способ получения питательной среды для культивирования yersinia enterocolitica

Формула изобретения

Способ получения питательной среды для культивирования Yersinia enterocolitica, предусматривающий приготовление мясопептонного агара, его стерилизацию и охлаждение, отличающийся тем, что мясопептонный агар охлаждают до 45-50°С, добавляют в него экстракт головного мозга крупного рогатого скота в количестве 5-10 мас.%, полученный путем экстрагирования измельченного головного мозга крупного рогатого скота в водопроводной воде в течение двух часов при 37°С добавлением в него 0,5%-ного раствора хлорида натрия и стерилизации в автоклаве в течение 15-20 мин при 121°С полученную питательную среду взбалтывают.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для культивирования микроорганизмов, накопления биомассы микроорганизмов, а также приготовления биопрепаратов (антигенов для реакций агглютинации, непрямой гемагглютинации).

Известно культивирование чистых культур микроорганизмов на обычных питательных средах, в частности - на мясопептонном агаре (МПА) (Розанов Н.И. Справочник по микробиологической технике. Москва, 1957, с.46). Данный метод основан на внесении в 1 л мясной воды 10 г пептона и 5 г поваренной соли. Компоненты питательной среды нагревают до кипения в течение 30 секунд, устанавливают рН 7,2-7,4, добавляют 30 г агар-агара, нагревают до полного растворения и проверяют рН среды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем среду стерилизуют при 120°С в течение 15-20 мин. Однако известный способ имеет существенные недостатки: при выращивании чистых культур микроорганизмов рода Yersinia на поверхности МПА наблюдают скудный рост Y. enterocolitica и длительное культивирование (в течение 48-72 ч).

Выделение микроорганизмов и производство бактерийных препаратов зависят от полноценного состава примененных питательных сред: это касается, прежде всего, содержания в питательной среде пластического материала для построения тела микробных клеток, а также источников энергии.

Задачей изобретения является повышение эффективности культивирования микроорганизмов рода Yersinia, способ осуществляется путем приготовления мясопептонного агара, его стерилизации и охлаждения, причем охлаждают до 45-50°С, добавляют в него экстракт головного мозга крупного рогатого скота в количестве 5-10 мас.%, полученный путем экстрагирования измельченного головного мозга крупного рогатого скота в водопроводной воде в течение двух часов при 37°С, добавлением в него 0,5%-ного раствора хлорида натрия и стерилизации в автоклаве в течение 15-20 минут при 121°С, полученную питательную среду взбалтывают.

Предлагаемый метод позволяет сократить сроки культивирования микроорганизмов в 2-2,5 раза и обеспечивает обильный рост культуры Yersinia.

Экстракт головного мозга крупного рогатого скота стимулирует рост бактерий за счет содержания разнообразных веществ: белков, углеводов, липидов, минеральных и экстрактивных веществ.

Химический состав нервной ткани очень сложный. В сером и белом веществе головного мозга содержится вода - 74,0-82,7; белки - 33,0-51,0; общий азот 2,06-3,19 и липиды - 25,0-40,0 (Чечеткин А.В. и др. Биохимия животных, М., 1982, с.493).

В сером веществе мозга присутствуют белки нейроглобулины и нейростромин, в составе которых содержится до 0,5% фосфора. Около 20-45% всех органических веществ ядер серого и белого вещества приходится на долю нуклеиновых кислот. В нервной ткани содержатся гликоген (100-150 мг%), глюкоза 150 мг%, пентозы, гликолипиды, которые состоят из остатков глюкозы, галактозы, сфингозина, высших жирных кислот и нейраминовой кислоты. Состав липидных веществ головного мозга отличается от их состава в других органах и тканях большим количеством фосфолипидов, холестерола и холестеридов, цереброзидов и в небольшом количестве - глицеридов. Минеральные вещества нервной ткани распределены в разных отделах нервной системы равномерно. В массе головного мозга присутствуют К, Na, Са, Mg, Cu, Fe, Al, Zn, Mn, Co, P, Cl, I, S. В нервной ткани содержатся азотистые и безазотистые низкомолекулярные вещества. Из азотистых экстрактивных веществ присутствуют креатин, фосфокреатин, АТФ и АДФ, свободные аминокислоты, холин, ацетилхолин, серотонин, аминомасляная кислота, мочевая кислота, глютамин, гистамин, аспарагин и др. К безазотистым экстрактивным веществам относят глюкозу, инозит, лактат, пируват, триозо- и гексозофосфаты.

