фотодинамическая терапия для селективной инактивации клеток в крови и для лечения заболеваний с иммунной дисфункцией

Формула изобретения

1. Способ избирательного уменьшения популяции активированных лейкоцитных клеток в лейкоцитсодержащей жидкости у субъекта, пораженного рассеянным склерозом, нуждающегося в таком уменьшении, включающий a) обработку указанной жидкости или ее активированной лейкоцитсодержащей фракции эффективным количеством светочувствительного соединения in vivo или in vitro с последующим введением указанной жидкости или фракции в организм, и b) облучение указанной обработанной жидкости или фракции светом, включающим, по крайней мере, одну длину волны, поглощаемую указанным светочувствительным соединением.

2. Способ по п.1, в котором указанным светочувствительным соединением является соединение на основе порфирина.

3. Способ по п. 1, в котором указанным соединение является соединение зеленого порфирина (Gp) или производное гематопорфирина.

4. Способ по п.3, в котором указанным Gp соединением является BPD - MA и производным гематопорфирина является натрий порфимер.

5. Способ по п.1, в котором указанным светочувствительным соединением является Gp соединение, имеющее формулу, выбранную из группы, состоящей из

где каждый из R¹ и R² является независимо карбалкокси, алкил или арилсульфонилом, арилом, циано или -CONR⁵CO-, где R⁵ является алкилом или арилом,

каждый R³ является независимо низшим алкилом, карбоксиалкилом или его солью, сложным эфиром, амидом или ацилгидразоном;

R⁴ является - CH=CH₂, -CH₂OR^4", -CHO, -COOR^4", CH(OR^4")CH₃, -CH(OR^4")CH₂OR^4", -CH(SR^4")CH₃, -CH(NR^4"₂)CH₃, -CH(CN)CH₃, -CH(COOR^4")CH₃, -CH(COOCR^4")CH₃, -CH(галоген)CH₃, или -CH(галоген) CH₂(галоген), где R^4" является H, алкилом, органической группой с менее, чем 12 C, образующейся при прямой или непрямой дериватизации винила, или группой, содержащей 1 - 3 ядра тетрапирролового типа формулы -L-P, где -L- выбран из группы, состоящей из

P имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из Gp, где Gp имеет формулы 1 - 6, но отсутствует R⁴ и соединен с L через положение, показанное в формуле 1 - 6, как занятое R⁴ и порфирина формулы



или



где R является H или алкилом;

R³ и R⁴ такие, как определены выше, и незанятая связь соединена с L.

6. Способ по п.5, в котором R¹ и R² являются карбометокси или карбоэтокси.

7. Способ по п.5, в котором каждый R³ является -CH₂CH₂COOH или ее солью, амидом, сложным эфиром или ацилгидразоном.

8. Способ по п. 5, в котором R⁴ выбирают из группы, состоящей из -CH(NH₂)CH₃, -CH(имидазол)CH₃

-CH(OH)CH₃, -CHBrCH₃, -CH(OCH₃)CH₃, -CH(пиридиний бромид)CH₃, -CH(SH)CH₃ и его дисульфид, -CHOHCH₂OH, -CHO, -COOH и -COOCH₃.

9. Способ по п.4, в котором указанный Gp имеет формулу 3 или 4.

10. Способ по п.5, в котором указанный Gp имеет формулу, выбранную из группы, состоящей из





11. Способ по п.1, в котором указанную обработку проводят светочувствительным соединением с концентрацией около 0,05 - 5 мкг/мл.

12. Способ по п.1, в котором указанную обработку проводят светочувствительным соединением с концентрацией около 0,1 - 1 мкг/мл.

13. Способ по п.1, в котором указанную обработку проводят светочувствительным соединением с концентрацией около 0,5 мкг/мл.

14. Способ лечения пациента, имеющего рассеянный склероз, включающий а) обработку, по крайней мере, части лейкоцитсодержащей жидкости организма, или ее фракции, содержащей активные лейкоциты, эффективным количеством соединения зеленого порфирина (Gp); b) облучение указанной обработанной жидкости светом, содержащим, по крайней мере, одну длину волны, поглощаемую указанным Gp соединением.

15. Способ по п.14, в котором указанным Gp является BPD-DA, BPD-DB, BPO-MA или BPD-MB.

16. Способ по п. 14, в котором указанным пациентом является реципиент трансплантата.

17. Способ по п. 14, в котором указанный пациент имеет дополнительное аутоиммунное заболевание.

18. Способ по п.17, в котором указанным дополнительным аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит.

19. Способ улучшения физиологических показателей при рассеянном склерозе, включающий а) отбор крови у субъекта при необходимости такого улучшения; b) подачу в указанную кровь или ее фракцию количества светочувствительного соединения, эффективного для оказания биологического действия при активации; c) облучения крови или ее фракции светом, поглощаемым указанным светочувствительным соединением при интенсивности, достаточной для активации указанного светочувствительного соединения, которое производит токсическое действие; и d) возвращение обработанной крови или ее фракции субъекту.

20. Способ по п.19, в котором указанным светочувствительным соединением является соединение на основе порфирина.

21. Способ по п. 19, в котором указанным соединением является зеленый порфирин или производное гематопорфирина.

22. Способ по п. 21, в котором указанным зеленым порфирином является BPD-MA и производным гематопорфирина является натрий порфимер.

23. Способ улучшения физиологических показателей рассеянного склероза, включающий а) введение субъекту, при необходимости такого улучшения, количества светочувствительного соединения, эффективного для распределения в указанном субъекте; b) возможность осуществления указанного распределения: и c) облучение субъекта светом, поглощаемым указанными светочувствительным соединением при интенсивности, достаточной для активации указанного светочувствительного соединения, которое осуществляет токсическое действие.

24. Способ по п.23, в котором указанным светочувствительным соединением является соединение на основе порфирина.

25. Способ по п. 23, в котором указанным соединением является зеленый порфирин или производное гематопорфирина.

26. Способ по п. 25, в котором указанным зеленым порфирином является BPD-MA и производным гематопорфирина является натрий порфимер.

27. Способ по п.23, в котором указанным субъектом является человек.

28. Способ улучшения физиологических показателей рассеянного склероза, включающий a) введение, по крайней мере, в один сустав субъекта, при необходимости такого улучшения, количества светочувствительного соединения, эффективного, будучи активированным светом, для осуществления токсического действия; и b) облучение сустава светом, поглощаемым указанным светочувствительным соединением при интенсивности, достаточной для активации указанного светочувствительного соединения, которое осуществляет токсическое действие.

29. Способ по п.28, в котором указанным светочувствительным соединением является соединение на основе порфирина.

30. Способ по п. 28, в котором указанным соединением является зеленый порфирин или производное гематопорфирина.

31. Способ по п. 30, в котором указанным зеленым порфирином является BPD-MA и производным гематопорфирина является натрий порфимер.

32. Способ по п.28, в котором указанное облучение концентрируют, по крайней мере, на одном суставе указанного субъекта.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Данное изобретение относится к фотодинамическим способам селективного снижения (истощения) клеток крови или клеток костного мозга, важных в развитии некоторых заболеваний. В частности, оно относится к способам селективного уменьшения популяции активированных лейкоцитов в крови или костном мозге субъектов с иммунными дисфункциональными нарушениями, таких как пациенты с аутоиммунными заболеваниями или пациенты, инфицированные ВИЧ (HIV). Еще более конкретно, оно относится к способам лечения конкретных аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз и ревматоидный артрит, с использованием фотодинамической терапии.

Предшествующий уровень техники

Изучены иммунонарушения, вызванные вирусом иммунодефицита человека, но природа развития заболевания все еще остается невыясненной. Однако показано, что ВИЧ-инфицированные люди имеют циркулирующие цитотоксические Т-лимфоциты, которые лизируют неинфицированные CD4⁺ клетки, Zarling et al., J. Immunol., 144:2992 (1990). Кроме того, обычно полагают, что заражение ВИЧ, при истощении уровней CD4⁺ клеток, повышает уровни CD8⁺, DR⁺ и IL-2R⁺ лейкоцитов. IL-2R⁺ считают маркером активации и DR⁺ считают HLA маркером. Они могут присутствовать в клетках с дополнительными маркерами, такими как CD4⁺ и CD8⁺.

Один подход, препятствующий развитию этого заражения, и получающемуся в результате иммуноподавления, использует стратегии изменения состава крови в отношении различных компонентов иммунной системы.

В Пат. США N 4960408 раскрывается способ системного лечения субъекта, имеющего СПИД-ассоциированный комплекс, псораленом, и затем, экстракорпорально, обработкой Т-лимфоцитов ультрафиолетовым облучением, имеющим длину волны, поглощаемую псораленом. Облученные Т-клетки затем возвращают субъекту. Эта обработка, очевидно, повышает уровни CD3⁺, CD4⁺ и CD8⁺ клеток, хотя и не в одинаковой степени.

Фотодинамическая терапия обычно включает введение светочувствительного агента, позволяя агенту направиться к клеткам или тканям, разрушения которых добиваются, и облучение клетки или ткани светом, поглощаемым светочувствительным агентом. Согласно теории, возбужденный светочувствительный агент, при распаде до основного состояния, генерирует вещества, предположительно синглетный кислород, которые являются токсичными для проксимальных клеток или тканей.

Фотодинамическая терапия была первоначально применена для лечения опухолей у людей и животных. Описан ряд классов светочувствительных агентов, включая псоралены, которые активируют УФ-светом, различные производные гематопорфирина, которые активируют видимым светом, и другие ароматические системы, такие как фталоцианины, и модифицированные порфирины, такие как хлорины. Кроме того, Пат. США N 5095030, выданный 10 марта 1992 г., который включен в качестве ссылки, раскрывает различные, специфичные к длине волны, цитотоксичные агенты, которые имеют родовое название "зеленые порфирины". Эти соединения являются производными порфирина, которые модифицируют реакцией Дильса-Альдера, чтобы эффективно сдвинуть длину волны поглощения в сторону большей длины волны. Это приводит к некоторым благоприятным свойствам по сравнению, например, с производными гематопорфирина, когда обычно эти соединения применяют в фотодинамической терапии. Как описано в данном патенте, эти цитотоксичные агенты, обычно называемые BPDS, поглощают видимый свет при длинах волн, которые сводят к минимуму взаимодействие окружающей ткани с входящим облучением.

В дополнение к лечению опухолей и злокачественных образований фотодинамическая терапия была предложена для разрушения атеросклеротических бляшек и для избавления подачи в кровь патогенных агентов. В общем, считают, что светочувствительный агент должен избирательно притягиваться к или удерживаться нежелательными клетками или тканью, по сравнению с нормальными клетками или тканью, и избирательность протокола была основана частично на этой особенности светочувствительных агентов и частично на фокусировании местоположения, к которому применяют видимый или УФ-свет.

Теперь стало возможным уменьшить избирательно уровни активированных субтипов лейкоцитов, которые связаны с ВИЧ заражением или другими иммунными дисфункциями, используя светочувствительный агент, в частности соединения зеленого порфирина, описанные выше. Это снижение может быть произведено без побочных воздействий на нормально функционирующие популяции В клетки, CD4⁺ клетки, CD8⁺ клетки или NK клетки. Используя способ изобретения, можно обработать либо лейкоциты после отделения от эритроцитов, либо цельную кровь.

Теперь также установлено, что два конкретных аутоиммунных заболевания, рассеянный склероз и ревматоидный артрит, как подтверждено, отвечают на фотодинамическую терапию, не только с точки зрения использования зеленых порфиринов как фоточувствительных агентов, но обычно также используя фотодинамические терапевтические агенты.

Сущность изобретения

Изобретение обеспечивает способ, который избирательно понижает популяцию активированных лейкоцитов у субъектов, показывающих повышенные уровни маркеров активации лейкоцитов. Способ изобретения включает обработку жидкости организма, такой как костный мозг, кровь, или их соответствующую фракцию, определенным классом соединений, используемых в фотодинамической терапии, с последующим облучением крови или фракции светом, имеющим, по крайней мере, одну длину волны, поглощаемую светочувствительным соединением. Обработка может проводиться in vivo, полностью экстракорпорально, или частично in vivo и частично ex vivo.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу селективного уменьшения популяции активированных лейкоцитов в жидкости организма субъекта, при необходимости такого уменьшения, и этот способ включает:

(1) обработку жидкости организма, или активированной, лейкоцит-содержащей ее фракции, эффективным количеством светочувствительного соединения, такого как соединение зеленый порфирин (Gp); и

(2) облучение обработанной жидкости организма светом, включающим, по крайней мере, одну длину волны, поглощаемую светочувствительным соединением.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения ВИЧ-инфицированного пациента или другого пациента с иммунной дисфункцией, и этот способ включает обработку, по крайней мере, части жидкости организма пациента, или ее фракции, содержащей клетки, подлежащие истощению, эффективным количеством светочувствительного соединения, с последующим облучением.

В других аспектах данное изобретение относится к лейкоцит-активированной крови, плазме или другой субфракции, которая истощена активированными лейкоцитами, ВИЧ-инфицированными клетками, или свободным ВИЧ.

Изобретение также обеспечивает способы лечения рассеянного склероза и равматоидного артрита. Способы используют методики, обычно используемые в фотодинамической терапии; вводят светочувствительные соединения и позволяют им системно распределиться; затем субъект облучают светом, поглощаемым светочувствительным соединением.

Таким образом, в одном аспекте, данное изобретение относится к способу уменьшения интенсивности симптомов рассеянного склероза или ревматоидного артрита, и этот способ включает введение субъекту, при необходимости такого уменьшения интенсивности симптомов, количества светочувствительного соединения для эффективного распределения в указанном субъекте;

возможность осуществления указанного распределения;

и

облучение субъекта светом, поглощаемым указанным светочувствительным соединением при интенсивности, достаточной для активации указанного светочувствительного соединения, которое оказывает свое токсическое действие.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1A и 1B показывают действие Gp и облучения на различные субтипы лейкоцитов, имеющих различные маркеры, включая B клетки, CD4⁺ клетки, CD8⁺ клетки, DR⁺ клетки и IL-2R⁺ клетки в крови от двух ВИЧ-инфицированных пациентов.

Фиг. 2 показывает относительные концентрации субтипов лейкоцитов в крови от нормального донора и от двух ВИЧ-инфицированных пациентов.

Фиг. 3A и 3B показывает относительные концентрации субтипов лейкоцитов в крови от нормального донора и ВИЧ донора, соответственно, до и после обработки BPD и облучения.

Фиг. 3C показывает уровни IL-2R⁺ клеток, в частности, до и после обработки БПП (BPD) и облучения, как у нормальных, так и ВИЧ-инфицированных субъектов.

Фиг. 4 показывает инактивацию клетки, ассоциированной с ВИЧ, путем обработки BPD и облучением.

Фиг. 5 показывает родовые структуры различных зеленых порфиринов, используемых в изобретении.

Фиг. 6 показывает структуры предпочтительных зеленых порфиринов, в частности BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA и BPD-DB.

Фиг. 7 представляет график зависимости тяжести заболевания у ФДТ (PDT)-обработанных и необработанных мышей после индуцирования экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ, ЕАЕ).

Фиг. 8 представляет график, показывающий действие трансдермального ФДТ (ФДТ) на индукцию ЭАЭ (ЕАЕ) у мышей.

Фиг. 9 представляет график, показывающий действие ФДТ (PDT), используя липосомный BPD-MA, на заболеваемость коллаген-индуцированным артритом у мышей.

Фиг. 10 показывает результаты сходной обработки, проводимой при различном времени на модели.

Способы выполнения изобретения

Способы изобретения также включают обработку жидкости организма, такой как костный мозг, кровь, или соответствующих ее фракций, содержащей анормально повышенные уровни эндогенных или инфицированных эндогенных клеток светочувствительным соединением, таким как соединение зеленый порфирин, с последующим облучением жидкости организма или фракции светом, поглощаемым светочувствительным соединением. Способ изобретения может проводиться рядом протоколов. Два наиболее важных элемента гарантируются: (1) что светочувствительное соединение связывается с клетками, популяции которых должны быть уменьшены и (2) что светочувствительное соединение, связанное с этими клетками, облучают соответствующей длиной волны. Используемый здесь термин "жидкость организма" относится к жидкостям организма, которые содержат повышенные уровни активированных лейкоцитов или других клеток, таких как ВИЧ-инфицированные клетки, подлежащие истощению. Такие жидкости организма обычно включают костный мозг, кровь и их фракции.

Хотя костный мозг можно использовать в качестве субстрата для способа изобретения, использование крови пациента часто более удобно. Таким образом, в одном протоколе цельную кровь отбирают у субъекта и обрабатывают подходящей концентрацией светочувствительного соединения в течение интервала времени, достаточного для того, чтобы позволить соединению связаться с требуемыми клетками мишени. Цельную кровь можно облучить светом соответствующей длины волны в экстракорпоральном контейнере или аппарате, и затем обработанная и облученная кровь может быть возвращена пациенту.

Кровь, отбираемую у пациента, можно также разделить на фракции, обычно на фракцию, содержащую эритроциты, и фракцию лейкоцит-обогащенной плазмы. Плазму, содержащую лейкоциты, обычно обрабатывают светочувствительным соединением и облучают до возвращения плазмы и эритроцитов (при необходимости) в тело пациента. Конечно, разделение на фракции можно проводить в любой точке во время экстракорпоральной обработки так, чтобы светочувствительное соединение можно было добавить к цельной крови до ее разделения на фракцию эритроцитов и фракцию, обогащенную лейкоцитами, и затем только обогащенная лейкоцитами фракция обычно подлежит облучению.

Альтернативно, светочувствительное соединение, или смесь его, можно вводить системно пациенту в подходящих составах, обычно путем инъекции, а также с помощью других путей введения, таких как пероральное введение или введение через слизистую оболочку. В том случае, когда светочувствительному соединению было достаточно времени для поступления в кровоток, к телу пациента можно применить подходящий источник облучения. Например, можно ввести в подходящие положения в кровоток волоконно-оптическое устройство в виде катетера или можно применить внешнюю трансдермальную экспозицию светом. Кровь или другая жидкость организма может таким образом быть облучена in vivo.

К подходящим субъектам для этого лечения согласно данному изобретению относится ВИЧ-инфицированные пациенты, у которых, как было показано, в крови имеются повышенные уровни активированных лейкоцитов, таких как DP⁺ и IL-2R⁺ клетки. Эти уровни могут быть избирательно уменьшены способом данного изобретения. К другим пациентам, у которых, как предполагают, имеются повышенные уровни этих клеток, относятся пациенты, у которых проявляется нежелательная иммуноактивность, обычно такие, как пациенты, страдающие заболеванием, обусловленным зависимостью трансплантат-хозяин или отторжением органа-трансплантата в результате, например, трансплантации органа или костного мозга. Для трансплантации можно обрабатывать либо жидкости из органа-донора, либо жидкости от пациента-реципиента. Другими потенциальными субъектами являются те, у которых проявляются аутоиммунные состояния, такие как ревматоидный артрит, дискоидная красная волчанка (Iupus erythematosus), мышечная дистрофия, или миастения тяжелая (gravis).

Обычно светочувствительный агент вводят таким образом, чтобы получить конечную концентрацию в жидкости или фракции жидкости, подлежащей обработке, около 0,05-5 мкг/мл, предпочтительно около 0,1-1 мкг/мл и наиболее предпочтительно около 0,5 мкг/мл. Обработанную жидкость или фракцию жидкости затем облучают светом от любого подходящего источника, такого как лазерный диод, светоизлучающий диод, свет лазера, подводимый волоконно-оптической системой и т.п.

Типичные длины волн находятся в диапазоне около 600-790 нм, предпочтительно около 630-710 нм и наиболее предпочтительно около 790-780 нм. Типичные интенсивности составляют порядок около 1-50 Дж/см² (J/cm²), предпочтительно около 5-25 Дж/см² и наиболее предпочтительно около 8-15 Дж/см². Для этих интенсивностей предпочтителен диапазон длин волн около 785-695 нм.

Облучение обычно продолжают в течение приблизительно 2-180 минут, предпочтительно приблизительно 15-120 минут, в зависимости от природы и концентрации светочувствительного агента, количества подвергаемой обработке жидкости, восприимчивости клеток пациента к обработке, интенсивности и длины волны света и способа облучения (in vivo или ex vivo). Подходящая оптимизация концентрации светочувствительного соединения и параметров облучения находится в руках специалиста средней квалификации.

В одном варианте воплощения данное изобретение обеспечивает протоколы улучшения интенсивности симптомов и обычно лечения состояний рассеянного склероза и ревматоидного артрита у субъектов, пораженных этим заболеванием.

Нижеследующие примеры подтверждают, что фотодинамическое лечение этих состояний успешно. Широко признанные модельные системы для каждого из этих состояний показывают успешные ответные реакции. Параметры, описанные на этих иллюстрациях, допускают моделирование успешных протоколов для субъектов-людей, которые должны быть подвергнуты лечению состояний, которые имитируются моделями, служащими в качестве примера.

Более детально, светочувствительные агенты, которые используют в изобретении, включают любое соединение, предпочтительно органическое соединение, которое проявляет селективное цитотоксическое действие при активации путем экспозиции электромагнитным излучением, предпочтительно облучением, имеющим длину волны в ультрафиолетовом или видимом диапазоне. Полагают, что активирующее облучение возбуждает один или более атомов кислорода в молекуле с образованием синглетного состояния кислорода. Возбужденный, синглетный, кислород существует только в течение короткого времени, но достаточно длительного для того, чтобы атаковать стенки клетки клеток-мишеней и тем самым вызвать селективный некроз мишени, клеток лейкоцитов.

Например, псоралены активируют УФ-светом, а различные производные гематопорфирина активируют облучением видимым светом. Другие светочувствительные агенты включают фталоцианины и модифицированные порфирины, такие как хлорины. Особенно предпочтительными светочувствительными агентами, однако, являются соединения зеленого порфирина ("Gp соединения"), особенно структуры, показанные на фиг. 5, и еще более предпочтительно структуры, показанные на фиг. 6

Gp соединения данного изобретения выбирают из группы производных порфирина, полученных реакциями Дильса-Альдера производных ацетилена с протопорфирином при условиях, при которых реакция осуществляется только при одной из двух доступных сопряженных, неароматических диеновых структур, присутствующих в протопорфирин-IX кольцевой системе (кольца A и B). Формулы, показанные на фиг. 5, представляют типичные Gp соединения изобретения. Эти соединения представлены на фиг. 5 с водородом, занимающим внутренние азоты кольца. Однако понятно, что могут быть также использованы металлированные формы, в которых катион замещает один или оба из этих водородов. Также понятно, что эти соединения могут быть мечены либо замещением одного или более атомов в структуре его радиоактивной формой, либо связыванием с радиоизотопом, таким как радиоактивный металл, или, например, радиоизотоп иода.

Для удобства, сокращение термина производное гидромонобензопорфирина - "ПБП" ("BPD") - обычно используют для обозначения Gp соединений формул 3 и 4 фиг. 5. ПБП (BPD"S) являются особенно предпочтительными формами Gp соединений изобретения. Кроме того, можно получить димерные формы Gp соединений, тем самым усиливая способность Gp соединения поглощать свет в расчете на один моль. Для того, чтобы обеспечить дополнительное поглощение света (длин волн), можно также применить димерную и многомерную формы Gp/порфирин комбинаций.

Модифицированные порфирины, названные здесь Gp соединениями, могут быть связаны со специфическими лигандами, реакционноспособными с мишенью, такими как рецепторспецифические лиганды, иммуноглобулины или иммуноспецифические части иммуноглобулинов, что позволяет им еще больше сконцентрироваться в требуемой ткани-мишени или веществах. Это связывание, кроме того, позволяет дополнительно понизить требуемые уровни доз, поскольку вещество тогда не расходуется зря на распределение в других тканях, чью деструкцию, в действительности нежелательную, нужно избежать.

Когда Gp соединение облучают in situ, используя свет в видимой области поглощения, фотоактивация приводит к цитотоксичности в окружающей ткани. Хотя спектр поглощения также включает более короткие длины волн, особенно полезным является максимум поглощения в области 670-780 нм.

В общем, положение поглощения длины волны определяется по эффективному насыщению одной из двух -связей в одном, а не двух, из четырех пиррольных колец, которые составляют типичную порфириновую систему. В протопорфирине-IX два из пирролов содержат винильные заместители, так что экзоциклическая -связь связана с одной из двух -связей в кольце. Реакция Дильса-Альдера, включающая взаимодействие одной из этих конъюгированных систем с диенофилом-производным ацетилена, приводит к конденсированному циклогексадиену - называемому здесь "гидробензо" - который конденсирован с A или B кольцом, как показано в формулах 1 и 2 фиг. 5. Перегруппировка -системы в гексадиеновое кольцо приводит к соединениям формул 3 и 4, и восстановлением получают соединения формул 5 и 6 фиг. 5. Все эти соединения обеспечивают требуемый батохромный сдвиг в максимуме поглощения. Конкретные получения Gp соединений, особенно полезных для данного изобретения, детально описаны в вышеупомянутом Пат. США N 5095030, который указан в качестве ссылки.

Для соединений, показанных на фиг. 5 и 6, обычно R¹ и R², каждый, независимо, являются умеренными электрон-акцепторными заместителями и чаще всего представляют карбалкокси, или алкил или арилсульфонил, или любыми другими активирующими заместителями, которые не достаточно электрон-акцепторны для того, чтобы участвовать в реакции с обоими A и B кольцами, а участвуют в реакции только с одним, таким как циано или -CONR⁵CO-, где R⁵ является арилом или алкилом. Один из R¹ и R² может произвольно быть H, в то время как другой представляет электрон-акцепторный заместитель достаточной силы, чтобы облегчить реакцию Дильса-Альдера.

Используемые здесь карбокси, как традиционно определено, представляет -COOH; карбалкокси представляет -COOR, где R является алкилом; карбоксиалкил обозначает заместитель -R"-COOH, где R" является алкиленом; и карбалкоксиалкил обозначает заместитель - R"-COOR, где R" и R являются алкиленом и алкилом соответственно. Алкилом называют насыщенный неразветвленный или разветвленный углеводородный радикал с 1-6 атомами углерода, такой как метил, н-гексил, 2-метилпентил, т-бутил, н-пропил, и т.д. Алкилен является таким же, как алкил, за исключением того, что эта группа двухвалентна. Арил и алкил сульфонильные части имеют формулу SO₂R, где R представляет алкил, как определено выше, или представляет арил, где арил представляет фенил, произвольно замещенный 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена (фтор, хлор, бром или иод), низшего алкила (1-4C) и низшего алкокси (1-4C). Кроме того, один или оба из R¹ и R² могут самостоятельно быть арилом, то есть фенилом, произвольно замещенным, как определено выше.

Как показано на фиг. 5, аддукт, образованный реакцией R¹-CC-R² с системой колец протопорфирина-IX (где R³ представляет защищенную форму 2-карбоксиэтила, такую как 2-карбометоксиэтил или 2-карбоэтоксиэтил; и R⁴ представляет -CH= CH₂), представляет соединения формул 1 и 2. Соединение формулы 1 является результатом присоединения к A кольцу, и соединение формулы 2 является результатом присоединения к B кольцу. В этих полученных продуктах формул 1 и 2 R⁴ остается -CH=CH₂. Однако эту винильную группу легко превращают в другие варианты воплощения R⁴ путем присоединения к, или окисления, винильного заместителя кольца B в формуле 1 или кольца A в формуле 2. Эти продукты присоединения или окисления могут быть далее замещены, если введенные заместители являются функциональными отщепляемыми группами. Например, -Br может быть замещен на -OH, -OR (где R является алкилом 1-6C, как выше), -NH₂, NHR, -NR₂ и т.д. В предпочтительном варианте воплощения, однако, один из введенных заместителей является водородом, а другой выбран из группы, состоящей из галогена (фтора, хлора, брома или иода), гидрокси, низшего алкила, амино или амида, и сульфгидрильной или другой органосульфидной группы, или может быть водородом. Введение заместителя в винильную группу заметно не изменяет спектр поглощения образующегося соединения. Например, продукт присоединения воды по Марковникову обеспечивает замещенную структуру, аналогичную структуре кольцевой системы гематопорфирина при релевантном кольце. Таким образом, соединения изобретения включают различные группы в виде R⁴, включая заместители, которые обеспечивают дополнительные кольцевые системы порфирина или порфирин-родственных кольцевых систем, как будет далее описано ниже.

R³ в протопорфирине-IX представляет 2-карбоксиэтил (-CH₂CH₂COOH). Однако природа R³ (если он не содержит -связь, сопряженную с -связью кольца) не существенна для протекания реакции Дильса-Альдера или не оказывает влияния на эффективность и спектр поглощения образующегося продукта. Таким образом, R³ может быть, например, низшим алкилом (1-4C), 1-карбоксиалкилом (2-6C), или их сложными эфирами или амидами. R³ заместитель может также быть замещен галогеном, как определено выше, или другими нереакционноспособными заместителями. Однако особенно удобными исходными веществами для Gp соединений изобретения являются порфирины природного происхождения, предпочтительно где R³ представляет -CH₂CH₂COOH или -CH₂CHR₂COOR, где R является алкилом (1-6C).

В ПВП (BPD) соединениях данного изобретения, как было установлено, выгодно гидролизовать или частично гидролизовать сложноэфирную карбоксигруппу в -CH₂CH₂COOR. Гидролиз протекает при намного более высокой скорости, чем гидролиз сложноэфирных групп R¹ и R², если они присутствуют, а растворимость и характеристики биораспределения образующихся соединений обычно более желательны, чем таковые у негидролизованной формы. Гидролиз приводит к дикислотным или монокислотным продуктам (или их солям).

Гидро-монобензопорфирины, которые получают непосредственно по реакции Дильса-Альдера, описанной в вышецитированных ссылках, могут быть также изомеризованы в соединения, имеющие формулы 3 и 4, представленные на фиг. 5.

В описаниях формул 3 и 4 на фиг. 5 не показано относительное положение экзоциклической метильной группы (кольцо A формулы 3 и кольцо B формулы 4) относительно R² заместителя. Любой изомер приемлем.

Кроме того, продукты реакции Дильса-Альдера могут быть селективно восстановлены, например, путем обработки водородом в присутствии палладия на активированном угле с получением насыщенных кольцевых аналогов, показанных формулами 5 и 6 на фиг. 5, которые соответствуют соответствующим продуктам реакции Дильса-Альдера колец A и B. Эти восстановленные продукты представляют собой менее предпочтительные варианты воплощения и их обычно меньше используют в способе изобретения, чем соединения формул 1-4.

Описание, изложенное выше относительно получения производных соединений формул 1 и 2, путем превращения остающегося винильного заместителя (R⁴), и относительно вариабельности -R³, применяется также к соединениям формул 3, 4, 5 и 6.

Соединения формул 3 и 4 (ПБП, BPD"S) и особенно те, которые имеют гидролизованные и частично гидролизованные карбоксигруппы в R³, наиболее предпочтительны. Соединения изобретения, которые содержат -COOH группу, могут быть получены либо в виде свободной кислоты, либо в виде солей с органическими или неорганическими основаниями.

Следует отметить, что многие из соединений фиг. 5 содержат, по крайней мере, один хиральный центр и поэтому существуют в виде оптических изомеров. Конъюгаты и способы данного изобретения включают соединения, имеющие обе конфигурации хиральных углеродов, независимо от того, обеспечиваются ли соединения в виде изолятов единственного изомера или в виде смесей энантиомеров и/или диастереомеров. Разделение смесей диастереомеров может быть произведено любым обычным способом. Смеси энантиомеров могут быть разделены с помощью обычных техник взаимодействия с оптически активными препаратами и разделения образовавшихся диастереомеров.

Кроме того, следует иметь в виду, что продукты реакции могут представлять неразделенные смеси присоединений к A и B кольцам, например смеси соединений, имеющих формулы 1 и 2, или 3 и 4, или 5 и 6. В излагаемых здесь способах лечения и диагностики могут быть использованы либо разделенные формы, то есть только формула 3 или только формула 4, либо смеси в любом соотношении.

На фиг. 6 представлены четыре особенно предпочтительных соединений данного изобретения, которые ранее не были описаны в данной области техники. Эти соединения обозначают производными бензопорфирина (ПБП, BPD"S), поскольку они являются формами Gp соединений, имеющих формулу 3 или 4. Они представляют гидролизованные или частично гидролизованные формы перегруппированных продуктов формул 3 и 4, где одна или обе из защищенных карбоксильных групп R³ гидролизованы. Сложноэфирные группы при R¹ и R² гидролизуются относительно медленно, так что превращение в формы, показанные на фиг. 6, осуществляются легко.

Для целей этого описания R³ представляет -CH₂CH₂COOR^3". Как показано на фиг. 6, в предпочтительном соединении формулы BPD-DA, каждый R^3" является H, R¹ и R² являются карбалкокси, и дериватизация (дериватизация -получение производных, прим. переводчика) имеет место при кольце A. Предпочтительным BPD-DB соединением является соответствующее соединение, в котором дериватизация имеет место при кольце В. BPD-MA представляет частично гидролизованную форму BPD-DA и BPD-MB, частично гидролизованную форму BPD-DB. Таким образом, в этих последних соединениях, R¹ и R² являются предпочтительно карбалкокси, один R^3" является предпочтительно H, а другой R^3" является предпочтительно алкилом (1-6C). Соединения формул BPD-MA и BPD-MB могут быть однородными, когда гидролизован только карбалкоксиэтил C кольца или только карбалкоксиэтил D кольца, или могут включать смеси C и D кольца - замещенных гидролизатов. Кроме того, в способе данного изобретения могут использоваться смеси из любых двух или более BPD-MA, -MB, DA и -DB.

Предполагают, что описание Gp соединений также включает и некоторые другие варианты воплощения, где R⁴ является другим, чем винил, или R³ является не-нативным заместителем.

Обычно, каждый R¹ и R³ независимо выбирают из группы, состоящей из карбалкокси (2-6C), алкил (1-6C) сульфонила, арил (6-10C) сульфонила, арила (6-10C); циано; и -CONR⁵CO-, где R⁵ является арилом (6-10C) или алкилом (1-6C);

Каждый R³ является независимо алкилом (1-6C), карбоксиалкилом (2-6C), или их солью, амидом, сложным эфиром или ацилгидразоном; и

R⁴ является -CHCH₂, -CH₂OR^4", -CHO, -COOR^4", -CH(OR^4")CH₃, -CH(OR^4")CH₂OR^4", -CH(SR^4")CH₃, -CH(NR₂^4")CH₃, CH(CN)CH₃, -CH(COOR^4")CH₃, -CH(COOCR^4")CH₃, -CH(галоген)CH₃, или -CH(галоген)CH₂(галоген), где R^4" является H или алкилом (1-6С), произвольно замещенным гидрофильным заместителем, или

где R⁴ является органической группой с < 12C, образующейся при прямой или непрямой дериватизации винила, или

где R⁴ является группой, содержащей 1-3 ядра тетрапирролового типа формулы -L-P, определенной здесь.

Соединения формул 3 и 4 на фиг. 5 и их смеси являются особенно предпочтительными. Также предпочтительны соединения, где R¹ и R² являются одинаковыми и представляют карбалкокси, особенно карбоэтокси. Также предпочтительны соединения, где R⁴ является -CHCH₂, -CH(OH)CH₃, -CH(галоген)CH₃, CH₃, или группой, содержащей 1-3 ядра тетрапирролового типа формулы -L-P, определенной ниже.

Используемый здесь термин "ядро тетрапирролового типа" представляет каркас, образованный системой из четырех колец:



или соль, сложный эфир, амид или ацилгидразон системы, которая является высоко сопряженной. Она включает порфириновую систему, которая в действительности является полностью сопряженной системой; хлориновую систему, которая в действительности представляет дигидро-форму порфирина; и восстановленную хлориновую систему, которая является тетрагидроформой полностью сопряженной системы. Когда говорят "порфирин", то имеют в виду полностью сопряженную систему. "Gp соединение", по существу, обозначает дигидро-форму порфириновой системы.

В одном варианте воплощения изобретения заместитель R⁴ включает, по крайней мере, одно дополнительное ядро тетрапирролового типа. Полученные соединения данного изобретения представляют собой димеры или олигомеры, в которых, по крайней мере, одна из кольцевых систем тетрапирролового типа является Gp соединением. Связь между Gp частью через положение R⁴ с дополнительной кольцевой системой тетрапирролового типа может осуществляться через эфирную, амино или винильную связь.

Как далее ниже будет описано, можно получить дополнительные производные кольцевых систем порфирина, которые имеют два доступных положения для заместителя (как в A, так и B кольцах), соответствующих R⁴.

Как установлено выше, соединения, имеющие формулы фиг. 5, включают соединения, где R⁴ получают присоединением к винильным группам первоначального Gp соединения. Таким образом, R⁴ может быть любым заместителем, который получают простой реакцией присоединения. Поэтому оба введенных заместителя могут быть, например, -OH или галогеном, и эти заместители могут быть далее замещены. Альтернативно, реагент присоединения может иметь форму HX, где H добавляют к углероду смежного кольца, получая R⁴ формулы



Винильная группа может также быть окислена с получением R⁴ в виде -CH₂OH, -CHO или -COOH и ее солей и сложных эфиров.

Таким образом, в общем R⁴ представляет любые заместители, в которые легко превращается винильная группа -CH=CH₂ путем реакций расщепления или присоединения, и далее продукты взаимодействия отщепляемых групп с дополнительными частями. Типичные R⁴ заместители включают: -CH(NH₂)CH₃, -CH (имидазол)CH₃



-CH(OH)CH₃, -CHBrCH₃, CH(OCH)₃CH₃, -CH(пиридиний бромид)CH₃, -CH(SH)CH₃ и его дисульфиды, -CHOHCH₂OH, -CHO, -COOH и -COOCH₃.

Когда R⁴, является -L-P, формула заместителя "-L-P" представляет заместитель, где -L выбирают из группы, состоящей из













и P выбирают из группы, состоящей из Gp, где Gp имеет одну из формул 1-6, представленных на фиг. 5, но отсутствует R⁴ и конъюгировано с L через положение, показанное на рисунке 5 как занятое R⁴, и порфирина формулы



или



где R³ и R⁴ такие, как определено выше, и незанятую связь затем конъюгируют с L.

Понятно, что аббревиатура представляет порфирин формулы



где каждый R является независимо H или низшим алкилом (1-4C).

Также понятно, что, когда -L- имеет формулу (e) или (f), кольцевая система, к которой присоединена двойная связь, будет иметь резонансную систему, соответствующую



в кольце, к которому, как показано, присоединена двойная связь.

Получение димеров и олигомеров

Димеры и олигомерные соединения данного изобретения можно получить, используя реакции, аналогичные реакциям димеризации и олигомеризации порфирина perse. Gp соединения или зеленый порфирин/порфирин связи могут быть получены прямо или порфирины могут быть сначала конъюгированы, а затем подвергнуты реакции Дильса-Альдера любого или обоих концевых порфиринов для превращения в соответствующее Gp соединение.

Для лечения субъектов, особенно людей, у которых проявляются симптоматологии рассеянного склероза, светочувствительное соединение, такое как соединения зеленого порфирина или их смеси, вводят системно, обычно путем инъекции. Инъекция может быть внутримышечной, внутривенной, подкожной, внутрибрюшинной, или может быть любым другим признанным путем введения.

Может быть также использован другой способ системного введения. Например, осуществляют чрезслизистое введение, используя наполнители, такие как соли желчных кислот или соли фузидовых (fusidic) кислот. Трансдермальный и оральный пути введения при помощи соответствующих составов также приемлемы. Однако парентеральное введение, особенно введение в виде липосомного состава, предпочтительно.

Количество светочувствительного соединения, подлежащего введению, зависит от состояния пациента, оценки состояния врачом, стадии состояния, пути введения и, конечно, природы светочувствительного средства. Для типичных светочувствительных агентов производных гематопорфиринового типа, в частности натрий порфимера, диапазоны подходящих доз составляют порядка 0,01-30 мг, предпочтительно 0,1-5 мг на кг веса тела. Для зеленых порфиринов, таких как BPD-MA, диапазоны типичных доз составляют 0,005-5 мг, предпочтительно 0,05-1 миллиграмма на кг веса тела. Эти диапазоны доз типичны и, как полагают, не определяют внешние пределы. Два светочувствительных соединения, представленные в качестве примеров, являются нетоксичными и могут хорошо переноситься субъектами.

Используемый состав может варьироваться с учетом способа приема - для инъекции, типичные препараты содержат физиологический солевой раствор, буферы и другие наполнители. Предпочтительны липосомы и другие липокомплексы. Подходящие составы для приема терапевтических средств, в общем, можно найти в последнем издании Remington"s Pharmaceutical Sciences, Latest edition, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Введение светочувствительного агента можно начинать, как только состояние рассеянного склероза и субъекта будет подтверждено. Обычно, в случае проявления ранних симптомов, таких как покалывание в конечностях, субъекта диагностируют при помощи CAT сканирования и получают подтверждение наличия этого состояния. Можно использовать либо однократное введение, либо многократные введения до конкретного лечения светом. Если используют многократные введения, то интервалы между ними обычно составляют приблизительно 30 минут с тем, чтобы допустить многократные приемы, которые ведут себя, суммарно, как при времени, равном нулю. Однако однократное введение предпочтительно.

Светочувствительному агенту дают возможность распределиться в субъекте. Под "распределением" понимают, что должно пройти достаточно времени для того, чтобы светочувствительный агент уже более не был локализован в месте введения. Поскольку часто будет использоваться трансдермальное освещение, предпочтительно подождать до тех пор, пока светочувствительный агент большей частью не выведется из кожи, но применять светолечение прежде, чем системные уровни светочувствительного соединения будут выведены.

Как объяснено выше, в то время, как первоначально считали, что светочувствительному агенту следует дать возможность очистить нормальную ткань и аккумулироваться в нежелательных клетках или тканях до облучения, теперь установлено, как описано в патентной заявке США N 07/979 546, включенной здесь в качестве ссылки, что более короткие интервалы достаточны для того, чтобы допустить требуемое распределение для осуществления фотодинамической терапии. Так, в настоящей заявке, как ожидают, время, требуемое для распределения светочувствительного агента в субъекте, составляет приблизительно 4-7 часов. В общем, концентрация светочувствительного агента в коже увеличивается на протяжении периода 30 минут-2 1/2 часа и достигает максимума через приблизительно 3 часа. Значительные количества выводятся из системы через 7 часов после введения. Таким образом, идеальное время для облучения светом находится в диапазоне 4-7 часов после введения лекарственного средства.

После того, как распределение произойдет, субъект облучают светом, который включает длины волн, которые поглощаются светочувствительным агентом. Пациента можно подвергнуть трансдермальному облучению. Спектры поглощения светочувствительных агентов должны быть информативными в отношении длин волн, которые используют. Требуемая интенсивность зависит от ширины длинноволновой полосы, но типичные интенсивности имеют порядок 1-500 Дж/см², предпочтительно приблизительно 5-250 Дж/см² и наиболее предпочтительно около 10-50 Дж/см². Облучение продолжают в течение около 2-180 минут, предпочтительно около 15-120 минут, в зависимости от природы и концентрации светочувствительного агента в кровотоке и восприимчивости к обработке.

Обычно субъекты, у которых проявляются признаки рассеянного склероза и другие иммунные дисфункции, могут подвергаться лечению фотодинамической обработкой один раз или несколько раз, которая состоит из введения светочувствительного агента, распределения светочувствительного агента и облучения субъекта. Субъектов контролируют на воздействия фотодинамической терапии по состоянию и повторно подвергают этой терапии, при необходимости. Когда состояние является рассеянным склерозом, такой контроль наиболее удобно осуществлять, используя CAT сканирования.

В качестве альтернативы введению светочувствительного агента системно и обеспечения трансдермального облучения, поток крови пациента можно подвергнуть обработке экстракорпорально. Можно обработать либо цельную кровь, либо подходящую фракцию, например плазму. В таком случае светочувcтвительный агент вводят так, чтобы получить конечную концентрацию в жидкости, подлежащей обработке, соответствующей используемому светочувствительному агенту. Для BPD-MA, например, типичные концентрации составляют около 0,05-5 мкг/мл, предпочтительно около 0,1-1 мкг/мл и наиболее предпочтительно около 0,5 мкг/мл. При таких обстоятельствах не требуется времени для распределения светочувствительного агента. Затем жидкость облучают светом от любого подходящего источника, такого как лазерный диод, светоизлучающий диод, свет лазера, проводимый с помощью волоконной оптики и т.п. Длина волны, как вышеупомянуто, зависит от спектра поглощения светочувствительного агента и интенсивностей света, как описано выше. Обычно облучение продолжают в течение периодов времени, сходных с периодами времени для трансдермального облучения.

Как установлено выше, только релевантная фракция крови нуждается в обработке. Фракционирование может проводиться на любой стадии процесса. Таким образом, светочувствительный агент следует добавлять к цельной крови, затем кровь фракционировать и релевантную фракцию облучать. Альтернативно, кровь сначала следует фракционировать, затем добавить светочувствительное соединение, и эту фракцию обработать светом. Пациенту может быть возвращена либо фракция, либо восстановленная цельная кровь. В общем, подходящая фракция обычно содержит лейкоциты. В типичной процедуре, следовательно, только плазма нуждается в обработке и возвращении.

Таким образом, типичный протокол для лечения субъекта с рассеянным склерозом должен включать следующие стадии: около 35 мг BPD-MA, формулированного в виде липосомного препарата, инъецируют в.в. (внутривенно) субъекту, демонстрирующему симптомы рассеянного склероза. Затем субъекта облучают при одном из двух временах: "раннюю обработку" проводят через примерно от 0,5 до 2,5 часов, и "позднюю обработку" проводят примерно через 5-7 часов после инъекции. Субъект облучают красным светом при длине волны 690 нм 10 нм в течение примерно 30 минут. Для ранней обработки интенсивность составляет около 10-50 Дж/см², более предпочтительно около 15-25 Дж/см², наиболее предпочтительно около 20 Дж/см². Для поздней обработки интенсивность составляет около 150-250 Дж/см², более предпочтительно около 200 Дж/см². Пациента затем контролируют на результаты фотодинамической терапии.

Для лечения ревматоидного артрита подобные параметры являются важными. Модель в примере 2 ниже представляет прогноз поведения ревматоидного артрита у людей. В связи с этим состоянием можно использовать либо системное, либо локализованное лечение. Системное лечение обычно продуктивно при воздействии на болезнь в целом, в то время, как местное лечение суставов направлено на симптомы.

Для системного лечения обычно применяют инъекцию. Инъекция может быть внутримышечной, внутривенной, подкожной, внутрибрюшинной или любым другим признанным путем введения. Можно использовать другой способ системного введения, включая оральный, чрезслизистый и трансдермальный, как описано выше. Для местного введения светочувствительное соединение можно инъецировать направленно в пораженные суставы. Количество светочувствительного соединения, подлежащего введению, зависит от состояния пациента, оценки состояния пациента врачом, стадии состояния, пути введения, и, конечно, природы светочувствительного агента. Для типичных светочувствительных агентов производных гематопорфиринового типа, в частности натрий порфимера, и для представительных зеленых порфиринов, таких как BPD-MA, подходящие диапазоны доз имеют тот же самый порядок, как описано выше для лечения рассеянного склероза. Используемый состав может варьироваться с учетом способа введения - для инъекции, типичные препараты содержат физиологический солевой раствор, буферы, и когда используют инъекцию в качестве пути введения, составы, которые включают липосомы или другие липокомплексы, являются предпочтительными. Подходящие составы для введения этих терапевтических агентов можно найти в последнем издании Remington"s Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Введение светочувствительного агента можно начинать, как только состояние ревматоидного артрита у субъекта будет подтверждено. Как упомянуто выше, можно использовать либо однократное введение, либо многократное введение до конкретной обработки светом. В общем, для системного введения однократное введение светочувствительного агента предпочтительно.

Для местного введения может требоваться многократное введение светочувствительного агента при близких проксимальных временах. Если используют системное введение, светочувствительному агенту дают возможность распределиться в субъекте. Под "распределением" понимают, что должно пройти достаточно времени для того, чтобы светочувствительный агент уже более не был локализонан в месте введения. Как объяснено выше, в то время, как первоначально считали, что светочувствительному агенту следует дать возможность очистить нормальную ткань и аккумулироваться в нежелательных клетках до облучения, теперь установлено, как описано в патентной заявке США N 07/979546, включенной в качестве ссылки, более короткие интервалы достаточны для того, чтобы допустить требуемое распределение для осуществления фотодинамической терапии. Если используют трансдермальное облучение, интервалы времени являются такими, как описано выше для лечения рассеянного склероза. Если используют локализованное облучение непосредственно к суставам, например, с помощью лазера, связанного с волоконной оптикой, вставленный в сустав perse, то необходимо лишь обеспечить светочувствительному агенту время, необходимое для получения достаточной концентрации в суставе. Это составляет обычно более приблизительно 30 минут, хотя другие времена могут быть также использованы. Если используют местное применение светочувствительного агента, то, конечно, свет может быть применен почти сразу.

Как описано выше для лечения рассеянного склероза, можно использовать экстракорпоральную обработку потока крови. Условия, описанные выше, применимы и здесь.

В соответствующее время, после завершения распределения, субъект подвергают облучению светом, который включает длины волн, которые поглощаются светочувствительным средством. Спектры поглощения светочувствительных агентов должны быть информативны по отношению к используемым длинам волн. Для трансдермального облучения применяют описанные выше интенсивность и период времени облучения. Для локализованного облучения суставов облучение может быть либо трансдермальным в случае заболевания меньших суставов, либо его можно проводить инвазивно, используя волоконную оптику, в случае заболевания более крупных суставов. Интенсивности и времена аналогичны тем, которые используют в случае трансдермального облучения.

Для экстракорпоральной обработки используют параметры, такие, как описаны для рассеянного склероза.

Таким образом, типичный протокол для лечения субъекта, страдающего ревматоидным артритом, должен включать следующие стадии: около 3 мг BPD-MA, формулированного в липосомном составе, инъецируют непосредственно в сустав субъекта, у которого проявляются симптомы ревматоидного артрита. Сразу после этого сустав подвергают облучению светом 690 нм 10 нм при 25 Дж/см² в течение приблизительно 15 мин. После чего пациента контролируют на результаты фотодинамической терапии.

Нижеследующие примеры, как полагают, иллюстрируют, но не ограничивают данное изобретение.

Пример 1

Реакция различных лейкоцитов на ПВП (PBD) и облучение

Кровь отбирают у двух пациентов, которые, как было показано, инфицированы ВИЧ. Цельную кровь от каждого пациента доводят до различных уровней концентраций BPD-MA и затем облучают светом при 10,8 Дж/см², используя 690 нм свет, испускаемый светодиодами (LEDS) на протяжении четырехминутного интервала времени. Популяции различных субтипов Т-клеток оценивают проточной цитометрией по сравнению с необработанными контролями. Процент присутствующих клеток оценивают как процент от контроля и затем наносят на график как функцию от BPD-MA концентрации.

Полученные результаты представлены на фиг. 1A и 1B.

Как показано, большая часть клеточных популяций осталась относительно постоянной, включая B-клетки и CD4⁺ клетки. Небольшие уменьшения обнаружены в CD8⁺ клетках и DR⁺ клетках. Обнаружено резкое уменьшение IL-2R⁺ клеток для пациента, результаты которого представлены графиком на фиг. 1A, и это уменьшение зависело от дозы используемого BPD-MA, как следует из фиг. 1A, хотя содержание IL-2R⁺ клеток драматически понизилось, значительные уменьшения также наблюдались для CD8⁺ клеток и DR⁺ клеток. Для второго пациента (фиг. 1B) обнаружено более резкое действие на DR⁺ клетки.

