способ получения l-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к роду escherichia, в которой инактивирован ген yafa

Формула изобретения

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-треонина или L-триптофана, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии инактивирован ген yafA.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген yafA инактивирован за счет делеции ген yafA в хромосоме бактерии.

3. Способ получения L-треонина или L-триптофана, включающий выращивание бактерии по любому из п.1 или 2 в питательной среде, вызывающее продукцию и накопление L-аминокислоты в культуральной жидкости, и выделение L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислот с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой экспрессия гена yafA ослаблена.

Предшествующий уровень техники

Бактериальная система фосфоенолпируват (РЕР):фосфотрансфераза сахаров (PTS) играет важную роль в транспорте различных сахаров. Система PTS у Escherichia coli состоит из двух основных цитоплазматических белков: фермента I (enzyme I (EI)) и фосфорилирующего белка-переносчика гистидина, HPr, используемых для всех сахаров, и нескольких специфических к определенным сахарам компонентов, известных под общим названием ферменты II, включающих в себя растворимый фермент IIA ^Glc и связанный с мембраной фермент IICB ^Glc (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996, pp.1149-1174). Утилизация глюкозы сопровождается последовательным переносом фосфорной группы в системе PTS, в следующем порядке: фосфоенолпируват (РЕР) EI HPr IIA^Glc IICB^Glc глюкоза.

Было показано, что каждый белковый компонент PTS системы в Е.coli, участвующий в утилизации глюкозы, регулирует активность белка-партнера через непосредственное взаимодействие белков друг с другом. Эти регуляторные функции PTS системы зависят от степени фосфорилирования участвующего в реакции компонента. Продукт гена crr (фермент IIA^Glc) служит связующим звеном в некоторых известных регуляторных процессах. Также было показано, что продукт гена yafA (также известного как ген frsA), регуляторный белок FrsA (fermentation/respiration switch protein) образует комплекс, который специфически взаимодействует с нефосфорилированной формой фермента IIA^Glc (Коо, В.М. et al. J Biol Chem. 2004 Jul 23; 279(30): 31613-21). Указанные авторы также показали, что разрушение ген yafA повышает уровень клеточного дыхания при росте на некоторых сахарах, включая глюкозу.

В настоящее время нет сообщений, описывающих использование инактивации гена yafA для получения L-аминокислот.

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислоты с использованием указанных штаммов.

Данные цели были достигнуты путем обнаружения того факта, что ослабление экспрессии гена yafA может повысить продукцию L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L -гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена yafA в этой бактерии ослаблена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой экспрессия гена yafA ослаблена путем инактивации гена yafA.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L- глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя:

- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде с целью продукции и выделения L-аминокислоты в питательную среду, и

- сбор указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматических L-аминокислот и неароматических L-аминокислот.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L- глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.

Детальное описание наилучших способов осуществления изобретения

1. Бактерия согласно настоящему изобретению.

Бактерия, согласно настоящему изобретению, - это бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, при этом бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена yafA в такой бактерии ослаблена.

Согласно настоящему изобретению, «бактерия - продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия, согласно настоящему изобретению, выращивается в указанной питательной среде.

Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна продуцировать L-аминокислоту и вызывает накопление L-аминокислоты в культуральной среде в больших количествах, по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким, как штамм Е.coli К-12, и, предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее, чем 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее чем 1.0 г/л. Термин "L-аминокислота" включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспартат, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Термин "ароматическая L-аминокислота" включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин "неароматическая L-аминокислота" включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L -фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин наиболее предпочтительны.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, и т.д. Более точно, для систематизации родов внутри семейства Enterobacteriaceae в соответствии с систематикой, принятой NCBI (National Center for Biotechnology Information) может быть использована база данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock). Бактерия, принадлежащая к родам Escherichia или Pantoea, является предпочтительной.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia)) означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Примеры бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, использованной в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются только ею, бактерией Escherichia coli (E.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Термин «бактерия модифицирована, таким образом экспрессия гена yafA ослаблена», означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит уменьшенное количество белка FrsA, по сравнению с немодифицированной бактерией, или становится неспособной синтезировать белок FrsA.

Термин "инактивация гена yafA" означает, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Возможно также, что модифицированный участок ДНК неспособен нормально экспрессировать ген в результате делеции части гена, сдвига рамки считывания гена, введения missense/nonsense мутации(й) или модификации прилегающей к гену области, включения последовательностей, контролирующих экспрессию гена, таких как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, сайты связывания рибосомы и т.д.

