способ диагностики характера течения рассеянного склероза

Формула изобретения

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХАРАКТЕРА ТЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА путем исследования крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, определяют активность Na⁺K⁺ АТ фазы эритроцитов в интервале от 5 10^-5 до 8 10^-4 МАТФ при температуре 35^oС, рассчитывают константу Михаэлиса и при значениях 1,07 10^-5 4,53 10^-7 МАТФ диагностируют стадию обострения, а при 0,83 10^-5 3,57 10^-7 МАТФ стадию ремиссии рассеянного склероза.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к физико-химическим методам диагностики рассеянного склероза (РС).

Клиническая диагностика рассеянного склероза нередко представляет большие трудности в связи с отсутствием патогномоничных признаков болезни. На современном уровне знаний только клинические данные положены в основу как классификации этого заболевания, так и определения его течения, степени активности процесса.

Известны единичные сообщения о прогностическом значении некоторых иммуно-генетических и биохимических показателей в прогнозе степени доброкачественности процесса.

I. Изучение распределения антигенов гистосовместимости HLA у больных РС с различными типами выявило, что при относительно доброкачественном течении определяются чаще антигены А2, а при неуклонно прогрессирующем антигены В₁₂ и А3. Однако признается неоднозначность этих данных.

II. Анализ клеточного иммунитета выявил у больных в состоянии ремиссии высокую функциональную активность Т-лимфоцитов. При прогрессировании процесса или острой атаке нормальное содержание Т-лимфоцитов со сниженной функциональной активностью. Напротив, популяция В-лимфоцитов увеличивается при активных стадиях процесса, оставаясь интактной во время ремиссии и доброкачественных типах течения. Однако отсутствие конкретного понимания в отношении роли иммунопатологических реакций в развитии деструкции миелина, ведет к нечеткости критериев активности РС и ни один из них не может быть основным лабораторным тестом диагностики.

III. Некоторое значение в диагностике типов течения может иметь определение эндорфинов, выполняющих роль нейтромодуляторов и нейтромедиаторов. Установлено повышение концентрации эндорцинов в цереброспинальной жидкости при активизации ими при неуклонно прогредиентном течение 65,730 пМ/л и снижение до 22,56.9 пМ/л при ремиссии.

Однако средние показатели - эндорфина у больных РС существенно не отличаются от группы контроля (доноры) соответственно 5018,6 и 63,919,8 пМ/л. Метод определения эндорфинов трудоемок, требует использования радиоиммуноанализа и набора дефицитных специфических антисывороток.

IV. Ряд работ

(Дзюба А. Н. Роль формальдегида и его метаболических предшественников в патогенезе РС и идиопатического ретробульбарного неврита. Автореф. дисс. к. м.н. Мосева, 1987) посвящен роли формальдегида и его метаболических предшественников в определении степени активности РС. Выявлена корреляция между клиническим течением и содержанием формальдегида. При обострении содержание формальдегида:

в спино-мозговой жидкости (СМЖ) 0,180,0142 мМ/л,

в сыворотке крови 0,2720,0148 мМ/л. Относительная погрешность 5,44%

При ремиссии снижение:

в СМЖ 0,11120,0111 мМ/л,

в сыворотке крови 0,12720,0083 мМ/л. Относительная погрешность 6,52%

В отношении N-метиламинокислот закономерностей не выявлено. Однако авторы не могут рекомендовать широкого практического использования этого метода в диагностике РС, так как он требует трудоемкой высокотемпературной перегонки и использования специфического реактива.

V. Несомненно, определенное прогностическое значение в выявлении обострения или ремиссии процесса может иметь активность протеолитического фермента лейцинаминопептидазы (ЛАП) маркера миелина.

(Хохлов А.П. Завалишин И.А. Захарова М.Н. и др. авторское свидетельство 1259191, 1985). Однако последние данные по изучению этого фермента показали, что необходимо дифференцировать связанную (с ингибитором) и свободную изоформу фермента для определения активности процесса и степени деструкции миелина

(Хохлов А.П. Баскаева Т.С. Хрусталева Н.А. и др. 1987).

Установлено, что при обострении и в начале заболевания показателем активности является связанная форма ЛАП, выявляющая тяжести демиелинизирующего процесса, при котором ингибитор выходит в ликвор и кровь с ферментом, а в ткани, лишенной ингибитора, ЛАП активируется и гидролизует белковый каркас миелина. Повышение же в крови и СМЖ свободной формы ЛАП у больных во время ремиссии, а также с небольшим неврологическим дефицитом, обусловлено выходом дополнительного количества фермента, но без ингибитора. В этих условиях интенсивность процесса протеолиза и деструкции миелинового каркаса может уменьшаться.

Итак, при обострении процесса, уровень связанной ЛАП:

в сыворотке крови 28,81,28 ед/л

(относительная погрешность 4,44%),

у СМЖ 99,45,07 ед/л

(труднодоступный материал), уровень свободной ЛАП:

в сыворотке 3,30,46 ед/л

(относительная погрешность 13,94%),

в СМЖ 0,40,09 ед/л

Во время ремиссии уровень связанной формы существенно снижается:

в сыворотке крови 17,32,7 ед/л

(относительная погрешность 15,61%),

в СМЖ 70,58,3 ед/л, уровень свободной ЛАП увеличивается:

в сыворотке 4,30,81

(относительная погрешность 18,84%),

в СМЖ 70,58,3 ед/л.

Повышенные цифры связанной ЛАП манифестируют и неуклонно прогредиентное течение РС:

в сыворотке крови 24,42,3 ед/л,

в СМЖ 73,56,4 ед/л.

Несомненно, что большая часть ЛАП находится в биохимических жидкостях в связанном состоянии и отделение ее от связующего агента сопряжено с техническими трудностями и удлиняет процесс по времени (фильтрация через колонку с сефадексом G-75 с последующим выдерживанием колонки в течение 3-4 сут при Т 0-4^оС).

Целью изобретения является повышение достоверности и упрощение способа прогноза клинического течения рассеянного склероза обострение ремиссия).

Поставленная цель достигается тем, что определяют активность Na⁺, K⁺, АТ-фазы в цельных клетках (эритроцитах) в зависимости от концентрации АТФ при температуре 35^оС и прогнозируют при значениях константы Михаэлиса (КМ) 1,07 х 10^-54,55 х x10^-7 М АТМ обострение, а при К_м 0,83 х x10^-53,57 х 10^-7 М АТФ ремиссию.

Относительная ошибка определения К_м 4,5%

Способ определения активности Na⁺, K⁺АТФазы осуществляют по заявке N 4376200/14 (024021), приоритет от 12.02.88 г. Производится забор крови в объеме 0,2 мл в фосфатный буфер (18 мл). Отмываются эритроциты от плазмы также в фосфатном буфере по методике Доджа (Dodge I.T. et al Arch. Biochem. Bioph. 1963, v. 100, р. 119-130). Затем 0,1 мл концентрированной взвеси эритроцитов разбавляют фосфатным буфером до оптической плотности 0,25 нм при длине волны ФЭ Ка = 600 нм. Далее 1 мл этой взвеси разбавляют тем же фосфатным буфером в соотношении 1:2 и добавляют раствор АТФ из расчета 0,2 мл определенного разведения в каждую пробирку: 8 х 10^-4, 4 х 10^-4, 2 х 10^-4, 5 х 10^-5 М/л АТФ. Таким образом, в каждой пробирке концентрация АТФ в итоге уменьшалась в 16 раз.

Параллельно готовились 7 контрольных пробирок (без эритроцитарной взвеси), в которых содержится 3 мл фосфатного буфера и 0,2 мл соответствующих разведений АТФ.

Инкубируют серию полученных разведений АТФ со взвесью эритроцитов в ультратермостате при Т 35^оС в течение 15 минут. Затем охлаждают пробирки до 22^оС и заливают в кювету "опыт" интерферометра, а в контрольную кювету заливают контроль, приготовленный как указано выше. После пятиминутной инкубации в ИТР-1 производят измерение изменения коэффициента преломления ( n) содержимого каждой пробирки с помощью микрометронного механизма прибора относительно контроля. Начинают измерения с минимальной концентрации АТФ во взвеси.

Полученные зависимости n (C) имеют различия как по абсолютной величине изменения n, так и по углу наклона. Значение К_м определяется как величина С_АТФ, соответствующая n_max/2 по оси ординат.

П р и м е р 1. Больная К, 34 лет, инвалид II группы, страдает рассеянным склерозом, церебро-спинальной формой с 1977 г. Дебют заболевания сопровождался выраженной мозжечковой атаксией, глазодвигательными нарушениями, которые полностью регрессировали через 3 месяца. С 1978 г. по 1983 г. наблюдались частые обострения (3-4 раза в год) с различными неврологическими проявлениями (зрительными, глазодвигательными, бульбарными, мозжечковыми, психическими, спинальными). Каждое обострение, продолжающееся 2-3 месяца, купировалось с наступлением полной клинической ремиссии. С 1983 г. обострения редкие (1 раз в год), сопровождаются негрубым и недолго существующим дефицитом неврологических функций, однако, при этом неуклонно прогрессирует дефект высшей нервной деятельности (по типу органического слабоумия).

В настоящее время (июнь 1988 г.) в неврологическом статусе ее определяется легкая рассеянная микросимптоматика.

На протяжении последних лет больной многократно проводилось определение активности Na⁺, K⁺, АТФазы эритроцитов в периоды клинических обострений и ремиссий. Определение активности указанного фермента проводилось в строгом соответствии с приведенным выше описанием, без каких-либо отклонений и отличий.

Май 1985 г. обострение в виде левостороннего силового спастического гемипареза. Активность Na⁺, K⁺ АТФазы эритроцитов при 35^оС К_м 1,16510^-5 М АТФ.

Июль 1985 г. ремиссия (полный регресс пирамидной симптоматики", активность Na⁺, K⁺ АТФазы эритроцитов К_м0,730710^-5 А АТФ.

Март 1986 г. обострение (мозжечковая атаксия), активность Na⁺, K⁺ АТФ-фазы К_м 1,11110^-5 М АТФ.

Апрель 1986 г. К_м 0,730710^-5 М АТФ, регресс мозжечковых расстройств.

П р и м е р 2. Больная Г. 31 год. рабочая, с 25 лет страдает рассеянным склерозом, церебро-спинальной формой, течение ремиттирующее. До настоящего времени перенесла 3 клинических обострения с практически полным последующим восстановлением неврологических функций и сохранением трудоспособности. Доставлена "Скорой помощью" с работы, где внезапно развилась слабость в ногах и шаткость.

В неврологическом статусе: горизонтальный среднеразмашистый нистагм, нижний парапарез со снижением силы до 3-х баллов, пирамидный гипертонус, высокие сухожильные рефлексы с рук и ног, брюшные рефлексы утрачены, патологические стопные знаки с 2-х сторон, дисметрия, интенция слева.

В течение следующей недели ухудшение состояния, выражающееся в нарастании слабости в ногах до 1-2 баллов. В это время проведено исследование активности Na⁺, K⁺ АТФазы, К_м 1,132 10^-5 М АТФ. С 9-го дня от начала заболевания наблюдался быстрый регресс мозжечковых и пирамидных симптомов. Во время практически полного регресса неврологических проявлений произведено повторное исследование активности Na⁺, K⁺ АТФазы. Однако цифры К_м 1,111710^-5 М АТФ остались практически столь же высокими, как и на высоте клинической картины. Это было расценено как предвестник нового обострения.

Действительно, через 2 дня после последнего биохимического исследования состояние больной вновь ухудшается: не может ходить без посторонней помощи из-за грубой мозжечковой атаксии, выражено интенция при выполнении координаторных проб, дисметрия, адиадохокинез. Нарастание пирамидной симптоматики не определялось. Проведенные исследования АТФ-азной активности в момент нарастания мозжечковых симптомов выявили некоторую тенденцию к снижению АТФазной активности: К_м 1,0710^-5 М АТФ.

Вскоре начался регресс мозжечковых нарушений, и на фоне полной клинической ремиссии показатели активности Na⁺, K⁺ АТФазы существенно снизились: К_м 0,8310^-5 М АТФ.

Все манипуляции по осуществлению способа определения АТФазной активности производилось в соответствии с приведенным выше описанием, без каких-либо отклонений и отличий.

В данном случае выявлено существенное отличие активности Na⁺, K⁺ АТФазы эритроцитов при ремиссии и обострении РС, как и в предыдущем примере. При этом сохранение высоких значений К_м на фоне первого регресса клинической симптоматики свидетельствовало о новом клиническом обострении, которое и развивалось через 2 дня.

Значительное же снижение ферментативной активности до 0,83 х 10^-5 М АТФ манифестировало начало стойкой клинической ремиссии.

Заключение.

Таким образом, рассмотрев ряд аналогичных случаев, мы убедились, что максимальная активность Na⁺, K⁺ АТФазы эритроцитов при 35^оС характерна для обострения РС (К_м 1,11710^-5 4,4410^-7 М АТФ), в то время как при ремиссии активность фермента снижается /К_м0,653210^-5 4,010^-7 М АТФ).

Предлагаемый способ позволяет с достоверностью Р 95% прогнозировать наступление клинического обострения или ремиссии рассеянного склероза, что важно для коррекции терапии.