иммуномодулятор с противоопухолевой активностью и лекарственное средство на его основе
Классы МПК: | A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот A61P37/02 иммуномодуляторы A61P35/00 Противоопухолевые средства |
Автор(ы): | Петров Рем Викторович (RU), Михайлова Августа Алексеевна (RU), Фонина Лариса Алексеевна (RU), Гурьянов Сергей Алексеевич (RU), Белевская Раиса Григорьевна (RU), Трещалина Елена Михайловна (RU), Барышников Анатолий Юрьевич (RU), Седакова Людмила Алексеевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН) (RU), ГУП г. Москвы Международный Научный и Клинический Центр "Интермедбиофизхим" (ГУП МНКЦ "ИНТЕРМЕДБИОФИЗХИМ") (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2005-04-27 публикация патента:
20.09.2006 |
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается иммуномодулятора с противоопухолевой активностью и лекарственного средства на его основе. Сущность: изобретение включает иммуномодулятор, представляющий собой пентапептид формулы Val-Val-Tyr-Pro-Asp, и лекарственное средство на его основе (жидкая и сухая форма). Как сам пентапептид, так и его лекарственная форма обладают противоопухолевой активностью, вызывая в малых дозах достоверное торможение опухоли, и при этом не оказывают вредных для организма воздействий. Преимущество изобретения заключается в выявлении нового низкомолекулярного пептида, обладающего иммуномодулирующей активностью, и создании на его основе противоопухолевого препарата. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.
Формула изобретения
1. Пентапептид формулы Val-Val-Tyr-Pro-Asp в качестве иммуномодулятора с противоопухолевой активностью.
2. Лекарственное средство, обладающее противоопухолевой активностью, представляющее собой высушенную смесь пентапептида формулы Val-Val-Tyr-Pro-Asp с наполнителем или его водный раствор.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и заключается в применении нового пентапептида формулы Val-Val-Tyr-Pro-Asp и приготовленного на его основе лекарственного средства в комплексной терапии рака при лечении и последующей профилактике.
Известно, что опухолевые клетки независимо от их природы выделяют вещества, угнетающие или нарушающие нормальное функционирование иммунной системы [Miescher S., Whiteside T.L., Carrel., Eliender V.. J. Immuol., 1986, Functional properties of tumor-infiltrating and blood lymphocytes in patients with solid tumors: effects of tumor cells and their supernatants on proliferative responses of lymphocytes v.136, №5, p. 1899-1907]. Показано, например, что характерная для острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) дисфункция Т-лимфоцитов связана с супрессивным действием на них продуктов лейкозных клеток [Chiao J.W., Heil M., Arlin Z., Lutton J.D., Choi Y.S., Leung K.. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, Suppression of Lymphocyte Activation and Functions by a Leukemia Cell-Derived Inhibitor v.83, p.3432-3446]. Введение в организм известных медиаторов иммунной системы (интерферонов, интерлейкинов, колониестимулирующих факторов), являющихся естественными продуктами иммунокомпетентных клеток, оказывает в ряде случаев выраженный противоопухолевый эффект [Mule J.J., Rosenberg S.A.. Int. J. Cancer-1987, Immune response following intravesical metastases of a mouse carcinoma after in vitro treatment with murine interferon v.40, 830-834]. Используемые в онкологической практике полипептиды (цитокины), такие как интерферон, колониестимулирующие факторы, интерлейкин-2, имеют молекулярную массу 15-70 кДа, их получают, как правило, генно-инженерным способом. Введение в организм больного этих высокомолекулярных веществ в лечебных дозах вызывает тяжелые побочные эффекты. Поскольку терапевтическое, противоопухолевое действие большинства цитокинов основано на восполнении их сниженной в организме опухоленосителей активности, положительный эффект от их использования носит кратковременный, обратимый характер, и для его поддержания требуется многократное введение препарата, что повышает вероятность неблагоприятного, порой летального исхода. Необходимо также учесть, что время полужизни большинства цитокинов в организме составляет минуты, и для достижения лечебного эффекта требуется увеличение вводимых доз препарата, особенно, если необходим повторный курс лечения, что для большинства онкологических больных, как правило, имеет место. Гораздо предпочтительней использовать в качестве лечебных средств низкомолекулярные пептидные соединения, особенно эндогенной природы. Они эффективны в чрезвычайно малых дозах и производят регуляторное, корригирующее влияние на иммунологические сдвиги, не оказывая вредных для организма воздействий.