Роль регуляторного белка FrsA, кодируемого геном yafA, в продукции L-аминокислот остается неясной. Однако было показано, что разрушение гена yаfА приводит к повышению клеточного дыхания при росте на нескольких сахарах, включая глюкозу (Коо, В.М. et al. J Biol Chem. 2004 Jul 23; 279(30):31613-21).

Ген yafA кодирует регуляторный белок FrsA, который образует специфический комплекс с нефосфорилированной формой белка IIA ^Glc в соотношении 1:1. Ген yafA (gi: 16128225; номера нуклеотидов с 256527 по 257771 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank) расположен между генами gpt и crl на хромосоме штамма Е.coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена yafA и аминокислотная последовательность кодируемого им регуляторного белка FrsA приведена в Списке последовательностей под номерами SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно.

Поиск BLAST позволяет сделать вывод, что ортологи гена. yafA существуют только у нескольких грамотрицательных бактерий, таких как Е.coli, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, V. vulnificus, V. parahaemolyticus и Photorhabdus luminescens (www.ncbi.nlm.nih.gov). Все указанные виды бактерий являются факультативными анаэробами, принадлежащими к группе -протеобактерий и большинство из них являются высокопатогенными.

На основе статистического анализа базы данных трансмембранных белков, встречающихся в природе, программой TMbase была построена модель трансмембранной топологии белка FrsA (Фиг.3). Программа TMpred предсказывает трансмембранные сегменты белка и их ориентацию. Предсказание основано на использовании при обсчете комбинации нескольких весовых матриц (TMbase - база данных трансмембранных участков белков К. Hofmann & W. Stoffel (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374,166, http://www.ch.embnet. org/software/TMPRED_form.html).

Данная модель обнаружила 6 устойчивых трансмембранных спиралей с общим счетом, равным 6482, и параметрами предсказания: длина ТМ-спирали между 14 и 35.

№	от	до	длина	счет	ориентация
1	205	223	(19)	513	o-i (outside-inside) снаружи-внутрь
2	328	346	(19)	1059	i-o
3	435	454	(20)	1016	o-i
4	472	487	(16)	980	i-o
5	823	841	(19)	1604	o-i
6	871	890	(20)	1310	i-o

Поскольку в последовательностях ДНК разных родов или штаммов семейства Enterobacteriaceae могут существовать некоторые различия, нуклеотидная последовательность гена yafA, подлежащего инактивации, не ограничивается последовательностью гена, приведенной в SEQ ID No:1, но также может включать последовательности генов, гомологичных последовательности, приведенной в SEQ ID No:1, кодирующих вариант белка FrsA. Термин «вариант белка», используемый в настоящем открытии, означает белок, который имеет изменения в последовательности, такие как делеции, вставки, добавки или замены аминокислот, но до тех пор, пока сохраняется активность белкового продукта, а именно регуляторного белка FrsA. Количество изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотных остатков в третичной пространственной структуре белка. Оно может варьироваться в диапазоне от 2 до 30, предпочтительней в диапазоне от 2 до 15 и наиболее предпочтительно в диапазоне от 2 до 5 в полной аминокислотной последовательности, приведенной в списке последовательностей под номером SEQ ID NO.2. Эти изменения в вариантах белка могут иметь место на участках белка, которые не существенны для функции белка. Такое изменение не приводит к нарушению третичной пространственной структуры или активности белка, так как некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию между друг другом. Эти изменения в варианте белка могут иметь место на участках белка, которые не важны для функции белка. Таким образом, вариант белка, кодируемого геном yafA, может быть представлен белком с гомологией не менее 80%, предпочтительней не менее 90%, и, наиболее предпочтительно, не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, кодируемой геном yafA и приведенной в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO.2), до тех пор, пока сохраняется активность белкового продукта, а именно регуляторного белка FrsA.

Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с помощью хорошо известных методов, например с помощью компьютерной программы BLAST 2.0, которая рассчитывает три параметра: счет, идентичность и сходство. Кроме того, ген yafA может быть представлен вариантом, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, в жестких условиях, при условии, что указанный вариант кодирует регуляторный белок FrsA. "Жесткие условия" включают такие условия, при которых специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды - не образуются. Например, демонстрацией жестких условий может служить однократная или многократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная отмывка при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при температуре 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа мембраны, используемой для блотинга, и, как правило, от рекомендаций производителя.

Например, рекомендуемая продолжительность отмывки мембраны Hybond N+nylon (Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут. Предпочтительно, отмывка может производиться от 2-х до 3-х раз. Длина зонда может быть выбрана соответствующим образом, в зависимости от условий гибридизации, и обычно варьируется в диапазоне от 100 п.о. до 1 тыс. п.о.

