способ определения концентрации гепарина

Формула изобретения

Способ определения концентрации гепарина, основанный на определении скорости гидролиза хромогенного субстрата тромбином, отличающийся тем, что применяют тромбин с активностью 0,5-0,6 Ед/мл, и в качестве хромогенного субстрата используют субстрат z-Ala-Ala-Arg-pNA.НВr.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к исследованию крови, и может быть использовано для контроля лечения гепарином.

Известно, что гепарин применяют для лечения большого числа заболеваний. Тромбозы и тромбоэмболии, ДВС-синдром, гломерулонефрит, ишемическая болезнь сердца - это далеко неполный перечень заболеваний, при которых следует применять этот лекарственный препарат. Однако бесконтрольное применение этого препарата снижает эффективность его применения, вызывает опасные для жизни осложнения.

Известен способ контроля концентрации гепарина путем определения активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ). Считается, что терапевтическая концентрация (0,3 Ед/мл) гепарина вызывает удлинение АПТВ в 2-3 раза от исходного значения. Однако при ряде патологических состояний, требующих применения высоких доз гепарина, этот метод непригоден, например, при операциях на сердце с использованием аппарата искусственного кровообращения, когда применяют очень высокие концентрации этого препарата. Кроме того, коммерческие препараты АПТВ-реагента имеют разную чувствительность к гепарину, так как состав их разный (применяют каолин, эллаговую кислоту, оксиды кремния, растительные фосфолипиды, кефалины и др.) [Thompson J.M. The control of heparin therapy by the activated partial thromboplastin time: Results of collaborative studies. Scandinavian Journal of Haematology. - 1980. 25 (supl, 27). - P.73-83].

Наиболее близким по достигаемому положительному результату (прототип) является способ определения концентрации гепарина по скорости гидролиза хромогенного субстрата тромбином [Нарушение реакций образования тромбина. Под редакцией Р.У.Колмена, пер. с англ. – М. - Медицина. - 1988. - С.198-199]. В способе-прототипе применяют импортный хромогенный субстрат S2238, что ограничивает его применение. К недостаткам указанного способа следует отнести его невысокую чувствительность (чувствительность не более 0,1 Ед/мл). Кроме того, способ-прототип имеет дополнительный этап приготовления тромбина (подготовка маточного раствора тромбина до концентрации 100 Ед/мл, замораживание и размораживание аликвот, разведение аликвот до активности 8 Ед/мл).

Заявляемый способ, основанный на применении отечественного хромогенного субстрата, лишен указанных недостатков: нет дополнительного этапа разведения маточного тромбина и замораживания аликвот, что уменьшает затраты времени; чувствительность заявляемого способа выше, за счет применения низкой активности тромбина.

Положительным результатом заявляемого способа является расширение арсенала отечественных реагентов для определения концентрации гепарина, упрощение процедуры приготовления реагентов и повышение чувствительности способа.

Положительный результат достигается тем, что для определения концентрации гепарина применяют тромбин с активностью 0,5-0,6 Ед/мл и в качестве хромогенного субстрата используют субстрат z-Ala-Ala-Arg-pNA.HBr.

Способ осуществляют следующим образом.

Реактивы и оборудование:

1. 3,8% (0,1М) раствор цитрата натрия. Получают растворением 3,8 г тринатрия-цитрата в 100 мл дистиллированной воды.

2. Трис-HCl Буфер, рН 7,4 (производитель "Технология-Стандарт", Россия).

3. Хромогенный субстрат (z-Ala-Ala-Arg-pNA.HBr) 9 мг во флаконе, (производитель "Технология-Стандарт", реагент из диагностического набора реагентов Хромо-Тех-Антитромбин), Россия. Для приготовления рабочего раствора субстрата во флакон добавить 6,0 мл дистиллированной воды, перемешать до полного растворения.

4. Тромбин, 5 ЕД, производитель "Технология-Стандарт", Россия. Для приготовления рабочего раствора тромбина развести флакон в 10 мл дистиллированной воды.