Таблица 1 Сравнительные показатели минерального состава тканей скелетной мускулатуры и головного мозга
Содержание химических элементов, мг% к сырой массе	Скелетная мускулатура	Головной мозг
Na	65-150	150-220
К	250-400	290-340
Са	4-9	8-10
Mg	2,2-2,8	14-17
Cl	60-70	108-222
Р	18	7
S	6	10

Таким образом, вышесказанное свидетельствует о том, что головной мозг крупного рогатого скота содержит больше разнообразных минеральных, экстрактивных веществ, белков, углеводов и липидов, чем скелетная мускулатура.

Описание опыта

Культуры Y. enterocolitica серовариантов 0:3 и 0:9 выращивали в чашках Петри на поверхности питательного агара, содержащего 10% экстракта головного мозга крупного рогатого скота, инкубировали аэробно при +28°С.

Питательный агар готовили согласно инструкции, указанной на флаконе (дата изготовления 06.2002. Партия №103. Ярославская обл., г.Углич, OOO «БиоКомпас-С». ТУ 10-02-02-789-176-94).

Экстракт головного мозга готовили по следующей методике: свежий, очищенный от оболочек головной мозг крупного рогатого скота массой 200 г нарезали кубиками и пропускали через насадку (диаметр отверстий 5 мм) бытовой мясорубки, смешивали с двукратным объемом водопроводной воды. С целью экстрагирования в течение двух часов полученную кашицу инкубировали при +37°С.

Экстракт фильтровали через ватно-марлевый фильтр в чистый флакон и добавляли в качестве буфера 0,5%-ный раствор хлорида натрия до 400 мл (рН 7,0-7,2). После чего флакон с экстрактом головного мозга помещали в автоклав при 121°С на 15-20 мин.

Соединение компонентов экспериментальной питательной среды осуществляли с соблюдением асептики в стерильном боксе: 100 мл питательного агара охлаждали до 45-50°С, после чего стерильной пипеткой вносили 10 мл экстракта головного мозга.

На экспериментальную среду высевали взвеси Y. enterocolitica серовариантов 0:3 и 0:9 в разведении 10⁵ с исходной концентрацией 1 млрд. м.т., приготовленные на 0,5-0,55%-ном растворе хлорида натрия. На поверхность агаровой пластинки наносили взвесь иерсиний в объеме 0,4 мл и растирали по поверхности шпателем.

Результаты роста учитывали после инкубирования посевов при температуре 28°С в течение 24 ч, сравнивая образовавшиеся колонии иерсиний в опытных и контрольных чашках Петри (МПА без экстракта мозга).

Биохимические свойства культур Y. enterocolitica серовариантов 0:3 и 0:9, выращенные на опытной и контрольной средах, сравнивали, используя набор биохимических тестов (Энтеробактерии. Руководство для врачей, под ред. Покровского В.И. Москва, 1985, с.226).

Пример 1. Подбор оптимальной температуры МПА

МПА готовили согласно инструкции, после чего в среду вносили экстракт головного мозга при различных температурных режимах.

Экспериментально установлено, что при температуре ниже 45-50°С МПА приобретает плотную консистенцию и не смешивается с экстрактом, а при 50-55°С и 55-60°С МПА сохраняет жидкую консистенцию и при внесении в среду экстракта образуются серо-белые хлопья вследствие свертывания белков.

Поэтому считаем, что оптимальная температура МПА для смешивания с экстрактом головного мозга является 45-50°С.

Пример 2. Соотношение компонентов питательной среды

Изучение характера роста иерсиний на питательной среде проводили при следующих соотношениях экстракта к МПА: 1/100, 5/100, 10/100, 15/100, 20/100 и 0/100 (контроль).