Инактивация указанного гена может быть выполнена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработки нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, инактивация гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83) и (Datsenko K.A. and Wanner B.L, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97:12: 6640-45), называемого также "Red-зависимая интеграция".

Инактивация гена yafA может быть установлена при помощи матриц Phenotype Microarrays (PMs) (Biolog, Inc.) с использованием в качестве репортерной системы скорости клеточного дыхания. Химическая реакция данного метода основана на окрашивании тетразолиумным красителем и последующим колориметрическим измерением скорости дыхания клеток. Подробная информация о РМ экспериментах доступна на сайте www.biolog.com. Анализ Phenotype Microarrays показал, что инактивация гена yafA повышает скорость клеточного дыхания на нескольких сахарах, включая арабинозу, фруктозу, лактозу и глюкозу (Коо, В.М. et al. J Biol Chem. 2004 Jul 23; 279(30): 31613-21).

Снижение или отсутствие в бактерии активности белка FrsA, согласно настоящему открытию, может быть установлено при сравнении с родительской немодифицированной бактерией. Кроме того, уровень экспрессии гена может быть установлен путем измерения количества мРНК, транскрибируемой геном, с помощью различных хорошо известных методов, включая блоттинг по Нозерну, метод количественного ОТ-ПЦР и подобных им методов. Количество или молекулярный вес белка, кодируемого геном, могут быть измерены хорошо известньми методами, включая SDS-PAGE с последующим иммуноблотингом блоттинг по Вестерну и подобными им методами.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия - продуцент L-аминокислоты

В качестве бактерии, согласно настоящему изобретению, которая модифицирована, таким образом, что в ней ослаблена экспрессия гена yafA, может быть использована бактерия, способная продуцировать L-ароматические или L-неароматические аминокислоты.

Бактерия, согласно настоящему изобретению, может быть получена путем ослабления экспрессии гена yafA в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия, согласно настоящему изобретению, может быть получена путем придания бактерии, в которой экспрессия гена yafA уже ослаблена, способности к продукции L-аминокислот.

Бактерия - продуцент L-треонина

Примеры родительских штаммов для получения бактерии-продуцента L-треонина, согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5,705,371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM BP-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и PERM BP-3520 (патент США 5,376,538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика (в Росии), 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Желательно, чтобы бактерия, согласно настоящему изобретению, была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких генов, перечисленных ниже:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена asd, кодирующего аспартат- -семиальдегиддегидрогеназу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок; и

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу);

Ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I Escherichia coli был расшифрован (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентраным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrA расположен между генами thrL и thrB на хромосоме штамма Е.coli К-12. Ген thrB, который кодирует гомосеринкиназу Escherichia coli, был расшифрован (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарньм номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrB расположен между генами thrA и thrC на хромосоме штамма Е.coli К-12. Ген thrC, который кодирует треонинсинтазу Escherichia coli, был расшифрован (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrC расположен между геном thrB и открытой рамкой считывания yaаХ на хромосоме штамма Е.coli К-12. Все три гена функционируют как отдельный оперон треонина.

Мутантный ген thrA, который кодирует аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, а также гены thrB и thrC, могут быть получены в составе одного оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая присутствует в штамме-продуценте треонина Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.

Ген rhtA расположен на 18 мин на хромосоме Е.coli рядом с glnHPQ опероном, который кодирует компоненты системы глутаминового транспорта. Ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541, gi:440181 в базе данных GenBank) и расположен между генами рехВ и отрХ. Элемент, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был обозначен как ген rhtA (rht: устойчивость к гомосерину и треонину). Также было показано, что мутация rhtA23 является заменой нуклеотидного остатка А на нуклеотидный остаток G в позиции 1 относительно стартового кодона ATG (ABSTRACTS of the 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with the Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).

Ген asd E.coli уже описан (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi: 16131307 в базе данных GenBank) и может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5:185) с использованием праймеров, сконструированных на основе нуклеотидной последовательности гена. Гены asd от других микроорганизмов могут быть получены подобным образом.

Ген aspC E. coli тоже уже описан (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi:16128895 в базе данных GenBank) и может быть получен методом ПЦР. Гены aspC от других микроорганизмов могут быть получены подобньм образом.

Бактерия - продуцент L-лизина

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутантов, обладающих устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются только ими, оксализин, лизингидроксамат, S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (AEC), -метиллизин, -хлорокапролактам и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, обычными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ 11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; см. патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 6 декабря, 1994 г. и получил инвентарный номер PERM P-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 29 сентября 1995 г., и штамм получил инвентарный номер FERM ВР-5252 (см. патент США 5827698).