5. Уксусная кислота, 30%-ный раствор в дистиллированной воде.

6. Референтная нормальная плазма (РНП), лиофильно высушенная, производитель "Технология-Стандарт", Россия.

7. Гепарин, 25000 ЕД во флаконе, производитель "Berlin-Chemi", Германия.

8. Центрифуга ОПН-8, (Россия).

9. Пробирки полистероловые на 15 мл, градуированные для забора крови, производитель Sardstedt, Швейцария.

10. Фотометр RA-50, производитель Вауег, Германия (или аналогичный с длиной волны 405 Нм, и длиной оптического пути кюветы 10 мм).

- Ранее был представлен способ определения концентрации антитромбина III, основанный на применении хромогенного субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNA.HBr [Воюшина Т.Л., Макаров В.А., Неведрова О.Е., Дрозд Н.Н., Момот А.П. Способ определения активности антитромбина III. Решение о выдаче патента №2000130498, приоритет от 06.12.2000]. Однако представленный способ предназначен исключительно для определения уровня антитромбина III, но не предназначен для определения концентрации гепарина.

Подготовка образцов бедной тромбоцитами плазмы (БТП)

Подготовка исследуемой БТП: Кровь получают из локтевой вены силиконированной иглой в пробирку, содержащую 3,8%-ный раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). Кровь центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин (200 г). Полученную богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют в течение 20 мин при 3500 об/мин (1200 г). Полученную БТП используют для проведения исследования.

Подготовка исследуемого образца БТП

Перед проведением анализа к 0,1 мл исследуемой БТП добавляют 3 мл буфера Трис-HCl.

Подготовка РНП

Для подготовки РНП во флакон внести 1,0 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре (+18...+25°С) и легком покачивании в течение 3 мин.

Подготовка рабочего образца РНП

Для приготовления рабочего образца РНП к 0,1 мл РНП добавить 3 мл Трис-НСl буфера Трис-HCl.

Подготовка калибровочных образцов

Для приготовления стандартного раствора гепарина к 0,1 мл гепарина добавить 9,9 мл дистиллированной воды (концентрация гепарина в стандартном растворе 50 Ед/мл).

1. Приготовление калибровочного образца №1 (5 Ед/мл). К 0,90 мл РНП добавить 0,1 мл стандартного раствора гепарина.

2. Приготовление калибровочного образца №2 (2,5 Ед/мл). К 0,90 мл РНП добавить 0,05 мл стандартного раствора гепарина и 0,05 мл дистиллированной воды.

3. Приготовление калибровочного образца №3 (1,0 Ед/мл). К 0,90 мл РНП добавить 0,02 мл стандартного раствора гепарина и 0,08 мл дистиллированной воды.

4. Приготовление калибровочного образца №4 (0,5 Ед/мл). К 0,90 мл РНП добавить 0,01 мл стандартного раствора гепарина и 0,09 мл дистиллированной воды.

5. Приготовление калибровочного образца №5 (0,05 Ед/мл). К 0,90 мл РНП добавить 0,1 мл раствора гепарина с концентрацией 0,5 Ед/мл.

6. Приготовление калибровочного образца №6 (0,0 Ед/мл). К 0,90 мл РНП добавить 0,1 мл дистиллированной воды.

Во все калибровочные образцы (№№1-6) добавить 3 мл буфера Трис-HCl.

Ход определения

Исследование концентрации гепарина выполняют в следующей последовательности (см. ход определения).

В пробирку внести 0,1 мл исследуемого образца БТП (или 0,1 мл калибровочного образца при построении калибровочной кривой), 0,3 мл рабочего образца РНП, смесь тщательно перемешать. Затем добавить в смесь 0,4 мл рабочего раствора тромбина. Смесь инкубировать при температуре +37°С 3 мин. После инкубации добавить 0,4 мл хромогенного субстрата. Через 120 секунд (точно!) внести 1,0 мл 30%-ный раствор уксусной кислоты, тщательно перемешать. Через 5-10 мин после внесения раствора уксусной кислоты определить оптическую плотность (при длине волны 405 нм) исследуемого образца плазмы против физиологического раствора хлорида натрия.

