ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

способ элюции патогена с иммобилизованной магнитной матрицы

Классы МПК:G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого
G01N33/569 микроорганизмов, например протозоа, бактерий, вирусов
Автор(ы):, , , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-07-10
публикация патента:

Изобретение относится к медицине, в частности к элюированию сконцентрированного на магнитной матрице патогена. Способ элюции осуществляется следующим образом: 0,1 мл 10% взвеси магнитно-иммунного сорбента (МИС) туляремийного, чумного или бруцеллезного инкубируют с микробными взвесями возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку реакции непрямой гемагглютинации или реакции агглютинации латекса. Технический результат: способ позволяет качественно элюировать патоген с магнитной иммобилизованной матрицы для последующего исследования в серологических реакциях и сохранять функциональную активность антитела на магнитной матрице для повторного использования. 3 пр., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для элюирования сконцентрированного на магнитной матрице патогена из объектов окружающей среды с последующим его исследованием серологическими методами: реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции агглютинации латекса (РАЛ).

Существуют разнообразные способы элюции микробных клеток с иммобилизованной матрицы. Например, использование буфера DETAC HaBEAD® и наборов CELLection. DETACHaBEAD® - буфер, содержащий поликлональные антитела, специфичные к Fab-фрагментам моноклональных антител, конъюгированных на Dynabeads (http://www.biochemmack.ru/product/magnetic/micro/). После инкубации с буфером DETACHaBEAD® частицы оказываются связанными с поликлональными антителами, а клетки высвобождаются. Они остаются жизнеспособными и экспрессия поверхностных маркеров не нарушается. Набор CELLection включает CELLection Dynabeads®, имеющие специфические антитела, конъюгированные с микрочастицами через нуклеиновую кислоту, и ферментативный буфер, расщепляющий ДНК-мостик. Использование набора CELLection позволяет удалить микрочастицы. Целевые клетки, выделенные с помощью набора CELLection, пригодны для цитометрического анализа и культивирования. Но данные элюирующие растворы подходят только для частиц, выпускаемых компанией Invitrogen (Dynal) (Норвегия).

Известен способ элюции, предложенный Матвеевой И.Н. с соавт. (2010). Разработчики данного способа рекомендуют использовать в качестве элюирующего буфера 0,1 М глицин HCl, pH 2,4 с последующей немедленной нейтрализацией 1 М раствором NaOH. Данный способ подходит только для хроматографического метода элюирования специфических антител с колонки с иммуносорбентом.

Для элюции белков-мишеней с микрочастиц могут быть использованы мягкие методы элюции. Так, белки можно элюировать буферами с низкими pH, такими как 0,12 М цитрат натрия (pH 2-3) в течение 2-х мин. Это обеспечит целостность белка при возвращении к физиологическим значениям pH. Ионная сила (концентрация солей), выбор элюирующего раствора и pH буфера для лизиса могут сильно повлиять на целостность антигена-мишени. Главную роль играет выбор элюента. Он зависит от многих факторов, таких как локализация активных центров антигена, необходимость сохранить ассоциацию субъединиц и другие белок-белковые взаимодействия. Так, например, буферы со слегка щелочным pH и низкой ионной силой обычно способствуют солюбилизации белков, а высокие концентрации солей и низкий pH могут вызвать денатурацию антигена и выпадение его в осадок из раствора. Неионные детергенты (например, Твин, Тритон Х-100, NP-40) обычно сохраняют нековалентные белок-белковые взаимодействия, а ионные детергенты (например, SDS или дезоксихолат натрия) обычно имеют денатурирующий эффект на белок-белковые взаимодействия и могут также повлиять на способность антител распознавать белок-мишень.

Для сохранения целостности антигена при подборе элюирующих растворов и условий элюции необходимо исследовать и оптимизировать большое количество параметров: состав и свойства самой матрицы, pH, молярность, объем элюирующих растворов, температурные и временные параметры инкубации.

Цель изобретения - разработать способ элюции патогена после его селективного концентрирования на магноиммуносорбенте (МИС) для последующего исследования серологическими методами и возможности повторного применения МИС (с сохранением его функциональной активности).

Первоначально была применена элюция раствором свободного лиганда с такой же степенью сродства к веществу, как у лиганда на сорбенте. Данная элюция может быть успешно осуществлена за счет многократного превышения концентрации свободного лиганда по сравнению с иммобилизованным. Для элюции использовались иммуноглобулины, выделенные из гипериммунных туляремийных, бруцеллезных и чумных сывороток, но в концентрации, в два раза превышающей концентрацию иммуноглобулинов, используемую для иммобилизации магнитной матрицы. В результате получен положительный эффект, но метод конкурентной элюции дорог, поскольку он связан со значительным расходом очищенного биологического препарата иммуноглобулинов.

Для реализации эксперимента применяли различные группы элюирующих реагентов (ферменты, детергенты, кислоты, щелочи, буферные растворы и прочие компоненты), отобрав те из них, которые отвечали определенным исследователями требованиям:

- отсутствие ложноположительных реакций с самим элюирующим реагентом;

- качественная элюция (максимальная чувствительность РНГА с элюированным патогеном);

- возможность многократного использования МИС после элюирования.

Из ферментов лучшие результаты получены при применении 1% пепсина, чувствительность в РНГА и РАЛ, при работе с МИС туляремийным, бруцеллезным и чумным, составила 1,25×106 - 6,25×10 5 м.к./мл. Из детергентов наилучшие результаты получены с 2% раствором Твин 20, чувствительность РНГА и РАЛ составила 1,25×106 - 3,125×105 м.к./мл. При использовании щелочей наилучшие результаты получены с 0,03 М раствором калия едкого, при этом чувствительность реакций составила 1,25×106 - 3,125×105 м.к./мл. Получены хорошие результаты с 60% раствором ацетонитрила, pH 8,5 и ТРИС-ЭДТА буфером, pH 8,9 и 0,1 М Трис (оксиметиламинометан).

Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве эффективного элюирующего раствора, позволяющего проводить качественную элюцию (максимальная чувствительность РНГА с элюированным патогеном) и многократно использовать МИС после элюирования с отсутствием ложноположительных реакций с самим реактивом, используют 0,1 М Трис (оксиметиламинометан).

Способ осуществляется следующим образом. 0,1 мл 10% взвеси МИС туляремийного, чумного или бруцеллезного инкубируют с микробными взвесями возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в концентрации 1×107 м.к./мл в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку РНГА и РАЛ. В таблице 1 представлены показатели элюции.

Таблица 1
Показатели элюции патогенов после инкубации с МИС
ЭлюентМИС pHЛожно-положительные результаты Чувствит. в РНГА, м.к./мл, после элюции Чувствит. в РАЛ, м.к./мл, после элюции ВоспроизводимостьВозможность многократного использованияВоспроизводимость
1% пепсин туляремийный4 нет1,25×106 6,25×10585% да87%
бруцеллезный6,25×105 1,25×106 84%85%
чумной1,25×106 6,25×10582% 80%
2% раствор Твин 20туляремийный 5,6нет 1,25×1061,25×10 689% да90%
бруцеллезный3,125×105 1,25×106 88%89%
чумной1,25×106 3,125×10586% 87%
0,03 М КОН туляремийный 11,4нет 3,125×1056,25×10 590% да92%
бруцеллезный6,25×105 1,25×106 89%90%
чумной6,25×105 6,25×10588% 89%
60% раствор ацетонитрила туляремийный 8,5нет 1,25×1061,25×10 693% да91%
бруцеллезный6,25×105 1,56×105 91%90%
чумной1,25×106 1,25×10689% 89%
ТРИС-ЭДТА буфер туляремийный 8,9нет 6,25×1056,25×10 590% да92%
бруцеллезный1,25×106 1,25×106 90%91%
чумной6,25×105 1,25×10690% 90%
0,1 М Трис (оксиметиламинометан) туляремийный 9,7нет 3,125×1056,25×10 594% да95%
бруцеллезный1,25×106 1,25×106 92%94%
чумной1,25×106 6,25×10591% 92%

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ элюции сконцентрированного на магнитной иммобилизованной матрице патогена с целью эффективной индикации возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в РНГА и РАЛ и возможности повторного применения МИС.

Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Элюция возбудителя туляремии с МИС и его контроль в РНГА и РАЛ

Для элюции 0,1 мл 10% взвеси МИС туляремийного инкубировали со взвесью туляремийного микроба в концентрации 1×107 м.к./мл в течение 30 мин, удаляли надосадок, далее МИС инкубировали с 0,5 мл элюирующего раствора (0,1 М Трис) в течение 10 мин, pH элюата возвращали к физиологическому значению, проводили постановку РНГА и РАЛ. Чувствительность в РНГА и РАЛ после элюции составила 3,125×105 м.к./мл и 6,25×105 м.к./мл, соответственно. Апробирована возможность повторного применения МИС туляремийного после элюции и отмывки. Получены положительные результаты, т.е. иммуноглобулины с магнитной матрицы не десорбировались.

Пример 2. Элюция возбудителя чумы с МИС и его контроль в РНГА и РАЛ

Получали аналогично примеру 1, используя, вместо туляремийного МИС чумной и соответствующий антиген. Чувствительность в РНГА и РАЛ после элюции составила 1,25×106 м.к./мл и 6,25×10 5 м.к./мл, соответственно.

Пример 3. Элюция возбудителя бруцеллеза с МИС и его контроль в РНГА и РАЛ

Получали аналогично примеру 1, используя вместо туляремийного МИС бруцеллезный и соответствующий антиген. Чувствительность в РНГА и РАЛ после элюции составила 1,25×106 м.к./мл.

Литература

1. http://www.biochemmack.ru/product/magnetic/micro/).

2. Матвеева, И.Н. Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота / И.Н. Матвеева, И.И. Кочиш, Н.А. Бондарева, С.В. Кузнецова, Н.К. Еремец, Л.С. Люлькова, И.А. Бараковский, Д.А. Салов, Е.В. Рахманина // Патент РФ № 2392331, опубликован 20.06.2010, Бюл. № 17.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ элюции патогена с иммобилизованной магнитной матрицы, заключающийся в том, что в качестве элюента используют 0,1 М трис (оксиметиламинометан), при этом 0,1 мл магноиммуносорбента (МИС) инкубируют с патогеном в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) или реакции агглютинации латекса (РАЛ) и обеспечивают возможность повторного применения МИС.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2535070

patent-2535070.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого

Патенты РФ в классе G01N33/53:
способ диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы вирусной этиологии -  патент 2529795 (27.09.2014)
способ диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы вирусной этиологии -  патент 2529794 (27.09.2014)
способ оценки острой соматической боли -  патент 2529793 (27.09.2014)
способ оценки эффективности противогерпетического действия фотодинамического воздействия на вирус простого герпеса (впг) in vitro -  патент 2529792 (27.09.2014)
способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша -  патент 2529788 (27.09.2014)
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
способ прогнозирования инфекционного осложнения атопического дерматита у ребенка -  патент 2528908 (20.09.2014)
способ прогнозирования риска развития тяжелого поражения нервной системы у новорожденных детей с различным сроком гестации в неонатальном периоде -  патент 2528907 (20.09.2014)
способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа -  патент 2528896 (20.09.2014)
способ прогнозирования развития психической дезадаптации -  патент 2528886 (20.09.2014)

Класс G01N33/569 микроорганизмов, например протозоа, бактерий, вирусов

Патенты РФ в классе G01N33/569:
способ прогнозирования риска развития инфекционно-воспалительных осложнений у женщин с внутриматочной патологией после гистероскопии -  патент 2526163 (20.08.2014)
штамм вируса гриппа a/pochard/siberia/249/08-ma h10n7-субтипа для получения антиген-содержащего диагностического препарата и диагностической поликлональной сыворотки, применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе пцр и для изучения противовирусных препаратов in vitro и in vivo -  патент 2522813 (20.07.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив735 субтипа в для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2520813 (27.06.2014)
иммуногенные белки streptococcus -  патент 2518315 (10.06.2014)
способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроогранизмов к антибиотикам на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат -  патент 2518249 (10.06.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив742 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2513693 (20.04.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2513692 (20.04.2014)
штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка ovis aries, используемый для вирусологических исследований -  патент 2507255 (20.02.2014)
штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны поросенка sus scrofa, используемый для вирусологических исследований -  патент 2506310 (10.02.2014)
способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления legionella pneumophila 1,3 и 6 серогрупп (варианты) -  патент 2505819 (27.01.2014)


Наверх