Бактерия - продуцент L-цистеина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-цистеина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белки, участвующие в процессе секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP11155571 А2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (заявка РСТ WO 0127307 A1) и подобные им.

Бактерия - продуцент L-лейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-лейцина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающие, например, -2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP8-70879 A2), и подобные им.

Бактерия, согласно настоящему изобретению, может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD, и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия, согласно настоящему изобретению, может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (патентная заявка РФ 2001117632, Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).

Бактерия-продуцент L-гистидина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-гистидина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, РФ 2003677); Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, РФ 2119536); Е.coli NRRL В-12116-В12121 (патент США 4388405); Е.coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Е.coli Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (европейский патент ЕР1085087); Е.coli AI 80/pFM201 (патент США 6258554), и подобные им.

Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислоты

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli VL334thrC⁺(европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофным по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli К 12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм VL334thrC ⁺, ауксотрофный по L-изолейцину. Этот штамм обладает способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению, включают в себя мутантные штаммы, лишенные активности -кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью -кетоглутаратдегидрогеназы. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности -кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью -кетоглутаратдегидрогеназы и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:

E.coli W3110 sucA::Kmr

Е.coli AJ12624 (PERM BP-3853)

Е.coli AJ12628 (FERM ВР-3854)

Е.coli AJ12949 (PERM BP-4881)

Штамм Е.coli W3110 sucA::Kmr получен путем разрушения гена -кетоглутаратдегидрогеназы (в дальнейшем обозначаемого как ген "sucA") в штамме Е.coli W3110. У этого штамма активность -кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.

Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишенны активности -кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность -кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примером таких штаммов является штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6331419). Штамм Pantoea ananatis AJ13356 был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получил инвентарный номер FERM Р-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ 3356 не имеет -KGDH активности в результате разрушения субъединицы KGDH-E1 гена (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13355. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств (см. раздел Примеры). Несмотря на то, что оба штамма - AJ13355, и полученный из него штамм AJ13356, были депонированы в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания они будут упоминаться как Pantoea ananatis.

Бактерия-продуцент L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерий-продуцентов L-фенилаланина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКПМ В-8197); Е.coli HW1089 (АТСС 55371), содержащий ген pheA34 (патент США 5354672); Е.coli MWEC101-b (KR 8903681); Е.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146, и NRRL В-12147 (патент США 4407952). В качестве родительского штамма также могут быть использованы штаммы Е.coli К-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), Е.coli К-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), Е.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662), и Е.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ] названный AJ12604 (FERM BP-3579) (европейский патент ЕР 488424 В1). Кроме того, могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие повышенной активностью белка, кодируемого генами yedA или yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).

Бактерия-продуцент L-триптофана

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерий-продуцентов L-триптофана, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), дефицитные по триптофанил-тРНК синтетазе, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), обладающий аллелем serA, кодирующим фосфоглицератдегидрогеназу, устойчивую к ингибированию серином по принципу обратной связи, и аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, устойчивую к ингибированию триптофаном по принципу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), дефицитные по ферменту триптофаназе (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором усилена фосфоенолпируват-продуцирующая способность (заявка РСТ WO 9708333,патент США 6319696), и штаммы, подобные им.

Ранее было установлено, что ген yddG кодирует мембранный белок, который не вовлекается в путь биосинтеза любой L-аминокислоты и придает микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аминокислотным аналогам, когда аллель дикого типа этого гена амплифицируется в микроорганизме на высококопийном векторе. Кроме того, ген yddG может усилить продукцию L-фенилаланина или L-триптофана когда добавочные копии вводятся в клетки соответствующего штамма-продуцента (заявка РСТ WO 03044192). Поэтому желательно, чтобы бактерия-продуцент L-триптофана была в дальнейшем модифицирована таким образом, чтобы иметь усиленную экспрессию открытой рамки считывания yddG.

Бактерия-продуцент L-пролина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерий-продуцентов L-пролина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), который является дефицитным по гену ilvA и способен продуцировать L-пролин (европейская заявка ЕР 1172433). Согласно настоящему изобретению бактерия может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или более генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу, которая обладает сниженной чувствительностью к ингибированию L-пролином по принципу обратной связи (патент Германии 3127361). Дополнительно, бактерия, согласно настоящему изобретению, может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или более генов, кодирующих белки, участвующие в выведении L-аминокислот из бактериальной клетки. Такие гены представлены генами b2682 и b2683 (гены ygaZH) (европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые обладают активностью продуцировать L-пролин, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL B-12404 (патент Великобритании 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии 3127361, плазмидные мутанты, описанные Bloom F.R. et al (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34) и подобные им.