Таблица 2 Подбор количества экстракта головного мозга в МПА
Содержание экстракта головного мозга, %	Компоненты питательной среды		Морфологическая характеристика колоний Y. Enterocolitica
	МПА, мл	Экстракт головного мозга, мл
1	100	1	мелкие (0.3-0,5 мм), серо-белые, непрозрачные, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью
5	100	5	сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 2-6 мм, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью
10	100	10	сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 2-6 мм, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью
15	100	15	сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 2-6 мм, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью
20	100	20	сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 2-6 мм, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью
0 (контроль)	100	-	мелкие (0.3-0,5 мм), серо-белые, непрозрачные, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью

Из таблицы 2 видно, что при внесении 1 мл (1 мас.%) экстракта в 100 мл МПА скорость и характер роста микроорганизмов существенно не отличались от контроля. Так, через 48 часов на поверхности МПА с экстрактом иерсиний формировали мелкие (0,3-0,5 мм), серо-белые, непрозрачные колонии округлой формы с блестящей, гладкой поверхностью и ровными краями.

При внесении в 100 мл МПА 5-10 мл (5-10 мас.%) экстракта наблюдали обильный рост иерсиний через 20-24 часа инкубации. Иерсинии формировали сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром от 2 до 6 мм, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью. В дальнейшем при увеличении содержания экстракта в МПА до 20 мл (20 мас.%) скорость и характер роста иерсиний не отличались от показателей предыдущего варианта (табл.2).

Таким образом, оптимальное содержание экстракта головного мозга в МПА составляет 5-10 мас.% или 5-10 мл в 100 мл МПА.

Пример 3. Экспозиция и температурный режим экстрагирования головного мозга

Экстрагирование измельченного головного мозга крупного рогатого скота проводили при температуре 25, 37 и 45°С в термостате в течение 1, 2 и 4 часов. Затем профильтрованный экстракт вносили в МПА, после чего сравнивали количество колоний иерсиний, образовавшихся через 20-24 часа инкубирования в термостате при 28°С на поверхности известной (контроль) и предлагаемой (с экстрактом мозга) питательной среды (табл.3).

Таблица 3 Количество колоний иерсиний на экспериментальной среде при различных режимах
Температура экстрагирования, °С	Экспозиция, час
	1	2	4
25	98	119	127
37	135	Сплошной рост	Сплошной рост
45	141	123	117

В контрольных чашках Петри (без экстракта) образовалось 84 колоний Y. enterocolitica.

Экспериментально установлено, что количество колоний иерсиний, образовавшихся на поверхности питательной среды с экстрактом головного мозга, полученного при экстрагировании в течение 1-4 часов при 25°С, существенно не отличалось от контроля и составляло 98, 119 и 127 колоний соответственно.

На поверхности экспериментальной среды с экстрактом головного мозга, полученного путем экстрагирования при 37°С в течение часа, образовалось 135 колоний, а при экстрагировании в течение 2-4 часов отмечали сплошной рост Y. enterocolitica.

В дальнейшем при увеличении температуры экстрагирования до 45°С в течение 1, 2 и 4 часов количество колоний иерсиний, образовавшихся на поверхности питательной среды с экстрактом головного мозга, уменьшалось до 141, 123 и 117 соответственно.

Таким образом, оптимальный режим для получения экстракта головного мозга крупного рогатого скота является экспозиция 2 часа при 37°С.

Пример 4. Сравнение культурально-биохимических свойств иерсиний при известном и предлагаемом способе

На поверхности МПА с экстрактом головного мозга через 18 ч инкубирования отмечали формирование единичных колоний, через 20-24 ч культуры иерсиний образовывали сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью, диаметром до 6 мм. При этом колонии иерсиний сероварианта 0:9 были крупнее (4-6 мм), чем колонии иерсиний сероварианта 0:3 (2-4 мм). Через 36 ч культивирования края колоний иерсиний соединялись, образуя сплошной рост на поверхности экспериментальной среды (табл.4, 5).

Таблица 4 Морфологическая характеристика колоний и биохимические свойства Y. Enterocolitica серовариантов 0:3 и 0:9
Прототип (культивирование иерсиний на питательном агаре)			Предлагаемый способ (культивирование иерсиний на питательном агаре с экстрактом головного мозга)
	Y. enterocolitica		Y. enterocolitica
	0:3	0:9	0:3	0:9
Морфология колоний	мелкие (0,3-0,5 мм), серо-белые, непрозрачные, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью	мелкие (0,3-0,5 мм), серо-белые, непрозрачные, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью	сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 2-4 мм, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью	сочные, выпуклые, непрозрачные, серо-белые колонии, диаметром 4-6 мм, с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью
Биохимические тесты
Глюкоза	+	+	+	+
Сахароза	+	+	+	+
Лактоза	-	-	-	-
Сорбит	+	+	+	+
Галактоза	+	+	+	+
Мальтоза	+	+	+	+
Рамноза	-	-	-	-
Раффиноза	-	-	-	-
D-арабиноза	-	-	-	-
Желатин	-	-	-	-
Маннит	+	+	+	+
Цитохромоксидаза	-	-	-	-
Нитратредуктаза	+	+	+	+
Каталаза	+	+	+	+
Подвижность	+	+	+	+
Фенилаланиндезаминаза	-	-	-	-
Аргениндегидролаза	-	-	-	-
Лизиндекарбоксилаза	-	-	-	-
Индол	-	-	-	-
Сероводород	-	-	-	-
Уреаза	+	+	+	+
Цитрат Симмонса	-	-	-	-
Ацетат натрия	-	+	-	+
Реакция Фогеса-Проскауэра	+	+	+	+
Реакция с метиловым красным	+	+	+	+

В контроле (МПА без экстракта головного мозга) формирование мелких (0,3-0,5 мм), серо-белых, непрозрачных колоний Y. enterocolitica с ровными краями и блестящей, гладкой поверхностью наблюдали через 48 ч (табл.5).

В окрашенных по Граму мазках, приготовленных из колоний иерсиний, выросших на экспериментальной и контрольной среде, Yersinia enterocolitica представляли мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами.

При изучении подвижности Y. enterocolitica выделенные культуры засевали в полужидкий агар и культивировали при 28°С в течение 48 часов. О наличии подвижности иерсиний свидетельствовало помутнение среды в пробирках. Культуры иерсиний уже в первые сутки ферментировали глюкозу, сахарозу, сорбит, галактозу, мальтозу, маннит; обладали ферментами нитратредуктазой, каталазой и не расщепляли D-арабинозу, рамнозу, раффинозу, лактозу, не разжижали желатин; не обладали энзимами оксидазой, аргининдегидролазой, фенилаланиндезаминазой, триптофандезаминазой, лизиндекарбоксилазой; не продуцировали сероводород. Мочевину ферментировали в течение 24 часов при 28°С. Y. enterocolitica не утилизировали натрия цитрат, а ацетат натрия использовали микроорганизмы сероварианта 0:9. Реакция Фогеса-Проскауэра и с метиловым красным при 28°С положительна.

Экспериментально установлено, что иерсинии, выращенные на МПА и МПА с экстрактом головного мозга не отличаются по биохимическим свойствам, что позволяет рекомендовать предлагаемую среду для накопления биомассы иерсиний.

Таблица 5 Сравнительная таблица сроков культивирования Y. enterocolitica
Время культивирования, час	Способ
	Известный (МПА), кол-во колоний	Предлагаемый (МПА с экстрактом головного мозга), кол-во колоний
12	-	-
16	-	-
18	-	7
20	-	145
24	-	254
36	6	Сплошной рост
48	99	Сплошной рост

Данные таблицы 5 доказывают, что количество колоний иерсиний на предлагаемой питательной среде увеличивается, а срок появления колоний Y. enterocolitica сокращается в 2-2,5 раза

Таким образом, предлагаемая питательная среда для накопления биомассы микроорганизмов позволяет:

1) выращивать микроорганизмы;

2) получать обильный рост культур микроорганизмов;

3) выделять чистые культуры микроорганизмов посевом на МПА с добавлением 5-10 мас.% экстракта головного мозга крупного рогатого скота;

4) использовать полученную биомассу микроорганизмов для приготовления биопрепаратов;

5) длительно сохранять свежевыделенные и производственные культуры;

6) сократить сроки культивирования в 2-2,5 раза.