Наиболее близким аналогом данного изобретения является патент RU 2172322 С1 от 20.08.2001. В нем описываются иммуномодулирующие олигопептиды - аллофероны, индуцирующие синтез эндогенного интерферона. В приведенных примерах показана антивирусная активность аллоферонов и их свойство стимулировать цитотоксическую активность лимфоцитов человека и животных.
Задача изобретения - выявление низкомолекулярного иммуномодулирующего пептида с противоопухолевым действием и создание на его основе лекарственного средства. Поставленная задача достигается тем, что пентапептид формулы Val-Val-Tyr-Pro-Asp обладает способностью восстанавливать функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленную продуктами жизнедеятельности опухолевых клеток, и, как следствие этого, тормозит рост ряда мышиных перевиваемых опухолей. Созданное на основе пентапептида лекарственное средство, представляющее собой лиофильно высушенную смесь пентапептида в широком диапазоне доз с наполнителем или водный раствор пептида, также обладает этим свойством и противоопухолевой активностью.
Пентапептид был впервые обнаружен и выделен нами из супернатанта кратковременной культуры клеток костного мозга свиньи методом твердофазной экстракции и последующей очисткой методом офВЭЖХ. Проведенное впоследствии определение первичной структуры методом сиквенирования позволило определить аминокислотную последовательность Val-Val-Tyr-Pro-Asp. Поиск по банку данных пептидных и белковых аминокислотных последовательностей показал уникальность данной структуры и отсутствие подобных последовательностей среди известных белков и пептидов. Пентапептид получают как твердофазным методом на полимерном носителе, так и классическим пептидным синтезом в растворе. Пентапептид Val-Val-Tyr-Pro-Asp является иммуномодулирующим пептидом, стимулирующим противоопухолевую активность иммунной системы человека. Он отличается от ближайших аналогов аллоферонов (патент RU 2172322 C1 от 20.08.2001) как первичной структурой, так и механизмом действия. В отличие от аллоферонов, пентапептид Val-Val-Tyr-Pro-Asp стимулирует выработку эндогенного интерлейкина-2. Механизм противоопухолевого эффекта пентапептида Val-Val-Tyr-Pro-Asp основан на восстановлении функциональной активности Т-лимфоцитов, подавленной продуктами опухолевых клеток в организме опухоленосителя. Пентапептид не оказывает цитостатического действия на опухолевую клетку, а способствует восстановлению противоопухолевого иммунитета, подавленного опухолевыми клетками в организме опухоленосителя.
Нижеприведенные примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение
Пример 1.