Бактерия-продуцент L-аргинина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерий-продуцентов L-аргинина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002058315) и штаммы, производные от этого штамма и имеющие в своем составе мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (европейская патентная заявка ЕР 1170358 А1), штамм-продуцент аргинина, который имеет ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтазу, введенный в него (выложенная патентная заявка Японии JP57-5693A) и подобные им.

2. Способ согласно настоящему изобретению

Способом, согласно настоящему изобретению, является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии, согласно настоящему изобретению, в культуральной среде с целью продукции и выделения L-аминокислоты в питательную среду, и сбора L-аминокислоты из питательной среды.

Согласно настоящему изобретению выращивание, сбор и очистка L-аминокислоты от культуральной или подобной ей среды может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от способа усвоения питательных веществ используемым микроорганизмом могут применяться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут применяться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут применяться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут применяться тиамин и дрожжевой экстракт.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, которые достигаются перемешиванием культуры и взбалтыванием культуры с аэрацией в диапазоне температур от 20 до 40°С, предпочтительно в диапазоне от 30 до 38°С. рН среды обычно колеблется в диапазоне значений между 5 и 9, предпочтительно между 6.5 и 7.2. рН культуры может быть доведена с помощью аммиака, карбоната кальция, различных кислот, различных оснований и буферов. Обычно выращивание продолжительностью от 1-го до 5-ти дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в жидкой среде.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из жидкой среды центрифугированием или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть собрана и очищена с применением методов ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 изображены взаимное расположение праймеров yafAL и yafAR на плазмиде pACYC184, которая используется для амплификации гена cat.

На Фиг.2 изображено конструирование фрагмента ДНК хромосомы, содержащего инактивированный ген yafA.

На Фиг.3 изображена модель трансмембранной топологии белка FrsA, построенная программой TMpred на основе статистического анализа базы данных трансмембранных белков.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно раскрыто ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном yafA. 1.

Делеция гена yafA.

Штамм с делегированным геном yafA был получен с помощью метода, первоначально разработанного Datsenko, К. А. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) и названного "Red-зависимая интеграция". В соответствии с указанной методикой были синтезированы ПЦР праймеры yafAL (SEQ ID NO:3) и yafAR (SEQ ID NO:4), гомологичные как областям хромосомы, прилегающим к гену yafA, так и гену, сообщающему устойчивость к антибиотику на плазмиде, используемой в качестве матрицы. В качестве такой матрицы для ПЦР использовалась плазмида pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (инвентарный номер Х06403 в базе данных GenBank/EMBL). Использовался следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3-х мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; и последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.

Полученный продукт ПЦР - фрагмент длиной 965 п.о. (Фиг. 1, SEQ ID NO:5) был очищен в агарозном геле и был использован для электропорации в штамм Е. coli MG1655, содержащий плазмиду pKD46, содержащую температурочувствительный репликон. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит фрагмент ДНК фага , (инвентарный номер последовательности J 02459 в базе данных GenBank) длиной 2,154 нуклеотида (31088-33241), а также содержит гены A, Red гомологичной системы рекомбинации ( , , ехо гены) под контролем промотора Р_araB , индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.

Электрокомпетентные клетки были приготовлены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в LB среде, содержащей ампициллин (100 мг/л), разводили в 100 раз при помощи 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру выращивали с аэрацией при 30°С до достижения ею значений оптической плотности OD₆₀₀ 0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными, путем концентрирования их в 100-раз и трехкратной отмывки ледяной деионизированной Н₂O. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и 100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим хлорамфеникол в концентрации 30 мкг/мл и выращивали при 37°С для отбора Cm ^R рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину. 2. Подтверждение делении гена yafA с помощью ПЦР.

Мутант с делегированным геном yafA, содержащий ген устойчивости к Cm был проверен с помощью ПЦР. Локус-специфические праймеры yafA1 (SEQ ID NO:6) и yafA2 (SEQ ID NO:7) использовались для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для проверки с помощью ПЦР: денатурация при 94°С в течение 3-х мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма yafA ⁺ MG1655, составила 1403 п.о. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 yafA::cat составила 1069 п.о. (Фиг.2). Мутантный штамм был назван MG1655 yafA::cat.

Пример 2. Продукция L-треонина штаммом Е.coli B-3996- yafA

Для проверки влияния инактивации гена yafA на продукцию треонина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 yafA::cat были перенесены в штамм-продуцент L-треонина Е, coli ВКПМ В-3996 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм В-3996- yafA.

Оба штамма Е.coli, В-3996 и B-3996- yafA, выращивали в течение 18-24 часов при 37°С на чашках с L-агаром.

Для получения посевной культуры штаммы выращивали на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18-ти часов в пробирках объемом 20×200-мм, содержащих 2 мл L-бульона, дополненного глюкозой до конечной концентрации, составляющей 4%. После этого в среду для ферментации внесили посевной материал в объеме 0.21 мл (10%). Ферментацию проводили в 2 мл минимальной среды для ферментации в пробирках объемом 20×200-мм. Клетки выращивали в течение 65-ти часов при 32°С с перемешиванием на роторной качалке в режиме 250 об/мин.

После культивирования количество L-треонина, которое накопилось в среде, определяли с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1(v/v)). Для визуализации применяли раствор нингидрина (2%) в ацетоне. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали, L-треонин элюировали в 0.5% водном растворе CdCl₂ , после чего количество L-треонина определяли на спектрофотометре при длине волны 540 нм. Результаты 10-ти независимых экспериментов представлены в Таблице 1. Как следует из Таблицы 1, штамм В-3996- yafA вызывает накопление большего количества L-треонина по сравнению со штаммом В-3996.

Для ферментации использовалась среда следующего состава (г/л):

Глюкоза	80.0
(NH4) 2SO4	22.0
NaCl	0.8
KH2PO 4	2.0
MgSO 4·7H2O	0.8
FeSO4·7H 2O	0.02
MnSO4·5H2O	0.02
Тиамин HCl	0.0002
Дрожжевой экстракт	1.0
СаСО3	30.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2-х часов. Значение рН было установлено равным 7.0. Антибиотик добавляли в среду после стерилизации.

Таблица 1.
Штамм	OD540	Количество L-треонина, г/л
В-3996	19.6±0.8	26.0±1.2
B-3996- yafA	20.1±0.5	27.8±1.0

Пример 3. Продукция L-лизина штаммом Е.coli AJ11442- уаfA

Для проверки влияния инактивации гена yafA на продукцию лизина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 yafA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент лизина Е, coli WC196 (pCABD2) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм WC196(pCABD2)- yafA. Плазмида pCABD2 содержит ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу и несущий мутацию, которая снижает чувствительность к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, ген lysC, кодирующий аспартокиназу III, несущий мутацию, которая снижает чувствительность к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу, и ген устойчивости к стрептомицину (патент США 6040160).

Оба штамма Е.coli, WC 196(pCABD2) и WC196(pCABD2)- yafA могут быть выращены в L-среде, содержащей стрептомицин (20 мг/л), при температуре 37°С и 0.3 мл полученной культуры могут быть внесены в 20 мл среды для ферментации, содержащей необходимые компоненты, во флаконы объемом 500 мл. Выращивание может проводиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратной качалки со скоростью взбалтывания 115 об/мин. После выращивания количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде может быть измерено известным методом (Biotech-analyzer AS210 manufactured by Sakura Seiki Co.). После этого выход L-лизина может быть рассчитан по отношению к потребленной глюкозе для каждого из штаммов.

Для ферментации может быть использована среда следующего состава (г/л):

Глюкоза 40

(NH4) 2SO4	24
К2HPO 4	1.0
MgS0 4·7H2O	1.0
FeSO4·7H 2O	0.01
MnSO4·5H2O	0.01
Дрожжевой экстракт	2.0

Значение рН устанавливается равным 7.0 с помощью КОН, а среда автоклавируется при температуре 115°С в течение 10-ти минут. Глюкоза и MgSO ₄·7H₂O стерилизуются раздельно. СаСО₃ стерилизуется сухим жаром при температуре 180°С в течение 2-х часов и добавляется к среде до конечной концентрации 30 г/л.

Пример 4. Продукция L-цистеина штаммом Е.coli JM15(ydeD)- yafA

Для проверки влияния инактивации гена yafA на продукцию L-цистеина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 yafA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-цистеина JM15(ydeD) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм JM15(ydeD)- yafA.

Штамм Е.coli JM15(ydeD) является производным штамма Е.coli JM15 (патент США 6218168), который может быть трансформирован с помощью ДНК, несущей ген ydeD, который кодирует мембранный белок и не вовлечен в путь биосинтеза никакой L-аминокислоты (патент США 5972663).

Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина приведены подробно в примере 6 патента США 6218168.

Пример 5. Продукция L-лейцина штаммом Е.coli 57- yafA

Для проверки влияния инактивации гена yafA на продукцию L-лейцина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 yafA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лейцина 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм 57-pMW- yafA.

Оба штамма Е.coli, 57 и 57-yafA, могут культивироваться при температуре 37°С в течение 18-24 часов на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры штаммы могут быть выращены на роторной качалке (в режиме 250 об/мин) при 32°С в течение 18-ти часов в пробирках объемом 20×200-мм, содержащих 2 мл L-бульона с добавлением 4% сахарозы. Далее, в среду для ферментации может быть внесен посевной материал (10%) в объеме 0.21 мл. Ферментация может проводиться в пробирках объемом 20×200 мм в 2 мл минимальной среды для ферментации. Клетки могут выращиваться в течение 48-72 часов при температуре 32°С со встряхиванием в режиме 250 об/мин. Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1).

Для ферментации может быть использована среда следующего состава (г/л):

Глюкоза	60.0
(NH4) 2SO4	25.0
К2HPO 4	2.0
MgSO 4*7H2O	1.0
Тиамин	0.01
CaCO3	25.0

Глюкоза и СаСО₃ стерилизуются раздельно. Значение рН среды доводится до 7.2.

Пример 6. Продукция L-гистидина штаммом Е.coli 80- yafA

Для проверки влияния инактивации гена yafA на продукцию L-гистидина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 yafA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент гистидина E.coli 80 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм 80- yafA. Штамм 80 был описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-7270.

Оба штамма Е.coli, 80 и 80- yafA, могут быть выращены в L-бульоне при температуре 29°С в течение 6 часов. Далее, 0.1 мл полученной культуры может быть внесен в пробирки объемом 20×200-мм, содержащие 2 мл среды для ферментации, и культивироваться при температуре 29°С в течение 65-ти часов со встряхиванием на роторной качалке (в режиме 350 об/мин). После культивирования количество гистидина, которое накопилось в среде, может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1). Для визуализации аминокислот в пятнах может быть использован 0.5%-ный раствор нингидрина в ацетоне.

Для ферментации может быть использована среда следующего состава (г/л):

Глюкоза	100.0
Мамено (гидролизат бобов сои)	0.2 по общему азоту
L-пролин	1.0
(NH 4)2SO4	25.0
КН 2PO4	2.0
MgSO4·7H 2O	1.0
FeSO4·7H2O	0.01
MnSO 4	0.01
Тиамин	0.001
Бетаин	2.0
СаСО 3	60.0

Глюкоза, пролин, бетаин и СаСО₃ стерилизуются раздельно. Перед стерилизацией рН доводится до значения 6.0.

Пример 7. Продукция L-глутамата штаммом Е.coli VL334thrC ⁺- vafA

Для проверки влияния инактивации гена yаfA на продукцию L-глутамата фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 yafA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-глутамата Е.coli VL334thrC⁺(европейский патент ЕР 1172433) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм VL334thrC⁺- yafA.

Оба штамма, VL334thrC⁺ и VL334thrC⁺- yafA, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл среды для ферментации. Среда для ферментации содержит глюкозу (60 г/л), сульфат аммония (25 г/л), КН₂PO₄ (2 г/л), MgSO₄ (1 г/л), тиамин (0.1 мг/мл), L-изолейцин (70 мкг/мл), и мел (25 г/л). рН доводилось до значения 7.2. Глюкоза и мел стерилизуются раздельно. Культивирование может проводиться при температуре 30°С в течение 3-х дней со встряхиванием. После культивирования количество произведенного L-глютамата может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1%-ный раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50%-ном этаноле с 0.5%-ным CdCl ₂.

Пример 8. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ12739- yafA

Для проверки влияния инактивации гена yafA на продукцию L-фенилаланина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 yafA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент фенилаланина AJ 12739 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм AJ12739- yafA. Штамм AJ12739 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197.

Оба штамма, AJ12739- yafA и AJ12739, могут культивироваться при температуре 37°С в течение 18-ти часов в питательном бульоне, и 0.3 мл полученной культуры может быть внесено в пробирки объемом 20×200-мм, содержащие 3 мл среды для ферментации, и культивироваться при температуре 37°С в течение 48 часов со встряхиванием на роторной качалке. После культивирования, количество фенилаланина, которое накопилось в среде, может быть определено с помощью ТСХ.

Для ферментации может быть использована среда следующего состава, (г/л):

Глюкоза	40.0
(NH4) 2SO4	16.0
K2HPO 4	0.1
MgSO 4·7H2O	1.0
FeSO4·7H 2O	0.01
MnSO4·5H2O	0.01
Тиамин HCl	0.0002
Дрожжевой экстракт	2.0
Тирозин	0.125
СаСО3	20.0

Глюкоза и сульфат магния стерилизуются отдельно. СаСО₃ стерилизуется сухим жаром при 180°С в течение 2-ух часов. рН доводится до 7.0.

