ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

способ лечения сахарного диабета в эксперименте

Классы МПК:G09B23/28 в медицине 
A61K35/39 поджелудочная железа
A61P3/10 для лечения гипергликемии, например антидиабетические средства
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):Чудных Сергей Михайлович (RU),
Лесовой Денис Евгеньевич (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-10-29
публикация патента:

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для изучения вопросов лечения сахарного диабета. Способ включает введение инсулин-продуцирующих клеток в дозе 500 тыс. клеток в растворе с 0,5 мл изотропного геля, 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода. Препарат вводят подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы. Способ уменьшает число осложнений, связанных с развитием тканевой несовместимости. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно хирургии, и может быть применено в качестве способа лечения сахарного диабета.

Известен способ лечения сахарного диабета, в котором пациенту вводят сульфатид, содержащий 14-18 углеродных атомов в цепи жирной кислоты, что приводит к повышению сохранности резерва инсулина в островках Лангерганса (1 - Патент РФ 2266123). Данный способ принят за аналог.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ лечения сахарного диабета путем трансплантации бета-клеток поджелудочной железы млекопитающих (Патент РФ № 2135193, A61K 35/39, 1997).

Однако в определенной мере при использовании способа-прототипа возможно возникновение иммунологического конфликта.

Целью изобретения является уменьшение количества осложнений, связанных с развитием тканевой несовместимости.

Технический результат достигается тем, что в качестве вещества используют инсулин-продуцирующие клетки в дозе 300-400 мг/кг, вводимые подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы.

Способ осуществляется следующим образом.

Животному (мыши линии C57BL/6 дикого типа массой 18-22 г возраста 8-12 недель) в щадящих условиях проводят верхнюю срединную лапаротомию. Входят в сальниковую сумку, находят головку поджелудочной железы и отступя 3-4 мм от Вирсунгова протока производят забор ткани поджелудочной железы в объеме 3-4 мм3.

Осуществляют ферментативную диссоциацию тканей поджелудочной железы мыши в присутствии 300 (CDU)/Mn коллагеназы 1 типа и 0.3 мг/мл деоксирибонуклеазы при 37°C с постоянным перемешиванием 30-45 мин.

Полученную суспензию фильтруют через клеточное сито с размером ячейки 75 мкм, и центрифугируют со скоростью 1200 об/мин 5 мин. Инсулин-продуцирующие клетки, находящиеся в состоянии небольших клеточных агрегатов, под микроскопом отбирают и переносят в чашку Петри. При дальнейшем культивировании в специальной среде Kubota's Medium на непокрытом пластике производят селекцию инсулин-продуцирующих клеток от клеток матрикса. Далее культуру поддерживают на среде: среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (DMEM/F12), 5% сыворотка эмбриональная телячья (FBS), 10-8 М гидрокортизона, 5 мкг/мл трансферина/Fe, 5 мкг/мл инсулина, фактор роста фибробластов (bFGF) 5 мкг/мл, эпидермидермального фактора роста EGF 20 нг/мл.

Формируют колонии в чашках Петри. Клетки высаживают с плотностью 3х105 на диаметре 100 мм в среде Kubota's Medium. Колонии образуются через 3 дня. Колонии фенотипически гетерогенны, в центре расположены малые недифференцированные клетки, по краям колоний - более дифференцированные. Контролируют чистоту клеточной линии по степени экспрессии основных гормонов поджелудочной железы: инсулина, соматостатина, глюкагона с помощью полимеразной цепной реакции.

Клетки помещают в трехмерный матрикс: смешивают 100 мкл клеток (0,5 млн) с 0,5 мл изотропного геля, добавляют 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода.

6 мышам линии C57BL/6 Rag-1/- массой 18-22 г возрастом 8-12 недель (самцы) моделируют диабет I типа путем инъекции стрептозоцина внутримышечно 5 дней подряд, общее количество введенного препарата 300-400 мг/кг. Через две недели уровень глюкозы в крови у животного достигает 400-500 мг/dL (норма у мышей 250 мг/dL).

Согласно заявленному способу, лечение диабета осуществляют введением матрикса с В-клетками в дозе 300-400 мг/кг подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы мышам-самцам линии C57BL/6 Rag-1/- с экспериментально вызванным диабетом.

