способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов

Формула изобретения

Способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов, отличающийся тем, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на плотной питательной среде, из выросшей культуры готовят опытную пробу микробной взвеси, параллельно готовят контрольную пробу, представляющую жидкую питательную среду, далее каждую из проб смешивают с раствором лактоферрина и инкубируют, затем отделяют супернатант от микробных клеток центрифугированием, затем определяют остаточную концентрацию лактоферрина в опытной и контрольной пробах иммуноферментным анализом и определяют антилактоферриновую активность исследуемых микроорганизмов по формуле

АЛфА=Ск-Со,

где АЛфА - антилактоферриновая активность, нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;

Ск - концентрация лактоферрина в контроле, нг/мл;

Со - концентрация лактоферрина в опыте, нг/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораториях научно-исследовательских институтов, а также в бактериологических лабораториях клинических учреждений, занимающихся вопросами определения персистентных характеристик микроорганизмов для установления их этиологической значимости при патологических процессах.

В настоящее время характер течения большинства инфекций изменился в сторону увеличения доли затяжных и хронических форм [1]. Длительное переживание бактерий в организме хозяина (бактерионосительство), а также переход инфекционного процесса в хроническую форму обеспечивают механизмы персистенции микроорганизмов, заключающиеся в инактивации/деградации факторов естественной противоинфекционной резистентности: лизоцима, комплемента, интерферона, тромбоцитарного катионного белка, лактоферрина [2].

Установлено, что природный гликопротеин лактоферрин является одним из важнейших компонентов биохимической защиты человека и животных: обладает бактериостатическим и бактерицидным действием, принимает участие в процессах местной защиты большинства барьерных эпителиев респираторного, мочеполового, пищеварительного трактов, в регуляции гуморальных и клеточных иммунологических реакций, гемопоэза, влияет на систему комплемента, регулирует гранулоцитопоэз [3].

Известен способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов (АЛфА), заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде, выросшие культуры обрабатывают хлороформом, отделяют супернатант и смешивают его с лактоферрином, параллельно с опытной готовят две контрольные пробы, при этом в контроль 1 вместо супернатанта исследуемых культур микроорганизмов добавляют жидкую питательную среду, а контроль 2 готовят из забуференного физиологического раствора и жидкой питательной среды, опытную и контрольные пробы инкубируют, после инкубации добавляют тест-культуру Micrococcus luteus ГИСК №211001 и проводят первое измерение оптической плотности в опыте и контролях непосредственно по достижении режима термостатирования (37°С) и второе измерение через 18-24 часа инкубации, затем рассчитывают АЛфА по изменению оптических плотностей в опыте и контролях [4].

Однако указанный способ имеет ряд существенных недостатков. Известный способ является качественным и не позволяет выразить уровень антилактоферриновой активности в абсолютных величинах, что является важным в эколого-эпидемиологических исследованиях, поскольку по уровню количественных значений секретируемых факторов персистенции микроорганизмов, направленных на инактивацию факторов естественной резистентности, штаммы микроорганизмов, выделенные из разных источников (внешняя среда, больные, бактерионосители, здоровые люди и. т.д.), существенно отличаются [2]. Определение количественных значений АЛфА различных микроорганизмов позволит установить этиологическую значимость их при патологических процессах, изучить роль АЛфА в механизмах персистенции и формировании бактерионосительства.

Кроме того, инкубация супернатантов, а не живых культур микроорганизмов с лактоферрином значительно снижает частоту выявления АЛфА бактерий, поскольку в первом случае могут быть обнаружены только конститутивные ингибиторы лактоферрина. Вместе с тем, для экспрессии многих белков бактерий требуется культивирование живых микроорганизмов в среде, содержащей субстрат или индуктор, что невозможно при инкубировании лактоферрина с супернатантами микроорганизимов.

Другим существенным недостатком данного способа является то, что использование живой индикаторной культуры М.luteus не позволяет определить антилактоферриновую активность у штаммов микроорганизмов, продуцирующих лизоцим [5], гистоноподобные белки [6], перекись водорода, другие антагонистически активные вещества, что характерно для таких микроорганизмов как бифидобактерии, лактобациллы, стрептококки, синегнойная палочка и др., поскольку эти биологически активные вещества могут оказывать антимикробное действие на микрококк (бактериолитическое, бактерицидное и др.). Вместе с тем, супернатанты исследуемых микроорганизмов могут стимулировать рост индикаторной культуры, что приводит к ложноположительным результатам [7]. Обработка культур микроорганизмов хлороформом приводит к высвобождению некоторых бактериальных пигментов, что искажает результаты определения антилактоферриновой активности [8].

Задачей заявляемого способа определения антилактоферриновой активности микроорганизмов является повышение чувствительности способа и точности количественной оценки АЛфА.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе определения АЛфА исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на плотной питательной среде, из выросшей агаровой культуры готовят микробную взвесь, смешивают ее с лактоферрином, параллельно готовят контроль, при этом в контроль вместо микробной взвеси добавляют жидкую питательную среду, опытную пробу и контроль инкубируют, отделяют супернатант от бактериальных клеток центрифугированием, определяют концентрацию лактоферрина в опытной и контрольной пробах иммуноферментным анализом и затем рассчитывают АЛфА по формуле

АЛфА=Ск-Со,

где АЛфА - антилактоферриновая активность, нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;

Ск - концентрация лактоферрина в контроле, нг/мл;

Со - концентрация лактоферрина в опыте, нг/мл.

Новыми признаками заявляемого способа являются:

- исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на плотной питательной среде, из выросшей агаровой культуры готовят микробную взвесь;

- инкубируют микробную взвесь, приготовленную из агаровой культуры, с лактоферрином; параллельно с опытной пробой инкубируют контрольную пробу, приготовленную из жидкой питательной среды и лактоферрина;

- остаточную концентрацию лактоферрина в опытной и контрольной пробах определяют иммуноферментным анализом;

- рассчитывают антилактоферриновую активность по формуле

АЛфА=Ск-Со,

где АЛфА - антилактоферриновая активность, нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;

Ск - концентрация лактоферрина в контроле, нг/мл;

Со - концентрация лактоферрина в опыте, нг/мл.

Новая совокупность признаков позволяет при осуществлении заявляемого изобретения получить новый технический результат, который состоит в том, что предлагаемый способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов позволяет за счет увеличения его чувствительности и повышения точности количественной оценки АЛфА микроорганизмов определять количественные значения данного признака у более широкого спектра микроорганизмов. Также способ позволяет по различию в уровне количественных значений АЛфА микроорганизмов осуществлять диагностику и прогнозирование заболеваний микробной этиологии, проводить эколого-эпидемиологические исследования, оценивать эффективность влияния лекарственных препаратов на данный признак.

Известно использование реагентов для количественного иммуноферментного определения лактоферрина в сыворотке крови [9].

Использование реагентов для иммуноферментного определения лактоферрина с целью выявления АЛфА микроорганизмов в источниках патентной и научно-технической литературы не обнаружено.

Авторами экспериментально установлено, что при инкубировании лактоферрина с живыми культурами микроорганизмов определение АЛфА более достоверно по сравнению с тем, если инкубацию лактоферрина достоверно по сравнению с тем, если инкубацию лактоферрина проводить с их супернатантами.

Проводились следующие эксперименты.

В опытной серии первую партию культур микроорганизмов Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Salmonella enteritidis выращивали на мясопептонном агаре при температуре 37°С в течение 24 ч, готовили их взвесь в мясопептонном бульоне (10 ⁹ КОЕ/мл). Далее первую партию взвесей в равных объемах смешивали с лактоферрином в концентрации 100 нг/мл. Вторую партию этих же культур одновременно с первой выращивали в мясопептонном бульоне в течение 24 ч при температуре 37°С, далее супернатант отделяли от бактериальных клеток центрифугированием в течение 20 мин (8000 об/мин) и смешивали с лактоферрином в концентрации 100 мг/мл. Параллельно и для первой и для второй партий культур микроорганизмов готовили контрольные пробы из питательного бульона и лактоферрина в той же концентрации, что использовали в опытных пробах. Опытные и контрольные пробы обеих партий исследуемых культур микроорганизмов инкубировали в течение суток при температуре 37°С и центрифугировали в течение 20 мин (8000 об/мин), получали бесклеточные супернатанты, в которых иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием реагентов для количественного определения лактоферрина (ЗАО “Вектор-Бест”) с измерением оптической плотности (ОП₄₉₂) фотометром Multiskan Labsystems (Финляндия) и последующим перерасчетом по калибровочному графику определяли концентрацию лактоферрина в опытных и контрольных пробах. По разнице концентраций лактоферрина в опыте и контроле определяли инактивацию лактоферрина и судили об антилактоферриновой активности микроорганизмов.

Определили, что инкубированная с лактоферрином живая культура Е.coli инактивировала 4,18±0,77 нг/мл лактоферрина, а при инкубации с лактоферрином супернатанта культуры Е.coli лактоферрин не инактивировался. Соответственно живая культура S.enteritidis инактивировала 7,92±1,06 нг/мл лактоферрина, а ее супернатант - 3,06±0,11 нг/мл лактоферрина. Живая культура S.epidermidis инактивировала 2,40±0,09 нг/мл лактоферрина, а ее супернатант не инактивировал лактоферрин.

Это подтверждает то, что определение способности микроорганизмов к инактивации лактоферрина при инкубации лактоферрина с супернатантами микроорганизмов менее достоверно по сравнению с тем, если инкубацию лактоферрина проводить с живыми культурами микроорганизмов.

Существуют различные методы определения лактоферрина в сыворотке крови человека, из которых наиболее часто используются ИФА [9] и иммунодиффузионные методы, в частности метод радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини [10] с использованием, например, моноспецифической антисыворотки к лактоферрину, выпускаемой 000 “Микрофлора” при МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского (г.Москва). Однако по чувствительности метод РИД значительно уступает ИФА (соответственно 3 мкг/мл и 1 нг/мл) [10].

Авторами были проведены исследования для сравнения способности к инактивации лактоферрина 11 культур микроорганизмов из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г.Оренбург) с использованием метода ИФА и РИД для определения остаточной концентрации лактоферрина и расчета АЛфА. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Как видно из табл.1, при использовании ИФА способность к инактивации лактоферрина была выявлена у 10 из 11 культур микроорганизмов (что составило 90,9%) и диапазон количественных изменений инактивированного лактоферрина составил 0-17,3 нг/мл. При использовании РИД у всех исследуемых культур не удалось обнаружить АЛфА из-за низкой, по сравнению с ИФА, чувствительности данного метода.

Это подтверждает, что используемый авторами в заявляемом способе ИФА для определения остаточной концентрации лактоферрина и расчета АЛфА микроорганизмов благодаря уникальной специфичности иммунохимического анализа в сочетании с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки [11] позволяет с высокой точностью количественно оценивать антилактоферриновую активность микроорганизмов.

Таблица 1. Антилактоферриновая активность микроорганизмов при различных методах выявления количества инактивированного лактоферрина
Вид микроорганизма	Значения АЛфА, нг/мл
РИД	ИФА
Staphylococcus epidermidis	0	2,40
Staphylococcus hominis	0	1,97
Staphylococcus xylosus	0	5,23
Shigella flexneri	0	6,58
Providencia rettgeri	0	13,50
Escherichia coli	0	4,18
Klebsiella oxytoca	0	5,31
Klebsiella pneumoniae	0	2,22
Candida albicans	0	7,45
Salmonella enteritidis	0	17,3
Salmonella typhimurium	0	0

Авторами для инкубации микробной взвеси с лактоферрином использовалась концентрация лактоферрина 100 нг/мл. Выбор данной концентрации определялся тем, что наиболее воспроизводимые результаты в ИФА могут быть получены при использовании средних концентраций лактоферрина, определяемых с используемыми реагентами ИФА [11]. Учитывая, что диапазон определяемых концентраций лактоферрина с используемыми реагентами ИФА (ЗАО “Вектор-Бест”, Россия) составлял 0-120 нг/мл, то средние значения концентрации лактоферрина составляют 60-100 нг/мл. В дальнейшем авторами экспериментально была выбрана концентрация лактоферрина 100 нг/мл, которая не подавляет рост исследуемых микроорганизмов (таблица 2).

Как видно из таблицы 2, концентрации лактоферрина более высокие, чем 100 нг/мл оказывали бактериостатическое действие, а лактоферрин в концентрации 100 нг/мл и в меньших концентрациях не влиял на рост бактерий. Это подтверждает обоснованность выбора данной концентрации лактоферрина для изучения АЛфА микроорганизмов иммуноферментным анализом.

Таблица 2. Чувствительность микроорганизмов к лактоферрину
Вид микроорганизма	Рост бактерий при различных концентрациях лактоферрина (нг/мл)
0	25	50	100	200	1000
Staphylococcus aureus	+	+	+	+	-	-
Staphylococcus epidermidis	+	+	+	+	-	-
Pseudomonas aeruginosa	+	+	+	+	-	-
Escherichia coli	+	+	+	+	-	-
Klebsiella pneumoniae	+	+	+	+	-	-
Salmonella enteritidis	+	+	+	+	-	-

Для осуществления способа используется человеческий лактоферрин, кристаллический, производства фирмы "Fluka" (Швейцария), степень чистоты препарата (по данным гель-электорофореза) более 90%, растворимость 1 мг/мл Н₂О, по каталогу №61326 [12].

Способ осуществляется следующим образом.

1. Исследуемые культуры микроорганизмов выращивают на плотной питательной среде при 37°С в течение 18-24 ч.

2. Из выросшей агаровой культуры готовят взвесь микроорганизмов (10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича) в жидкой питательной среде (для каждого вида микроорганизмов используется соответствующий тип питательной среды).

3. Готовят раствор лактоферрина в концентрации 100 нг/мл на забуференном физиологическом растворе (Sigma, P4417. Состав: 0.01 М фосфатный буфер, 0.0027 М КСl, 0.137 М NaCl, pH 7,4 при 25°С).

4. Взвесь исследуемых культур микроорганизмов объемом 50 мкл вносят в лунки стерильного полистиролового планшета и смешивают с 50 мкл приготовленного раствора лактоферрина.

5. Параллельно с опытной готовят контрольную пробу: в лунки полистиролового планшета вносят 50 мкл раствора лактоферрина и 50 мкл стерильной жидкой питательной среды.

6. Пробы инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч.

7. После инкубации содержимое лунок переносят в пластиковые пробирки, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 мин, отбирают 50 мкл супернатанта в опытной и контрольной пробах.

8. Рабочим раствором буфера опытную и контрольную пробы разводят в 5 раз (до объема 250 мкл).

9. Проводят определение остаточной концентрации лактоферрина в супернатанте опытной и контрольной проб твердофазным иммуноферментным анализом с использованием реагентов ЗАО “ВЕКТОР-БЕСТ” (Россия) в соответствии с инструкцией по использованию реагентов. Измерение оптической плотности опытной и контрольной проб проводится на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм, перерасчет концентрации лактоферрина осуществляется путем построения калибровочных графиков. Найденные по графику значения концентрации лактоферрина умножают на коэффициент разведения проб, т.е. на 5, и получают результат в нг/мл.

10. Рассчитывают антилактоферриновую активность по формуле

АЛфА=Ск-Со,

где АЛфА - антилактоферриновая активность, нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;

Ск - концентрация лактоферрина в контроле, нг/мл;

Со - концентрация лактоферрина в опыте, нг/мл.

Антилактоферриновую активность выражают в нг инактивированного лактоферрина на мл супернатанта (нг/мл).