Пример 9. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (pGH5)- yafA

Для проверки влияния инактивации гена yafA на продукцию L-триптофана фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 yafA::cat были перенесены в штамм-продуцент триптофана Е.coli SV164 (pGH5) с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), с получением штамма SV164(pGH5)- yafA. Штамм SV164 имеет аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, которая не ингибируется триптофаном по принципу обратной связи. Плазмида pGH5 несет мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не ингибируется серином по принципу обратной связи. Штамм SV164 (pGH5) был детально описан в патенте США No. 6180373 или в европейском патенте ЕР 0662143.

Оба штамма, SV164(pGH5)- yafA и SV164(pGH5), культивировались со встряхиванием при температуре 37°С в течение 18-ти часов в питательном бульоне объемом 3 мл с добавлением тетрациклина (5 мкг/мл, маркер плазмиды pGH5). Полученные культуры (в объеме 0.3 мл каждая) были внесены в пробирки объемом 20×200 мм, содержащие 3 мл среды для ферментации с тетрациклином (5 мкг/мл) и культивировались при температуре 37°С в течение 72-х часов на роторной качалке при 250 об/мин. После культивирования, количество триптофана, которое накопилось в среде, было определено применением ТСХ как описано в примере 8. Компоненты среды для ферментации перечислены в Таблице 2 и стерилизуются в отдельных группах (А, В, С, D, Е, F, и Н) для того, чтобы избежать неблагоприятных взаимодействий в процессе стерилизации. Результаты восьми независимых процессов ферментации в пробирках приведены в Таблице 3. Как следует из Таблицы 3, штамм SV164(pGH5)- yafA вызывал накопление большего количества L-триптофана, по сравнению со штаммом SV164(pGH5).

Таблица 2
Группы	Компонент	Конечная концентрация, г/л
А	КН2PO4	1.5
	NaCl	0.5
	(NH4)2SO 4	1.5
	L-Метионин	0.05
	L-Фенилаланин	0.1
	L-Тирозин	0.1

	Мамено (общий N)			0.07
В	Глюкоза			40.0
	MgSO 4·7H2O			0.3
С	CaCl 2			0.011
D	FeSO4·7H 2O			0.075
	Цитрат натрия			1.0
E	Na2MoO4·2H 2O			0.00015
	Н3ВО 3			0.0025
	CoCl2 ·6Н2O			0.00007
	CuSO 4·5H2O			0.00025
	MnCl 2·4H2O			0.0016
	ZnSO 4·H2O			0.0003
F	Тиамин HCl			0.005
G	СаСО3			30.0
H	Пиридоксин			0.03
PH раствора А доводится до значения 7.1 с помощью NH 4OH.
Таблица 3
Штамм		OD540	Количество L-триптофана, г/л
SV164(pGH5)		8.4±0.2	4.4±0.1
SV164(pGH5)- yafA		7.7±0.4	4.8±0.5

Пример 10. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA- yafA

Для проверки влияния инактивации гена yafA на продукцию L-пролина фрагменты ДНК из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 yafA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-пролина Е.coli 702ilvA с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм 702ilvA- yafA. Штамм 702ilvA был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-8012.

Оба штамма Е.coli, 702ilvA и 702ilvA- yafA, могут выращиваться в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Далее эти штаммы могут культивироваться в условиях, описанных в Примере 8.

Пример 11. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382- yafA Для проверки влияния инактивации гена yafA на продукцию L-аргинина, фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 yafA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент аргинина Е.coli 382 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм 382- yаfА. Штамм 382 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926.

Оба штамма, 382- уаfA и 382, могут быть культивированы при температуре 37°С в течение 48 часов со встряхиванием на роторной качалке.

После культивирования количество L-аргинина, которое накопилось в среде, может быть определено методом бумажной хроматографии с использованием следующей подвижной фазы: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). Для визуализации может быть использован 2%-ный раствор нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-аргинин, может быть вырезано, L-аргинин может быть элюирован в 0,5%-ном водном растворе CdCl₂ и количество L-аргинина может быть оценено на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

Для ферментации может быть использована среда следующего состава, (г/л):

Глюкоза	48.0
(NH4) 2SO4	35.0
КН2PO 4	2.0
MgSO 4·7H2O	1.0
Тиамин HCl	0.0002
Дрожжевой экстракт	1.0
L-изолейцин	0.1
СаСО3	5.0

Глюкоза и сульфат магния стерилизуются отдельно. СаСО₃ стерилизуется сухим жаром при температуре 180°С в течение 2-х часов. рН доводится до 7.0.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.

Промышленная применимость

Согласно настоящему изобретению продукция L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутамин, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин бактерий семейства Enterobacteriaceae может быть усилена.