Синтез пентапептида Val-Val-Tyr-Pro-Asp проводили твердофазным методом на автоматическом синтезаторе пептидов Biosearch 9600 (США) на РАМ-полимере. Синтез осуществлялся Fmoc/DIPCDI-методом. Защищенные аминокислоты присоединяли карбодиимидным методом, для подавления рацемизации добавляли эквимолярные количества 1-оксибензтриазола. При синтезе МП-5 на промежуточных стадиях синтеза альфа-аминогруппы защищали Fmoc-защитой, N-концевой валин присоединяли в виде Вос-производного, ОН-группу тирозина защищали третбутиловым эфиром, а -СООН группу аспарагиновой кислоты защищали с помощью ОВ u t-эфира. Fmoc-группу на промежуточных стадиях синтеза отщепляли смесью пиперидин-толуол-диметилформамид, после окончания синтеза пептид отщепляли от полимера (с одновременным удалением всех защитных групп) водной трифторуксусной кислотой. Полученный пептид выделяли и очищали методом оф ВЭЖХ на колонке Диасорб-130 С-16Т. Гомогенность пептида подтверждалась данным аналитической ВЭЖХ на колонке Ultrasphere ODS C18. Методом масс-спектрометрии и данными сиквенирования показана идентичность синтезированного пептида нативной структуре. Синтезированный пептид имел молекулярный ион [МН]+=591. Определение проводилось масс-спектрометрически на приборе Thermo Bioanalysis Vision 2000 (Англия) с УФ лазером при 337 нм и импульсе 33 нсек. В качестве матрицы использовалась 2,5 дигидробензойная кислота в соотношении вещество - матрица (1:1). На матрицу наносилось 100 рм пептида. Аминокислотную последовательность пептида определяли на газофазном секвенаторе (модель 477А фирмы Applied Biosystem, США), соединенном с автоматическим анализатором фенилтиогидантоинов аминокислот (модель 120А той же фирмы). На стеклянный фильтр реактора секвенатора наносили 25 мкл водного раствора, содержащего 3 мг полибрена, высушивали фильтр в токе аргона и проводили три цикла отщепления для очистки фильтра от фона аминокислот. Далее наносили раствор 100 пмоль пептида в 25% TFA (3×30 мкл), высушивая каждую аликвоту в токе аргона. Проводили 6 циклов анализа, используя стандартные программы отщепления, разделения и идентификации фенилтиогидантоинов аминокислот.
Пример 2.
Известно, что опухолевые клетки больных ОМЛ, а также клетки линии HL-60, ведущей происхождение от лейкозных клеток костного мозга этих больных, продуцируют белки, сопрессирующие функции Т-лимфоцитов, что выражается в резком снижении их способности отвечать пролиферацией на воздействие митогена (фитогемагглютинина, ФГА) [Chiao J.W., Heil M., Arlin Z., Lutton J.D., Choi Y.S., Leung K.. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, Suppression of Lymphocyte Activation and Functions by a Leukemia Cell-Derived Inhibitor v.83, p.3432-3446].
Свежевыделенные Т-лимфоциты из периферической крови здоровых доноров, полученные центрифугированием в градиенте плотности фиколла-урографина, культивировались по 150×10 3 кл/лунка в стандартной среде в течение 72 ч в присутствии ФГА (Difco, USA) в субоптимальной дозе 2.5 мкг/мл. Одновременно с ФГА в опытные лунки вносились кондиционная среда (КС) от лейкозных клеток HL-60 в различных объемах и пентапептид в широком диапазоне концентраций (1×10-1-1×10-7 г/мл). Для определения уровня пролиферации клеток в лунки вносился раствор [3Н]-тимидина (1 мкКи/мл) за 4 часа до окончания инкубации (37°С+CO2). Радиоактивность каждой пробы определяли на сцинтиляционном счетчике (LKB), а для количественной оценки реакции использовали абсолютную величину включения метки (число импульсов в минуту). Введение в инкубационную смесь 5% КС приводило к снижению уровня пролиферации до 38% по сравнению с контролем (100%, инкубация без КС HL-60 (таблица 1)). Как показано в работе [Chiao J.W., Heil M., Arlin Z., Lutton J.D., Choi Y.S., Leung К.. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, Suppression of Lymphocyte Activation and Functions by a Leukemia Cell-Derived Inhibitor v.83, p.3432-3446] такая супрессия Т-лимфоцитов человека, вызванная действием на них продуктов лейкозных клеток, сопровождается резким спадом продукции Т-лимфоцитами интерлекина-2 и других лимфокинов.
В Таблице 1 представлены результаты по оценке влияния пентапептида на восстановление пролиферативного ответа Т-лимфоцитов, полученных в одном из экспериментов. Установлено, что пентапептид в широком диапазоне концентраций способен восстанавливать пролиферативный ответ на 60-99%.