Морфологический контроль повреждения В-клеток островков Лангерганса осуществляется следующим образом. В течение месяца мыши находятся под контролем уровня глюкозы. Через 1 мес мышей усыпляют парами изофлюрана в течение 3 минут в камере. Извлекают образцы матрикса и поджелудочную железу, заключают в матричную среду для криотомии Tissue-Tek и замораживают. Для иммуногистологического анализа готовят гистологические криосрезы толщиной 7 мкм и проводят окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду. При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом определяют дистрофию В-клеток островков Лангерганса. Увеличена микрокапиллярная сеть островков Лангерганса. Отмечается дистрофия отдельных ациноцитов и эпителиальных клеток Вирсунгова протока. Увеличено кровенаполнение внешнесекреторной части поджелудочной железы. В совокупности с динамикой уровня глюкозы, данными по окрашиванию антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду и данными гистологического исследования делают вывод о адекватном моделировании сахарного диабета I типа. В образцах матрикса обнаруживают положительное окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду, что говорит о функциональной активности трансплантированных клеток в матриксе.

При гистологическом исследовании поджелудочной железы мышей с экспериментальным диабетом в условиях воздействия экзогенных культивированных В-клеток, согласно заявляемому способу, выявляют дистрофию единичных В-клеток островков Лангерганса. Уменьшена выраженность микрокапиллярной сети островков Лангерганса. Дистрофия сохраняется в отдельных эпителиальных клетках Вирсунгова протока. Кровенаполнение ацинарной части поджелудочной железы сохранно. В совокупности с положительной динамикой уровня глюкозы и данными гистологического исследования делают вывод о коррекции сахарного диабета I типа в эксперименте.

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Мыши массой 20 г в щадящих условиях проводят верхнюю срединную лапаротомию. Входят в сальниковую сумку, находят головку поджелудочной железы и отступя 3 мм от Вирсунгова протока производят забор ткани поджелудочной железы в объеме 3 мм. Осуществляют ферментативную диссоциацию тканей поджелудочной железы мыши в присутствии 300 (CDU)/Mn коллагеназы I типа и 0,3 мг/мл деоксирибонуклеазы при 37°C с постоянным перемешиванием 30 мин.

Полученную суспензию фильтруют через клеточное сито с размером ячейки 75 мкм, и ЦФ 1200 RPM 5 мин: инсулин-продуцирующие клетки, находящиеся в состоянии небольших клеточных агрегатов, под микроскопом отбирают и переносят в чашку Петри. При дальнейшем культивировании в специальной среде Kubota's Medium на непокрытом пластике производят селекцию инсулин-продуцирующих клеток от клеток матрикса. Далее культуру поддерживают на среде: DMEM/F12, 5% FBS, 10 -8 М гидрокортизона, 5 мкг/мл трансферина/Fe, 5 мкг/мл инсулина, фактор роста фибробластов bFGF 5 мкг/мл, эпидермального фактора роста EGF 20 нг/мл.

Формируют колонии в чашках Петри. Клетки высаживают с плотностью 3×10 5 на способ лечения сахарного диабета в эксперименте, патент № 2534911 100 мм в среде Kubota's Medium. Колонии образуются через 3 дня. Колонии фенотипически гетерогенны, в центре расположены малые недифференцированные клетки, по краям колоний - более дифференцированные. Контролируют чистоту клеточной линии по степени экспрессии основных гормонов поджелудочной железы: инсулина, соматостатина, глюкагона с помощью Real time-PCR;

Клетки помещают в трехмерный матрикс: смешивают 100 мкл клеток (0,5 млн) с 0,5 мл изотропного геля, добавляют 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода.

Мыши линии C57BL6 Rag-1/-1 моделируют диабет I типа путем инъекции стрептозоцина внутримышечно 5 дней подряд, общее количество введенного препарата 300 мг/кг. Через две недели уровень глюкозы в крови у животного достигает 400 мг/dL (норма у мышей 250 мг/dL).