Построение калибровочной кривой

Для построения калибровочной кривой на линейном калибровочном графике на оси ординат откладывают значения оптической плотности, а по оси абсцисс откладывают значения концентрации гепарина. По точкам, которые были получены при исследовании калибровочных образцов, строят зависимость оптической плотности от концентрации гепарина.

Используя данные, полученные при определении оптической плотности исследуемого образца БТП, находят концентрацию гепарина по калибровочной кривой.

Воспроизводимость способа

Для оценки воспроизводимости способа использовали расчет коэффициента вариации (%). Как и все методы с использованием хромогенных субстратов, этот метод показал очень высокую воспроизводимость. Коэффициент вариации этого теста при исследовании в разные дни не превышает 3%.

Чувствительность способа

Для оценки чувствительности способа использовали 10 образцов плазмы с известным уровнем гепарина. Для этой цели добавляли в нормальную БТП 10 здоровых людей гепарин с аттестованным значением до концентрации 0,05 Ед/мл. Во всех 10 образцах БТП с гепарином определяли уровень гепарина предлагаемым способом и способом-прототипом. Уровень гепарина, определенный способом-прототипом, был равен в среднем 0,10±0,01 Ед/мл (коэффициент вариации равен 7%). Уровень гепарина, определенный заявляемым способом, был равен в среднем 0,051±0,002 Ед/мл (коэффициент вариации равен 3%), и не отличался от аттестованной концентрации гепарина (0,05 Ед/мл) в образцах БТП (см. чертеж). Так показано, что чувствительность и воспроизводимость заявляемого способа выше, чем способа прототипа. Более высокая чувствительность к гепарину в тесте достигается за счет применения низких концентраций тромбина в заявляемой тест-системе.

Клинические примеры

1. Больная Л.С., возраст 23 года, обратилась в Алтайский гематологический центр с жалобами на невынашивание беременности. Первый выкидыш был в сроке беременности 20 недель, второй был в сроке 32 недели. В 2001 году был выявлен ложно положительный анализ на RW. При физикальном обследовании органов дыхания отклонений не обнаружено. Границы относительной тупости сердца не изменены. Тоны сердца ясные, ритм правильный, ЧСС 78 в минуту. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не увеличены.

Данные лабораторных методов обследования:

Нb - 125 г/л; РОЭ 17 мм/ч; Лейкоциты - 5,4×10⁹/л; Лейкоцитарная формула: Б - 1% Э - 2% П - 1% С - 56% Л - 32% М - 8%; Биохимический анализ крови: Креатинин 73 мкмоль/л; мочевина 4,8 ммоль/л; общий билирубин 15 мкмоль/л, прямой 6 мкмоль/л, непрямой 9 мкмоль/л; глюкоза 4,1 ммоль/л; СРБ +; общий белок - 78,9 г/л, альбумины - 50%, 1 - 5,0%, 2 - 11,0%, - 15,0%, - 19,0%. Исследование системы гемостаза до и на фоне лечения гепарином представлено в таблице 1.

На основании клинических и лабораторных данных сформулирован диагноз

Первичный антифосфолипидный синдром, невынашивание беременности.

Назначено лечение: гепарин 5000 Ед 5 раз в сутки, курс дискретного плазма-фереза, дезагреганты. На фоне лечения у больной появилось маточное кровотечение, поэтому временно (на 2 суток) была прекращена гепаринотерапия для устранения кровотечения. Исследование системы гемостаза до и после применения гепарина (в дозе 5000 Ед 5 раз в сутки) представлено в таблице 2. Как следует из представленной таблицы, у больной с АФС традиционный способ контроля гепаринотерапии, заключающийся в достижении 2-3-х кратного удлинения АПТВ-теста, не позволяет контролировать концентрацию гепарина в крови, так как у больной с АФС была исходная гипокоагуляция в АПТВ-тесте, обусловленная волчаночным антикоагулянтом в крови больной. Поэтому бесконтрольное применение гепарина вызвало у этой больной одно из наиболее частых осложнений гепаринотерапии - кровотечение. Используя предложенный метод, была определена точная концентрация гепарина в крови. Оказалось, что причиной кровотечения была более чем двукратная передозировка гепарина, хотя АПТВ был удлинен менее, чем в 2 раза. Поэтому после выявления высокого уровня гепарина заявляемым способом лечение гепарином продолжено со снижением дозы вдвое до 2500 Ед 5 раз в сутки, что позволило продолжить лечение основного заболевания без геморрагических осложнений. Результаты определения уровня гепарина и показатели системы гемостаза после остановки маточного кровотечения и коррекции дозы гепарина представлены в таблице 2.

Как следует из представленной таблицы, после уточнения концентрации гепарина в крови заявляемым способом была достигнута концентрация гепарина, необходимая для лечения основного заболевания, которая не вызвала геморрагических осложнений в дальнейшем. Определение концентрации гепарина было выполнено заявляемым способом и способом-прототипом. Различий в показаниях заявляемого способа и способа-прототипа не обнаружено.

2. Больной К.Н. (возраст 42 года) 5.05.2000 обратился в Алтайскую краевую клиническую больницу (АККБ) с жалобами на отечность голени и бедра слева, боли в левой нижней конечности в покое, усиливающиеся при незначительной физической нагрузке. Болен в течение недели с 28.04.2000. Лечился самостоятельно гепариновой мазью и анальгином. Положительного эффекта от такого лечения не отмечает. Вызвал бригаду скорой медицинской помощи, которая доставила больного в АККБ с диагнозом острый илеофеморальный тромбоз слева. У отца были тромбозы с 30-летнего возраста, отец умер от ТЭЛА в возрасте 49 лет. При физикальном обследовании органов дыхания отклонений не обнаружено. Границы относительной тупости сердца не изменены. Тоны сердца ясные, ритм правильный, ЧСС 86 в минуту. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Левая голень и левое бедро отечны, изменения цвета кожных покровов не обнаружено, поверхностные вены слева варикозно расширены. Пальпация икроножных мышц слева болезненна.

Данные лабораторных методов обследования:

Нb - 140 г/л; РОЭ 22 мм/ч; Лейкоциты - 9,9×10⁹/л; Лейкоцитарная формула: Б - 1% Э - 2% П - 1% С - 59% Л - 32% М - 5%; Биохимический анализ крови: Креатинин 77 мкмоль/л; мочевина 5,3 ммоль/л; общий билирубин 15 мкмоль/л, прямой 10 мкмоль/л, непрямой 5 мкмоль/л; глюкоза 4,5 ммоль/л; СРБ отр; общий белок - 68,4 г/л, альбумины - 56%, 1 - 3,0%, 2 - 10,0%, - 12,0%, - 19,0%. Исследование системы гемостаза представлено в таблице 3.

На основании клинических, лабораторных данных и анализа системы гемостаза сформулирован диагноз:

Гематогенная тромбофилия. Резистентнось фактора Va к активированному протеину С, острый илеофеморальный тромбоз слева.

Назначено лечение: гепарин 5000 Ед 4 раза в сутки, детралекс, трентал и др. Исследование системы гемостаза до и на фоне применения гепарина представлено в таблице 3. Как следует из представленной таблицы, у больного традиционный способ контроля гепаринотерапии, заключающийся в достижении двукратного удлинения АПТВ-теста, не позволяет определить терапевтическую концентрацию гепарина в крови. Невозможно сделать вывод о достаточном уровне гепарина в крови, поскольку разные реагенты для определения АПТВ показывают разные результаты. Однако, используя предложенный способ, была точно определена концентрация гепарина в крови больного, что позволило продолжить полноценное лечение больного с тромботическими нарушениями антикоагулянтами. Определение концентрации гепарина было выполнено заявляемым способом и способом-прототипом. Различий в показаниях заявляемого способа и способа-прототипа не обнаружено.

Таблица 1 Исследование системы гемостаза у больной Л.С., 23 лет при лечении гепарином в дозе 5000 Ед 5 раз в сутки
Методы исследования	До лечения	На фоне лечения гепарином	Контроль
АПТВ, с	50	91	35 (N30-40)
Время с разведенным, тромбопластином, с	62	77	44 (N33-52)
Тест смешивания с плазмой донора (1:1)	нет коррекции	нет коррекции	-
Протромбиновое, с	20	20	14 (N14-17)
Лебетоксовое время, с	53	66	36 (N19-38)
Эхитоксовое время, с	35	33	34 (N19-41)
Тромбиновое время, с	15	>100	15 (N13-17}
Антитромбин III, %	110	99	78-122
Протеин С, %	107	110	70-130
Фибриноген, г/л	5,5	3.5	2-4
РФМК, мг%	18	8	до 3.5
Тромбоциты, ×10 9/л	299	303	170-380
ХII - фибринолиз, мин	34	46	до 10
Концентрация гепарина, способом-прототипом, Ед/мл	0	1,10	0,2-0,4
Концентрация гепарина, заявляемым способом, Ед/мл	0	1,11	0,2-0,4

Таблица 2 Исследование системы гемостаза у больной Л.С., 23лет при лечении гепарином в дозе 2500 Ед 5 раза в сутки
Методы исследования	До лечения	На фоне лечения гепарином	Контроль
АПТВ, с	50	69	34 (N30-40)
Время с разв. Тромбопл, с	62	69	43 (N33-52)
Тест смешивания с плазмой донора (1:1)	нет коррекции	нет коррекции	-
Протромбиновое, с	20	20	14 (N14-17)
Лебетоксовое время, с	53	56	37 (N19-38)
Эхитоксовое время, с	35	35	34 (N19-41)
Тромбиновое время, с	15	>100	15 (N13-17)
Антитромбин III, %	110	94	78-122
Протеин С, %	107	90	70-130
Фибриноген, г/л	5,5	3.6	2-4
РФМК, мг%	18	7	до 3.5
Тромбоциты, ×10 9/л	299	366	170-380
ХП - фибринолиз, мин	34	39	до 10
Концентрация гепарина способом-прототипом, Ед/мл	0	0,30	0,2-0,4
Концентрация гепарина заявляемым способом, Ед/мл	0	0,31	0,2-0,4

Таблица 3 Исследование системы гемостаза у больного К.Н., при лечении гепарином в дозе 5000 Ед 4 раза в сутки
Методы исследования	До лечения	На фоне лечения гепарином	Контроль
АПТВ, с (тест выполнен с реагентом Диацелин, производитель DiamedAG, Швейцария)	29	36	28 (N25-35)
АПТВ, с (тест выполнен с реагентом Actimat, производитель “BioMerieux”, Франция)	30	108	31 (N27-39)
АПТВ, с (тест выполнен с реагентом АПТВ-Эл-тест, производитель 000 “Технология-Стендарт”, Россия)	33	60	30 (N30-40)
Протромбиновое, с	14	14	14 (N14-17)
Лебетоксовое время, с	33	36	35 (N19-38)
Эхитоксовое время, с	33	32	36 (N19-41)
Тромбиновое время, с	15	>100	15 (N13-17)
Антитромбин III, %	100	96	78-122
Резистентность фактора V к АПС	0,64	-	0,80-1,20
Протеин С, %	102	107	70-130
Фибриноген, г/л	4,3	3,2	2-4
РФМК, мг%	15	7	до 3.5
Тромбоциты, ×109/л	250	200	170-380
ХП - фибринолиз, мин	35	20	до 10
Концентрация гепарина способом-прототипом, Ед/мл	0	0,33	0,2-0,4
Концентрация гепарина заявляемым способом, Ед/мл	0	0,32	0,2-0,4