Таблица 1. | |||
Имп/мин | Уровень пролиферации (%) | ||
Контроль | 800 | 5 | |
ФГА | 15355 | 100 | |
КС HL-60 (5%) | 5797 | 38 | |
пентапептид (мкг/мл) | 100 | 15198 | 99 |
10 | 8131 | 53 | |
1 | 13459 | 88 | |
10-1 | 6632 | 43 | |
10 -2 | 9200 | 60 | |
10-3 | 9280 | 60 | |
10 -4 | 9293 | 61 |
Пример 3.
Штамм рака шейки матки (РШМ-5) был пассирован на соответствующих линейных мышах для поддержания in vivo. Последующую перевивку опухоли и методику постановки экспериментов осуществляли в соответствии с требованиями, предъявляемыми к изучению новых фармакологических веществ в РФ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ", МЗ РФ, Департамент контроля качества, эффективности и безопасности лекарственных средств, М., 2000 г., стр.319-325]. Эксперименты проводились на мышах-самкам линии СВА. После перевивки опухоли мышей делили на группы, в каждой группе не менее 10 мышей. Одну группу оставляли без специфического лечения и считали контрольной. Экспериментальным группам животных вводили пентапептид в разовых дозах 1 мг/кг, 500 и 250 мкг/кг подкожно ежедневно в течение 5 дней, начиная со срока 72 часа после перевивки опухоли. Измерения объемов опухолей проводили на 4, 9 и 13 сутки после окончания введения пентапептида. Контрольная группа мышей получала подкожные инъекции физиологического раствора хлористого натрия. За мышами наблюдали в течение 15 дней после окончания лечения, после чего мышей забивали эфирным наркозом. Противоопухолевый эффект пентапептида оценивали по стандартному показателю: торможению роста опухоли (ТРО, %), которое рассчитывается как разница средних объемов опухолей в леченой и контрольной группах по отношению к объему опухолей в контрольной группе и выражается в процентах. Статистическую обработку полученных данных проводили по методу Стьюдента в модификации Р.Б.Стрелкова. В таблице 2 представлены результаты экспериментов, показывающие значимый и достоверный противоопухолевый эффект пентапептида. В ходе эксперимента ни в одном случае введения пентапептида не было отмечено гибели мышей от токсичности пептида, а также изменения поведенческих реакций, внешнего вида мышей и их внутренних органов.
Таблица 2. | ||||||
Группы | Средние объемы опухолей, мм3 (Vcp÷d) на сутки после перевивки опухолей | (%) ТРО на сутки после окончания курса введения препарата | ||||
10 | 15 | 19 | 4 | 9 | 13 | |
250 мкг/кг | 138 [110÷166] | 267 [241÷293] | 885 [780÷990] | 58* | 77* | 65* |
500 мкг/кг | 63 [52÷74] | 197 [160÷234] | 455 [315÷595] | 81* | 83* | 82* |
1 мг/кг | 32 [13÷51] | 85 [34÷136] | 331 [84÷578] | 90* | 93* | 87* |
Контроль | 329 [238÷420] | 1160 [823÷1497] | 2528 [1841÷3215] | - | - | - |
Примечание: * р 0,05 |
Пример 4.
Штамм опухоли меланома В-16 перевивали и поддерживали на мышах C57 BL/6j. Эксперименты проводили на мышах-гибридах лини [DBA2xC57BL/6j] с массой тела 18-20 г, которым прививали измельченную опухолевую ткань по 50 мг на мышь. Пентапептид вводился подкожно через 48 часов после перевивки опухоли в разовой дозе 500 мкг/кг ежедневно в течение 5-ти дней. После перевивки опухоли мыши были разделены на группы по 10 особей, контрольная группа мышей получала подкожные инъекции физиологического раствора. Противоопухолевый эффект пентапептида оценивали по стандартному показателю: торможению роста опухоли (ТРО, %). Результаты опытов приведены в таблице 3.
Показано, что введение пентапептида приводит к достоверному противоопухолевому эффекту в 74% торможения роста опухоли на 7-й день после окончания курса лечения, и этот эффект сохраняется в течение двух недель после окончания курса лечения. Как и в примере 2, пептид нетоксичен при использованных дозах введения.