Пример 1. У штамма Providencia rettgeri, выделенного от больного с парапроктитом, была изучена способность инактивировать лактоферрин. Для этого из суточной агаровой культуры была приготовлена взвесь 10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича в жидкой питательной среде, 50 мкл взвеси культуры вносили в лунку стерильного полистиролового планшета, далее в лунку вносили 50 мкл раствора лактоферрина в концентрации 100 нг/мл. В контрольной пробе вместо культуры микроорганизма в лунку вносили 50 мкл жидкой питательной среды. После 18 ч инкубации при 37°С содержимое каждой лунки переносили в пластиковые пробирки, супернатант отделяли от бактериальных клеток центрифугированием в течение 20 мин (8000 об/мин). Далее из каждой пробы отбиралось по 50 мкл супернатанта и определялось в нем содержание лактоферрина иммуноферментным анализом согласно инструкции, прилагаемой к набору реагентов ЗАО “ВЕКТОР-БЕСТ” (Россия). Регистрацию результатов проводили фотометрически на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм. Были получены следующие значения оптической плотности опытной пробы -0,144 и контрольной -0,350. Концентрацию лактоферрина в опытной и в контрольной пробах рассчитывали по калибровочному графику исходя из значений оптической плотности проб. Для построения его использовали бланк, прилагаемый к набору: ось абсцисс - концентрация ЛФ в калибровочных пробах (120 нг/мл, 60 нг/мл, 30 нг/мл, 15 нг/мл, 7,5 нг/мл, 0 нг/мл); ось ординат - соответствующее значение оптической плотности (ОП₄₉₂ ). Были получены следующие значения концентрации лактоферрина в опытной пробе -15,12 нг/мл и в контрольной пробе - 36,75 нг/мл. Антилактоферриновую активность (АЛфА) рассчитывали по формуле

АЛфА=36,75-15,12=21,63 нг/мл,

где 21,63 - антилактоферриновая активность, нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;

36,75 - значение концентрации лактоферрина в нг/мл в контроле;

15,12 - значение концентрации лактоферрина в нг/мл в опыте. Таким образом, антилактоферриновая активность штамма Providencia rettgeri составляет 21,63 нг/мл.

Пример 2. У 63 штаммов микроорганизмов из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г.Оренбург) была определена антилактоферриновая активность с использованием заявляемого способа и способа-прототипа.

При использовании способа-прототипа исследуемые культуры микроорганизмов выращивали в жидкой питательной среде, выросшие культуры обрабатывали хлороформом, отделяли супернатант и смешивали его с лактоферрином, параллельно с опытной готовили две контрольные пробы, при этом в контроль 1 вместо супернатанта исследуемых культур микроорганизмов добавляли жидкую питательную среду, а контроль 2 готовили из забуференного физиологического раствора и жидкой питательной среды, опытную и контрольные пробы инкубировали, после инкубации добавляли тест-культуру Micrococcus luteus ГИСК №211001 и проводили первое измерение оптической плотности в опыте и контролях непосредственно по достижении режима термостатирования (37°С) и второе измерение через 24 ч инкубации, затем рассчитывали антилактоферриновую активность по изменению оптических плотностей в опыте и контролях. При использовании заявляемого способа исследуемые культуры микроорганизмов выращивали на плотной питательной среде, из выросших агаровых культур готовили микробную взвесь, смешивали ее с лактоферрином, параллельно готовили контроль, при этом в контроль вместо микробной взвеси добавляли жидкую питательную среду, опытную пробу и контроль инкубировали, отделяли супернатант от бактериальных клеток центрифугированием, определяли концентрацию лактоферрина в опытной и контрольной пробах иммуноферментным анализом и затем рассчитывали антилактоферриновую активность по разнице остаточной концентрации лактоферрина в опыте и контроле. Сравнительный анализ результатов определения АЛфА микроорганизмов данными способами представлен в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, использование заявляемого способа позволило выявить АЛфА у 100% штаммов исследуемых микроорганизмов, а в способе-прототипе - только у 68,5% исследуемых штаммов.

Кроме того, в заявляемом способе уровень выявляемой АЛфА микроорганизмов был выше, чем способом-прототипом: для штаммов S. aureus, не продуцирующих лизоцим - 35,6% в заявляемом способе против 24,3% в способе-прототипе; для Е.coli соответственно 59,65% против 44,7%; для К. pneumoniae соответственно 47,77% против 29,3%; для S. typhimurium соответственно 75,0% против 48,5%.

Таблица 3. Сравнительный анализ чувствительности определения АЛФА микроорганизмов с использованием заявляемого способа и способа-прототипа
Вид микроорганизма	Количество штаммов	Средние значения антилактоферриновой активности (М±m)
способ-прототип	заявляемый способ
%	%	нг/мл
Штаммы Staphylococcus aureus, не продуцирующие лизоцим	5	24,3±3,48	35,6±5,2	13,7±3,65
Лизоцимпродуцирующие штаммы Staphylococcus aureus	10	невозможно определить в 100% случаев	23,61±2,47	9,1±0,88
Pseudomonas aeruginosa	10	невозможно определить в 100% случаев	26,28±3,59	9,01±0,98
Escherichia coli	10	44,7±4,41	59,65±5,60*	22,9±2,90
Klebsiella pneumoniae	8	29,3±2,96	47,77±6,20*	18,4±1,25
Salmonella enteritidis	12	39,1±3,32	58,33±6,41*	5,98±0,86
Salmonella typhimurium	8	48,5±7,62	75,0±8,75*	6,29±0,91
Примечание: * - достоверность различий заявляемого способа и способа-прототипа при р<0,05.

Использование заявляемого способа позволило выявить и диапазон количественных значений лактоферрина, инактивированного исследуемыми микроорганизмами, и составивший 5,98-22,9 нг/мл (таблица 3), что невозможно определить способом-прототипом.

Пример 3.

У 12 штаммов S.enteritidis, выделенных от больных сальмонеллезом и у 8 штаммов S.enteritidis, выделенных от реконвалесцентных сальмонеллезных бактерионосителей была определена АЛфА заявляемым способом. Было установлено, что средний уровень количества инактивируемого лактоферрина у штаммов, выделенных от реконвалесцентных сальмонеллезных бактерионосителей, составил 9,52±0,98 нг/мл, а у штаммов, выделенных от больных сальмонеллезом -5,98±0,61 нг/мл. Это показывает, что от сальмонеллезных бактерионосителей выделяются штаммы с более высоким уровнем АЛфА, чем от больных сальмонеллезом.

Тем самым заявляемый способ позволяет дифференцировать исследуемые культуры микроорганизмов по количественным значениям уровня АЛфА, что важно для установления этиологической значимости этого свойства микроорганизмов при патологических процессах.

Таким образом, использование предлагаемого способа определения антилактоферриновой активности микроорганизмов позволяет за счет увеличения чувствительности способа и повышения точности количественной оценки определять ее у более широкого круга микроорганизмов и с большей точностью, что актуально при диагностике и прогнозировании заболеваний микробной этиологии, проведении эколого-эпидемиологических исследований.

Источники информации

1. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). - Екатеринбург: УрО РАН, 1996. - С.207.

2. Бухарин О.В. Усвяцов Б.Я. Карташова О.Л. Биология патогенных кокков. - М.: Медицина, 2002. - С.38-48.

3. Brock J.H. The physiology oflactoferrin //Biochem. Cell Biol. - 2002. - V.80, №1. - P.1-6.

4. Патент РФ №2156807, МПК 7 С 12 Q 1/02, 1/04, публ.27.09.00 (прототип).

5. Бухарин О.В., Васильев H.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцим микроорганизмов. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 1984. - С.17.

6. Заявка №2001133150/13 от 06.12.01, МПК 7 С 12 Q 1/02, положительное решение от 30.09.02.

7. Патент РФ №№2175673, МПК 7 C 12 Q 1/04, 1/14, публ. 10.11.01.

8. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. -Киев: Наукова думка, 1990. - С.106-108.

9. Немцева Е.Р. и др. Иммуноферментный метод определения лактоферрина человека и его использование для диагностики гнойно-септических осложнений //Вопросы медицинской химии. 1995. Т.41. №3. - С.58-61.

10. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под редакцией В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 365 с.

11. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. шк., 1991. - С.3.

12. Каталог фирмы "Fluka"(chemical company): Laboratory chemicals. - 2001/2002. - С.860.