Матрикс с инсулин-продуцирующими клетками в дозе 300 мг/кг вводят подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы мыши-самцу весом 25 г., линии C57BL6 Rag-1/-1 с экспериментально вызванным диабетом. В течение месяца мышь находится под контролем уровня глюкозы. Через 1 мес мышь усыпляют парами изофлюрана в течение 3 минут в камере. Извлекают образцы матрикса, заключают в Tissiie-Tek и замораживают. Далее подготавливают гистологические криосрезы толщиной 7 мкм и проводят окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду.

При гистологическом исследовании - мыши с экспериментальным диабетом В-клетки островков Лангерганса в состоянии дистрофии, с увеличенной микрокапиллярной сетью. Отмечается дистрофия отдельных ацинарных и эпителиальных клеток Вирсунгова протока. Увеличено кровенаполнение ацинусов поджелудочной железы. В совокупности с динамикой уровня глюкозы (400 мг/dL), результатами окрашивания биоптатов антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду и данными гистологического исследования делают вывод о адекватном моделировании сахарного диабета I типа.

Поджелудочная железа мышей с экспериментальным диабетом в условиях воздействия культивированных В-клеток, выявляют дистрофию единичных В-клеток островков Лангерганса. Отмечается уменьшение микрокапиллярной сети островков Лангерганса. Дистрофия сохраняется в отдельных эпителиальных клетках Вирсунгова протока. Кровенаполнение ацинусов поджелудочной железы сохранно. В совокупности с положительной динамикой уровня глюкозы (280 мг/dL) и данными гистологического исследования делают вывод о коррекции сахарного диабета I типа в эксперименте.

Пример 2

Животному (мыши массой 25 г) в щадящих условиях проводят верхнюю срединную лапаротомию. Входят в сальниковую сумку, находят головку поджелудочной железы и отступя 4 мм от Вирсунгова протока производят забор ткани поджелудочной железы в объеме 3,5 мм3.

Осуществляют ферментативную диссоциацию тканей поджелудочной железы мыши в присутствии 300 (CDU)мл коллагеназы I типа и 0,3 мг/мл деоксирибонуклеазы при 37°C с постоянным перемешиванием 40 мин.

Полученную суспензию фильтруют через клеточное сито с размером ячейки 75 мкм, и ЦФ 1200 R-PM 5 мин; инсулин-продуцирующие клетки, находящиеся в состоянии небольших клеточных агрегатов, под микроскопом отбирают и переносят в чашку Петри. При дальнейшем культивировании в специальной среде Kubota's Medium на непокрытом пластике производят селекцию инсулин-продуцирующих клеток от клеток матрикса. Далее культуру поддерживают на среде: DMEM/F12, 5% FBS, 10 -8 М гидрокортизона, 5 мкг/мл трансферина/Fe, 5 мкг/мл инсулина, фактор роста фибробластов bFGF 5 мкг/мл, эпидермидермального фактора роста EGF 20 нг/мл.

Формируют колонии в чашках Петри. Клетки высаживают с плотностью 3×10 3 на 0100 мм в среде Kubota's Medium. Колонии образуются через 3 дня. Колонии фенотипически гетерогенны, в центре расположены малые недифференцированные клетки, по краям колоний - более дифференцированные. Контролируют чистоту клеточной линии по степени экспрессии основных гормонов поджелудочной железы: инсулина, соматостатина, глюкагона с помощью Real time-PCR;

Клетки помещают в трехмерный матрикс: смешивают 100 мкл клеток (0,5 млн) с 0,5 мл изотропного геля, добавляют 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода.

Мыши линии C57BL6 Rag-1/-1 моделируют диабет I типа путем инъекции стрептозоцина внутримышечно 5 дней подряд, общее количество введенного препарата 380 мг/кг. Через две недели уровень глюкозы в крови у животного достигает 450 мг/dL (норма у мышей 250 мг/dL).

При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом определяют дистрофию многочисленных В-клеток островков Лангерганса и А-клеток ацинусов. Увеличена микрокапиллярная сеть островков Лангерганса и кровенаполнение внешнесекреторной части поджелудочной железы. Отмечается дистрофия эпителиальных клеток Вирсунгова протока. В совокупности с динамикой уровня глюкозы, данными по окрашиванию антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду и данными гистологического исследования делают вывод об адекватном моделировании сахарного диабета I типа.