Таблица 3. | ||||||
Тип опухоли | Дни после перевивки опухоли | |||||
7 | 14 | 21 | ||||
Объем опухоли, мм3 | ТРО, % | Объем опухоли, мм 3 | ТРО, % | Объем опухоли, мм3 | ТРО, % | |
Контроль, Vk | 985 [638-1332] | 3563 [1456-8670] | 8317 [4118-12435] | |||
Меланома В-16, Vo | 261 [175-347] | 74* | 1221 [597-1825] | 66* | 3429 [2205-4641] | 59 |
Примечание: отличие от контроля достоверно,* - р<0,05 |
Пример 5.
На основе пентапептида была разработана и приготовлена лекарственная форма препарата, которая представляет собой лиофильно высушенную смесь (1:1) глицина и пентапептида Val-Val-Tyr-Pro-Asp (по 1 мг). Препарат имел вид белого или желтоватого аморфного порошка или пористой массы и был расфасован во флаконы из нейтрального стекла, укупоренные резиновыми пробками и обкатанные алюминиевыми колпачками.
В экспериментах использовались мыши линии СВА с подкожно перевитым РШМ-5. После перевивки опухоли мышей делили на группы, в каждой группе не менее 10 мышей. Контрольной группе вводили пентапептид Val-Val-Tyr-Pro-Asp в разовой дозе 1 мг/кг. Экспериментальным группам животных вводили лекарственную форму препарата в разовой дозе 1 мг/кг подкожно ежедневно в течение 5 дней, начиная со срока 72 часа после перевивки опухоли. Противоопухолевый эффект пентапептида оценивали по стандартному показателю: торможению роста опухоли (ТРО, %). В таблице 3 приведены результаты экспериментов. Показано, что и пентапептид, и "сухая" лекарственная форма пентапептида оказались практически равноэффективными по противоопухолевой активности и вызывали достоверное торможение РШМ-5.
Пример 6.
На основе пентапептида была разработана и приготовлена жидкая лекарственная форма препарата, которая является прозрачным водным (специальная деминерализованная и апирогенная вода) раствором пентапептида Val-Val-Tyr-Pro-Asp, разлитым в стерильные флаконы из нейтрального стекла, укупоренные резиновыми пробками и обкатанные алюминиевыми колпачками.
В экспериментах использовались мыши линии СВА с подкожно перевитым РШМ-5. После перевивки опухоли мышей делили на группы, в каждой группе не менее 10 мышей. Контрольной группе вводили пентапептид Val-Val-Tyr-Pro-Asp в разовой дозе 1 мг/кг. Экспериментальным группам животных вводили жидкую лекарственную форма препарата в разовой дозе 1 мг/кг подкожно ежедневно в течение 5 дней, начиная со срока 72 часа после перевивки опухоли. Противоопухолевый эффект МП-5 оценивали по стандартному показателю: торможению роста опухоли (ТРО, %). В таблице 4 приведены результаты экспериментов. Результаты экспериментов подтверждают то, что жидкая лекарственная форма препарата вызывает достоверное и значимое ТРО в той же степени, что и пентапептид.
Таблица 4 | |
Группы | Торможение роста опухолей (%) на 10 сутки после окончания лечения |
пептид Val-Val-Tyr-Pro-Asp | 83* |
жидкая л.ф препарата | 85* |
сухая л.ф препарата | 86* |
Примечание: отличие от контроля достоверно,* - р<0,05 |
Таким образом, приведенные примеры доказывают, что открытый и синтезированный нами пентапептид Val-Val-Tyr-Pro-Asp обладает иммуномодулирующими свойствами, восстанавливая подавленную опухолевыми клетками функциональную активность Т-лимфоцитов, и, как следствие, обладает противоопухолевой активностью, подавляя рост различных опухолей (РШМ-5 и меланома В-16 и др.). Созданные на основе пентапептида различные виды лекарственной формы препарата оказались практически равноэффективными по противоопухолевой активности и вызывали достоверное торможение опухоли.
Класс A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот
Класс C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот
Класс A61P37/02 иммуномодуляторы
Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства