мкг/мл ABTS и 0,006% перекиси водорода, добавляли к каждой ячейке и накрывали в течение 20-30 минут при комнатной температуре для реакции. Измеряли OD ₄₀₅.

С другой стороны, очищенный мышиный IgG (производимый CAPPEL LABORATORIES, INC.) вместо образцов сыворотки растворяли в 0,5% казеине-PBS в различных концентрациях и подвергали таким же процедурам, как описано выше, для получения рабочей кривой. На основании этой рабочей кривой рассчитывали уровень общего IgG в образцах сыворотки.

Пример 2

(Сравнение эффекта различных молочнокислых бактерий)

Каждый из штаммов молочнокислых бактерий, показанных в таблице 1, заранее культивировали в среде MRS в течение ночи при 37°С, и клетки собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. 9% (мас./об.) восстановленного снятого молока (содержащего 0,1% (мас./об.) экстракта дрожжей (производимого DIFCO)) сбраживали с собранными клетками при 37°С, пока молоко не сворачивалось. После сбраживания измеряли общее число клеток в каждом кисломолочном продукте. Результаты показаны в таблице 1.

Таблица 1
Штамм	Общее количество клеток (клетки/мл)
Lactobacillus acidophilus CL92 (BP-4981)	1,9 x 108
Lactobacillus bulgaricus CP1812	1,5 x 108
Lactobacillus fermentum CP34	5,3 x 10 8
Lactobacillus helveticus CP790	2,4 x 108
Lactobacillus johnsonii CP2551	2,7 x 108
Lactobacillus plantarum CP2172	5,9 x 108
Lactobacillus rhamnosus ATCC53103	1,0 x 108

Далее получали мышей с повышенным IgE таким же образом, как в примере 1 и OVA-IgE в крови измеряли на день 18 сенсибилизации таким же образом, как в примере 1. Мышей делили на группы по 10 мышей в группе с похожим средним уровнем OVA-IgE крови. Со дня 19 по день 21 сенсибилизации различные кисломолочные продукты, показанные выше, несброженное 9% (мас./об.) восстановленное снятое молоко или несброженное 9% (мас./об.) восстановленное снятое молоко, содержащее 750 мкг циклофосфамида, вводили желудочно каждой группе мышей в дозах 1 мл в день в течение трех дней. На день 22 сенсибилизации образцы крови мышей были получены из глазных вен и получены образцы сывороток. Измеряли уровень OVA-IgE и общего IgG крови. В качестве контроля образец крови мыши, которая была таким же образом сенсибилизирована, но не получала кисломолочного продукта или подобного, получали таким же образом и измеряли уровни OVA-IgE и общего IgG. Результаты показаны на фиг. 2.

Как показано на фиг. 2, в группах мышей, которым давали молоко, сброженное Lactobacillus acidophilus или Lactobacillus fermentum, достоверный ингибирующий эффект (p<0,01) на уровень OVA-IgE наблюдали по сравнению с группой, получавшей несброженное снятое молоко. Не наблюдалось достоверной разницы в уровне общего IgG в крови (не показано).

Пример 3

Следовали методике примера 2, кроме того, что использовали штаммы молочнокислых бактерий, показанные в таблице 2. Результаты измерения общего количества клеток в каждом кисломолочном продукте показаны в таблице 2. Результаты измерений OVA-IgE в крови показаны на фиг. 3.

Таблица 2
Штамм	Общее количество клеток (клетки/мл)
Lactobacillus acidophilus CL0062 (BP-4980)	4,4 x 108
Lactobacillus gasseri CP2209	4,3 x 108
Lactobacillus reuteri ATCC23272	9,6 x 10 8
Bifidobacterium breve CP2425	1,3 x 108

Как показано на фиг. 3, в группе мышей, которым давали молоко, сброженное Lactobacillus acidophilus, наблюдали достоверный ингибирующий эффект (p<0,01) на уровень OVA-IgE по сравнению с группой, получавшей несброженное снятое молоко. Не наблюдали достоверных различий в уровне общего IgG в крови (не показано).

Пример 4

(Подтверждение эффектов в более низкой дозе)

Штамм Lactobacillus acidophilus CL92 и штамм Lactobacillus fermentum CP34 соответственно прекультивировали в среде MRS в течение ночи при 37°С и клетки собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. Собранные клетки культивировали в среде MRS в течение ночи при 37°C и клетки собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. Количество клеток измеряли для каждого штамма и клетки суспендировали в 9% снятом молоке в концентрации 1 х 10⁶ клеток на 1 мл для получения суспензий.

Далее, мышей с повышенным IgE получали таким же образом, как в примере 1, и OVA-IgE в крови измеряли на день 18 сенсибилизации таким же образом, как в примере 1. Мышей делили на группы по 10 мышей в группе с похожим средним уровнем OVA-IgE крови. С дня 19 до 21 сенсибилизации вышеуказанные суспензии вводили желудочно каждой группе мышей в дозах 1 мл в день в течение трех дней. На день 22 сенсибилизации образцы крови мышей получали из глазных вен и получали образцы сыворотки. Измеряли уровни OVA-IgE и общего IgE в крови. Результаты показаны на фиг. 4.

Как показано на фиг. 4, в обоих группах мышей, получавших штамм Lactobacillus acidophilus CL92 или Lactobacillus fermentum CP34, наблюдали достоверный ингибирующий эффект на уровень OVA-IgE по сравнению с группой, которой давали несброженное снятое молоко. Не наблюдали достоверной разницы в уровне общего IgG в крови (не показано).

Скорость снижения d уровня OVA-IgE, когда вводили каждую суспензию, получали по формуле d = 1-(b/a), где а представляет собой стандартное отношение уровня OVA-IgE при потреблении несброженного снятого молока и b представляет собой стандартное отношение OVA-IgE при потреблении каждой суспензии. Обозначая концентрацию клеток суспензии, вводимой мышам s (клеток/мл), и принимая, что s пропорциональна скорости снижения d, количество клеток х (клетки/мл) в суспензии, требуемое для снижения уровня OVA-IgE наполовину, в данной экспериментальной системе получали по формуле х = (s · 0,5)/d. Используя эту формулу, получали количество клеток x для каждого бактериального штамма, используемого в примерах 2 и 3. Результаты показаны в таблице 3.

Таблица 3
Штамм	Требуемое количество клеток (клетки/мл)
Lactobacillus acidophilus CL92 (BP-4981)	1,0 x 106
Lactobacillus bulgaricus CP1812	2,0 x 108
Lactobacillus fermentum CP34	1,4 x 10 6
Lactobacillus helveticus CP790	3,3 x 108
Lactobacillus johnsonii CP2551	3,5 x 108
Lactobacillus plantarum CP2172	7,0 x 108
Lactobacillus rhamnosus ATCC53103	2,9 x 108
Lactobacillus acidophilus CL0062 (BP-4980)	5,0 x 10 8
Lactobacillus gasseri CP2209	3,1 x 109
Lactobacillus reuteri ATCC23272	3,3 x 109
Bifidobacterium breve CP2425	1,1 x 10 9

Пример 5

(Клинический эффект у людей)

Тринадцати субъектам, страдающим от круглогодичного аллергического ринита (средний возраст 22,9 ± 6,1, 6 мужчин и 7 женщин), давали, после 2 недель периода наблюдения, 100 мл/день кисломолочного продукта, содержащего от 8,0 × 10⁸ до 1,3 × 10 ⁹ клеток/мл штамма Lactobacillus acidophilus CL92 в течение 4 недель. В интервалах оценивали опросники о субъективных симптомах и на основаниях ответов симптомы оценивали в соответствии с «Классификацией тяжести аллергического ринита» принятой Японским обществом аллергологии. Симптомы ринита диагностировали в периоды в соответствии с руководством Японского Общества Аллергологии. Образцы крови получали от субъектов с интервалами, и измеряли титры IgE в крови. Кроме того, во время периода исследования записывали самую низкую температуру дня. Тяжесть (степень) заложенности носа у субъекта, частота чихания и самая низкая температура дня в течение периода исследования показаны на фиг. 5 и 6.

В течение периода исследования наиболее низкая температура дня колебалась значительно от 14°С на первый день потребления (15 ноября) до 3,7°С в последний день потребления (13 декабря) более чем на 10°С. Даже в таких условиях, ухудшающих симптомы ринита, заложенность носа имела тенденцию к уменьшению через две недели после начала потребления (тест Вилкоксона: p<0,1), и значительное улучшение наблюдали через четыре недели после начала (тест Вилкоксона: p<0,05). Частота чихания также имела тенденцию к снижению через три недели после начала потребления (тест Вилкоксона: p<0,1). В течение периода потребления наблюдали тенденцию к снижению частоты чихания, ослабление отека внутренней носовой раковины и снижение титра общего IgE в крови.