способ профилактики ишемии сетчатки эритропоэтином в эксперименте

Формула изобретения

Способ профилактики ишемии сетчатки эритропоэтином в эксперименте, включающий моделирование патологии сетчатки и профилактика ее введением лабораторному животному рекомбинантного эритропоэтина, отличающийся тем, что рекомбинантный эритропоэтин вводят в качестве прекондиционирующего агента однократно в 1-й день эксперимента внутрибрюшинно в дозе 50 МЕ/кг, за 30 минут до моделирования патологии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и офтальмологии.

По известным литературным источникам - ишемия сетчатки является ведущим звеном в патогенезе ряда сосудистых заболеваний глазного дна (Нероев В.В. Ишемия сетчатки и оксид азота // Вестник Российской Академии медицинских наук. - 2003. № 5. - С.37-40). Профилактику и коррекцию ишемии сетчатки теоретически возможно осуществить с помощью фармакологического прекондиционирования, суть которого состоит в активации эндогенных защитных механизмов, снижающих степень повреждения при последующем длительном ишемическом эпизоде (Колесник И.М. Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином - новые возможности оптимизации выживаемости ишемизированных тканей // Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". - 2010. № 3. - С.32-36). Наиболее перспективным для изучения прекондиционирующего действия на сетчатке является эритропоэтин. Рекомбинантный эритропоэтин в субэритростимулирующей дозе обладает выраженным цитопротекторным эффектом на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке (Колесник И.М. Влияние дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тканей и неоваскулогенез (экспериментальное исследование) [Текст]: автореф. дис канд. мед. наук: 14.03.06, 14.01.17 / И.М. Колесник; Курск, гос. мед. ун-т. - Курск, 2010. - С.19).

Известен способ коррекции диборнолом острой ишемической ретинопатии в эксперименте (Цой Ю.Р. Влияние диборнола на морфофункциональное строение сетчатки крыс при моделировании тотальной транзиторной ишемии головного мозга // Всероссийская 69-я итоговая научная студенческая конференция, посвященная 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова (Томск, 11-13 мая 2010 г.): сборник статей / под ред. В.В. Новицкого, Л.М. Огородовой. - Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2010. - С.376-378), который характеризуется тем, что эксперименты проведены на 30 белых половозрелых крысах-самках линии Wistar массой 230-250 г. Животные были разделены на 3 группы. Крысам первой группы (n=10) воспроизводили тотальную транзиторную ишемию головного мозга (ИГМ) по методу W.A. Pulsineli. За 1 сутки до моделирования тотальной транзиторной ИГМ у наркотизированных крыс (этаминал-натрий 60 мг/кг) производили термокоагуляцию обеих вертебральных артерий на уровне первого шейного позвонка. ИГМ воспроизводили под эфирным наркозом путем пережатия общих сонных артерий в течение 30 мин. Состоятельность модели оценивали по побледнению видимой части сосудистой оболочки глаза, расширению зрачков, развитию гипервентиляции. Реперфузию проводили снятием окклюдеров, после чего рану ушивали. Крысам второй группы (n=10) вводили диборнол в дозе 100 мг/кг в 1 мл крахмальной слизи один раз в сутки в течение 7 дней. Контрольная группа (n=10) - интактные животные, содержавшиеся в идентичных с экспериментальными условиях вивария. Материалом исследования служили сетчатки крыс, изъятые после их умерщвления.

Основным недостатком способа является то, что модель тотальной транзиторной ишемии головного мозга не является специфичной для исследования коррекции острой ишемической ретинопатии, так как помимо сетчатки ишемии подвергаются головной мозг, мягкие ткани головы, что приводит к развитию массивного постреперфузионного повреждения тканей и органов с возможностью развития краш-синдрома. Помимо этого использование данной модели не исключает наличия коллатерального кровообращения между бассейном общей сонной и подключичной артерий.

Наиболее близким к заявленному решению является Способ профилактики ишемии сетчатки в эксперименте путем предварительного введения эритропоэтина в качестве защищающего сетчатку агента (MOWAT, F.M. Endogenous erythropoietin protects neuroretinal function in ischemic retinopathy / F.M. Mowat, F. Gonzalez, U.F. Luhmann et. al. // Am J Pathol. - 2012/ - Apr. № 180(4). - P/1726-1739).

Основным недостатком способа является то, что введение рекомбинантного эритропоэтина проводят внутрибрюшинно, начиная с 14 дня постнатального развития и заканчивая 25 днем дозой 5000 ЕД/кг, что ведет к изменению гематокрита и ангиогенезу.

Задачей предлагаемого изобретения является способ профилактики ишемии сетчатки эритропоэтином в эксперименте, включающий рекомбинантный эритропоэтин в качестве прекондиционирующего агента.

Задача достигается тем, что в способе, включающем моделирование патологии сетчатки путем оказания механического давления (110 мм рт.ст.) на переднюю камеру глаза в течение 30 минут и профилактику ее введением лабораторному животному рекомбинантного эритропоэтина, причем рекомбинантный эритропоэтин вводят в качестве прекондиционирующего агента однократно в 1-й день эксперимента внутрибрюшинно в дозе 50 МЕ/кг за 30 минут до моделирования патологии.

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что:

- в качестве прекондиционирующего агента вводят однократно в 1-й день эксперимента внутрибрюшинно рекомбинантный эритропоэтин в субэритростимулирующей дозе (50 МЕ/кг массы тела животного), за счет этого через 30 мин (первое защитное окно) после введения открываются АТФ-зависимые К+-каналы, что в последующем приводит к повышению резистентности тканей сетчатки, через 12-48 ч после введения рекомбинантного эритропоэтина открывается 2 защитное окно, в котором эффект прекондиционирования реализуется в основном за счет действия оксида азота (NO) и дальнейшего включения механизмов метаболической адаптации. Кроме того, эритропоэтин в субэритростимулирующей дозе (50 МЕ/кг массы тела животного) вводят однократно, в результате чего показатели микроциркуляции в ишемизированной сетчатке улучшаются не за счет образования новых капилляров, а прекондиционирующего действия.

Способ приводит к выраженной коррекции ишемии сетчатки, так как рекомбинантный эритропоэтин в данной дозе открывает АТФ-зависимые К+-каналы и в дальнейшем индуцирует механизмы метаболической адаптации, за счет чего реализуется эффект прекондиционирования.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Опыты проведены на 40 белых лабораторных крысах обоих полов массой 180-220 г. Каждая группа включала 10 крыс. Первая группа - группа интактных животных, вторая группа - с ишемией сетчатки (контроль), третья группа - с дистантным ишемическим прекондиционированием (ДИП); четвертая группа - с фармакологическим прекондиционированием рекомбинантным эритропоэтином в дозе 50 МЕ/кг массы тела животного.

Моделирование ишемии сетчатки производили путем оказания механического давления (110 мм рт.ст.) на переднюю камеру глаза в течение 30 минут в 1-й день эксперимента. Подтверждением формирования ишемии служило отсутствие глазного кровотока (побеление глаза лабораторного животного).

В третьей группе животных ДИП проводили в 1 день эксперимента 10-минутным пережатием бедренной артерии за 40 мин до моделирования ишемии сетчатки, после чего следовал 30-минутный эпизод реперфузии. ДИП проводили путем наложения жгута на проксимальную треть бедра. Контролем правильности наложения жгута служило отсутствие пульса на артерии голени.

В четвертой группе животных за 30 мин до моделирования патологии вводили рекомбинантный эритропоэтин («Эпокрин» эпоэтин альфа; ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых препаратов» Федерального медико-биологического агентства г. Санкт-Петербург, Россия) внутрибрюшинно в дозе 50 МЕ/кг однократно. За 15 мин до моделирования ишемии осуществляли наркотизацию внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг массы тела животного.

О выраженности противоишемического эффекта судили по уровню микроциркуляции в сетчатке крыс при помощи лазер-Доплер флоуметра Biopac-systems MP-150 и датчика игольчатого типа TSD-144 (США) на 72 час реперфузии после моделирования патологии. Для этого под наркозом животное фиксировали и производили регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке в десяти точках по окружности склеры.

При статистической обработке данных рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считаются достоверными при р<0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Оценку микроциркуляции проводили при помощи лазер-Доплер флоуметра Biopac-systems MP-150 и датчика TSD-144 (США). Для этого под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг массы тела животного, внутрибрюшинно) животное фиксировали и производили регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке в десяти точках по окружности склеры с шагом 1 мм. Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 20 секунд в каждой точке. Из полученных десяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке у данного животного. Из 10 полученных значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке в данной группе животных.

Результаты оценки уровня микроциркуляции в сетчатке крыс на 72 час реперфузии после моделирования ишемии сетчатки и ее коррекции рекомбинантным эритропоэтином в дозе 50 МЕ/кг представлены в таблице.

Таблица
Результаты оценки уровня микроциркуляции в сетчатке крыс на 72 час реперфузии (М±m), п.е. (перфузионные единицы)
Интактные (n=10)	743,9±5,0
Ишемия сетчатки (n=10)	353,3±11,7*
Коррекция ДИП (n=10)	638,5±15,8**
Коррекция эритропоэтином, 50 МЕ/кг (n=10)	724,0±4,1**
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - p<0,05 в сравнении с группой животных с ишемией сетчатки

Уровень микроциркуляции в сетчатке интактных крыс составил 743,9±5,0 п.е. (перфузионных единиц). Уровень микроциркуляции после моделирования ишемии в группе контроля составил на 72 ч реперфузии 353,3±11,7 п.е., что достоверно ниже значения в группе интактных животных (р<0,001). На фоне коррекции патологии ДИП уровень микроциркуляции в сетчатке на 72 ч реперфузии достоверно возрастает до 638,5±15,8 п.е. (р<0,001) по сравнению с группой контроля. При коррекции ишемии сетчатки эритропоэтином уровень микроциркуляции в группе возрастает до 724,0±4,1 п.е. и достоверно отличается от значений в группе контроля (р<0,001).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженной коррекции ишемических повреждений глаза в условиях модели ишемии сетчатки крыс рекомбинантным эритропоэтином в дозе 50 МЕ/кг массы тела животного при однократном системном введении.