Подобные исследования проводят при постоянной концентрации BPD-МА (0,5 мкг/мл), используя в качестве субъектов одного нормального индивидуума и двух пациентов с ВИЧ. Фиг. 2 показывает субпопуляции лейкоцитов в необработанной крови, полученной от этих трех доноров. Как следует из фиг. 2, B-клетки и природные клетки-киллеры присутствуют при приблизительно тех же самых уровнях у нормального и ВИЧ субъектов. Однако ARC пациенты последовательно демонстрируют пониженные уровни CD4⁺ и повышенные уровни CD8⁺, DR⁺ и IL-2R⁺.

На фиг. 3A, 3B и 3C показано действие лечения данного изобретения. Как показано на фиг. 3A, обработка субпопуляций лейкоцитов в нормальной крови имеет незначительное действие на любую из представленных популяций. Фиг. 3B показывает, что, когда ВИЧ-инфицированную кровь подвергают воздействию этого лечения, то имеется небольшое уменьшение в CD8⁺, небольшое уменьшение в DR⁺ и значительное уменьшение в IL-2R⁺ клетках. Фиг. 3C показывает эти результаты конкретно для IL-2R⁺ клеток, как для нормальных субъектов, так и для двух ВИЧ-инфицированных субъектов. Снова наблюдается резкое уменьшение.

Таким образом, после лечения при помощи 0,5 мкг/мл ПБП (BPD) в течение четырех минут в присутствии 10,8 Дж/см² света с максимумом при 690 нм, клеточные популяции из всех клеточных типов у нормального пациента, и все клеточные типы, кроме IL-2R⁺ у ВИЧ субъектов, остаются относительно постоянными. Уровни DR⁺ и CD8⁺ клеток слегка понижены. По-видимому, ПБП (BPD) свет обработка имеет слабое действие или не оказывает никакого действия на большинство субклассов лейкоцитов. Однако повышенные уровни IL-2R⁺ клеток восстанавливаются до нормального.

Пример 2

Цельную человеческую кровь от ВИЧ пациента также подвергают обработке, используя различные концентрации ПБП (BPD) и различные интенсивности света, по протоколу, аналогичному протоколу, изложенному в примере 1. Испытывают действие на инактивацию клетки, ассоциируемой с ВИЧ. Полученные результаты представлены на фиг. 4. Как показано, интенсивности 13 Дж/см² приводят к драматической инактивации вируса при концентрациях ПБП (BPD) около 0,5 мкг/мл или меньше. Более низкие интенсивности облучения требуют более высоких концентраций ПБП (BPD) для инактивации вируса полностью.

Пример 3

Испытывают также способность инактивировать свободный ВИЧ (LAV-I штамм) в тканевой культуре CEM клеток. В этом анализе, LAV-штамм разбавляют в среде тканевой культуры, и добавляют ПБП (BPD) при концентрации либо 0,25 мкг/мл, либо 0,5 мкг/мл. Среды инкубируют в течение одного часа и подвергают трехминутному действию облучения с максимумом при 690 нм и при интенсивности 10,8 Дж/мин². Затем среды добавляют к CEM клеткам, и клетки анализируют, используя стандартную р24 пробу, после шести дней культивирования. Результаты считывают в терминах пг/мл.

Полученные результаты суммированы в таблице. Как показано, при разбавлениях LAV, которые обеспечивают высокие уровни р24, обработка ПБП (BPD) при концентрациях ПБП (BPD)) либо 0,25 мкг/мл, либо 0,5 мкг/мл способна существенно понизить определяемый уровень р24.

Пример 4

Лечение экспериментального аллергического энцефаломиелита

Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ) обычно признан как эффективная модель для MS. См., например, Steinman, L. Springer Seminars Immunopathhol (1992), 14: 79-93. У мышей его вызывают инъекцией миелинового основного белка (MBP), и он опосредован МБР-специфическими Т-клетками, которые прикрепляются к миелиновой оболочке центральной нервной системы, пропитывают область и вызывают прогрессивный паралич задних конечностей (Bernard, C. C.A. et al. J. Immunol (1975) 114:1537. Настоящие изобретатели разработали усовершенствование этой модели, при помощи которой MBP-праймированные спленоциты или лимфоциты от PL мышей, штамм, который обеспечивает моноклональный ответ на MPB, культивируют in vitro с MBP и IL-2 и затем переносят незараженным реципиентам. Перенос этих культивированных клеток вызывает болезнь у 100% реципиентов почти синхронным образом.

В предварительном исследовании клетки, подлежащие переносу, инкубируют со 100 нг/мл ПБП (BPD) вертепорфина в течение 60 минут в темноте, промывают и повторно суспендируют в 200 мкл среды, содержащей 5% FCS. Пятьдесят мкл 40 мкг/мл ПБП(BPD) в липосомном препарате добавляют к клеткам и смесь инъецируют в.в. (внутривенно) незараженным PL реципиентам. Животных подвергают трансдермальному облучению, используя бокс, содержащий светоизлучающие диоды с узким спектром (690 нм 10 нм) в течение 20 минут (15 Дж/см²)

Фиг. 7 показывает, что у животных, инъецированных клетками, обработанными ПБП (BPD), не развивается ЕАЕ, в то время как у контрольных, получивших клетки, действительно получило развитие это состояние.

В дополнительном ряде экспериментов мышам, которых инъецировали вышеописанными культивированными лимфоцитами, вводят 1 мг/кг ПБП (BPD) в липосомном составе сразу после инъекции лимфоцитов. Обработанных мышей помещают в темноту в течение 60 минут до экспозиции светом, как описано выше. Протокол фотодинамического лечения (т. е. инъекция BPD-MA с последующим, спустя 60 минут, воздействием света) применяют на отдельных экспериментальных группах, в различные времена после инъекции культивированных лимфоцитов. Результаты на фиг. 8 показывают, что применение фотодинамической обработки (ФДО) в течение 24 часов задерживает наступление ЕАЕ с дня 21 до дня 41. Однако отложенная на 48 часов обработка не приводит к эффективному лечению.

В дополнительном эксперименте ФДО применяют к животным за 24 часа до того, как лимфоидные клетки инъецируют. Этот протокол также продуктивен в отношении ЕАЕ.

Пример 5

Лечение коллаген-индуцированного артрита

Коллаген-индуцированный артрит представляет общеизвестную экспериментальную модель для изучения ревматоидного артрита.

КИА (CIA) индуцируют у DBA/1 мышей при помощи подкожной инъекции бычьего коллагена типа 11. В настоящей модели применяют две инъекции коллагена, первая на день 0 и вторая на день 21 (Trenham, D.E. et al. J.Exp.Med. (1977) 146: 857; Courtenay, J.S. et al. Nature (1980) 283:665).

По одной ФДО (PDT) схеме мышей инъецируют 1 мг/кг липосомного ПБП (BDP) в. в. (внутривенно) на дни 5 и 12, выдерживают в темноте в течение 60 минут после инъекции и затем подвергают трансдермальной обработке светом в боксе, в котором обеспечивается узкое облучение с помощью светоизлучающих диодов с узким спектром (690 нм 10 нм) в течение 20 минут (15 Дж/см²). Как следует из фиг. 9, мыши, подвергнутые фотодинамическому лечению, демонстрируют существенно более низкую заболеваемость КИА (CIA), чем контрольные мыши.

По второй схеме вышеупомянутую ФД обработку проводят, как описано выше, на дни 24 и 28; как следует из фиг. 10, у обработанных мышей начало заболевания существенно запаздывает.