Матрикс с инсулин-продуцирующими клетками в дозе 400 мг/кг вводят подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы мыши-самцу весом 25 г., линии C57BL6 Rag-1/-1 с экспериментально вызванным диабетом. В течение месяца мышь находится под контролем уровня глюкозы. Через 1 мес мышь усыпляют парами изофлюрана в течение 3 минут в камере. Извлекают образцы матрикса. заключают в Tissue-Tek и замораживают. Далее подготавливают гистологические криосрезы толщиной 7 мкм и проводят окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду.

При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом в условиях воздействия культивированных В-клеток выявляют дистрофию единичных В-клеток островков Лангерганса и А-клеток ациноцитов. Уменьшена выраженность микрокапиллярной сети островков Лангерганса. Дистрофия сохраняется в отдельных эпителиальных клетках Вирсунгова протока. Кровенаполнение ацинарной части поджелудочной железы сохранно. В совокупности с положительной динамикой уровня глюкозы (250 мг/dL) и данными гистологического исследования делают вывод о коррекции сахарного диабета I типа в эксперименте.

Пример 3

Животному (мышь массой 30 г) в щадящих условиях проводят верхнюю срединную лапаротомию. Входят в сальниковую сумку, находят головку поджелудочной железы и отступя 4 мм от Вирсунгова протока производят забор ткани поджелудочной железы в объеме 4 мм.

Осуществляют ферментативную диссоциацию тканей поджелудочной железы мыши в присутствии 300 (CDU)/мл коллагеназы 1 типа и 0,3 мг/мл деоксирибонуклеазы при 37°C с постоянным перемешиванием 45 мин.

Полученную суспензию фильтруют через клеточное сито с размером ячейки 75 мкм, и ЦФ 1200 RPM 5 мин; инсулин-продуцирующие клетки, находящиеся в состоянии небольших клеточных агрегатов, под микроскопом отбирают и переносят в чашку Петри. При дальнейшем культивировании в специальной среде Kubota's Medium на непокрытом пластике производят селекцию инсулин-продуцирующих клеток от клеток матрикса. Далее культуру поддерживают на среде: DMEM/F12, 5% FBS, 10-8 М гидрокортизона, 5 мкг/мл трансферина/Fe, 5 мкг/мл инсулина, фактора роста фибробластов bFGF 5 мкг/мл, эпидермального фактора роста EGF 20 нг/мл.

Формируют колонии в чашках Петри. Клетки высаживают с плотностью 3×105 на способ лечения сахарного диабета в эксперименте, патент № 2534911 100 мм в среде Kubota's Medium. Колонии образуются через 3 дня. Колонии фенотипически гетерогенны, в центре расположены малые недифференцированные клетки, по краям колоний - более дифференцированные. Контролируют чистоту клеточной линии по степени экспрессии основных гормонов поджелудочной железы: инсулина, соматостатина. глюкагона с помощью Real time-PCR;

Клетки помещают в трехмерный матрикс: смешивают 100 мкл клеток (0,5 млн) с 0,5 мл изотропного геля. добавляют 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода.

Мыши линии C57BL6 Rag-1/-1 моделируют диабет I типа путем инъекции стрептозоцина внутримышечно 5 дней подряд, общее количество введенного препарата 400 мг/кг. Через две недели уровень глюкозы в крови у животного достигает 500 мг/dL.

Матрикс с инсулин-продуцирующими клетками в дозе 350 мг/кг вводят подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы мыши-самцу весом 30 г., линии C57BL6 Rag-1/-1 с экспериментально вызванным диабетом. В течение месяца мышь находится под контролем уровня глюкозы. Через 1 мес мышь усыпляют парами изофлюрана в течение 3 минут в камере. Извлекают образцы матрикса, заключают в Tissue-Tek и замораживают. Далее подготавливают гистологические криосрезы толщиной 7 мкм и проводят окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду.

При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом определяют дистрофию В-клеток островков Лангерганса. Увеличена микрокапиллярная сеть островков Лангерганса. Отмечается дистрофия отдельных ациноцитов и эпителиальных клеток Вирсунгова протока. Увеличено кровенаполнение внешнесекреторной части поджелудочной железы. В совокупности с динамикой уровня глюкозы, данными по окрашиванию антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду и данными гистологического исследования делают вывод об адекватном моделировании сахарного диабета I типа.

При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом в условиях воздействия культивированных В-клеток выявляют дистрофию единичных В-клеток островков Лангерганса. Уменьшена выраженность микрокапиллярной сети островков Лангерганса. Дистрофия сохраняется в отдельных эпителиальных клетках Вирсунгова протока. Кровенаполнение ацинарной части поджелудочной железы сохранно. В совокупности с положительной динамикой уровня глюкозы (250 мг/dL) и данными гистологического исследования делают вывод о коррекции сахарного диабета I типа в эксперименте.

По заявляемому способу проведено 25 экспериментов. Результаты лечения подтвердили достижение цели изобретения - уменьшение количества осложнений, связанных с развитием тканевой несовместимости.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ лечения сахарного диабета в эксперименте, включающий введение препарата клеток, отличающийся тем, что используют инсулин-продуцирующие клетки в дозе 500 тыс. клеток в растворе с 0,5 мл изотропного геля, 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода, вводимые подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2534911

patent-2534911.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс G09B23/28 в медицине 

Патенты РФ в классе G09B23/28:
способ моделирования физиологических эффектов пребывания на поверхности планет с пониженным уровнем гравитации -  патент 2529813 (27.09.2014)
способ оценки эффекта электромагнитных волн миллиметрового диапазона (квч) в эксперименте -  патент 2529694 (27.09.2014)
способ анатомо-хирургического моделирования наружной ротационной контрактуры тазобедренного сустава в эксперименте -  патент 2529407 (27.09.2014)
способ моделирования приобретенной токсической гемолитической анемии в эксперименте -  патент 2528976 (20.09.2014)
способ коррекции негативных эффектов низких температур на предстательную железу крыс -  патент 2527172 (27.08.2014)
способ предоперационной подготовки деминерализованного костного трансплантата к пластике в эксперименте -  патент 2527167 (27.08.2014)
способ моделирования синдрома хронической ановуляции -  патент 2527166 (27.08.2014)
способ моделирования сочетанных радиационных поражений, включающих общее гамма- и местное рентгеновское облучение -  патент 2527148 (27.08.2014)
индивидуализированная система обучения как способ формирования профессиональной компетентности врачей-педиатров -  патент 2526945 (27.08.2014)
способ моделирования осложненной стенозом двенадцатиперстной кишки -  патент 2526935 (27.08.2014)

Класс A61K35/39 поджелудочная железа

Патенты РФ в классе A61K35/39:
дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток -  патент 2473684 (27.01.2013)
способ получения бета-клеток поджелудочных желез кроликов и композиция для стимуляции выработки собственного инсулина у пациента -  патент 2450052 (10.05.2012)
способ лечения острого деструктивного панкреатита и устройство для лечения острого деструктивного панкреатита -  патент 2441658 (10.02.2012)
макрогранулы агарозы seakem gold, содержащие секреторные клетки, и их применение -  патент 2417090 (27.04.2011)
способ получения средства, обладающего тканеспецифической активностью, и средство, полученное данным способом (варианты) -  патент 2415676 (10.04.2011)
ядра микропеллет панкреатина, пригодные для нанесения энтеросолюбильного покрытия -  патент 2408364 (10.01.2011)
способ лечения сахарного диабета -  патент 2405559 (10.12.2010)
способ консервативного лечения острого панкреатита -  патент 2402353 (27.10.2010)
средство для лечения диареи у поросят "колимак", способ его получения и способ лечения диареи у поросят -  патент 2385158 (27.03.2010)
способ определения пригодности поджелудочной железы как источника панкреатических островков -  патент 2355404 (20.05.2009)

Класс A61P3/10 для лечения гипергликемии, например антидиабетические средства

Патенты РФ в классе A61P3/10:
новый вариант эксендина и его конъюгат -  патент 2528734 (20.09.2014)
хиназолиноны как ингибиторы пролилгидроксилазы -  патент 2528412 (20.09.2014)
соли метил(r)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-a]пиразин-1-карбоксилата -  патент 2528233 (10.09.2014)
инсулин-олигомерные конъюгаты, их препараты и применения -  патент 2527893 (10.09.2014)
ингибиторы поли(адф-рибозо)полимеразы-1 человека на основе производных урацила -  патент 2527457 (27.08.2014)
аналоги хроменона в качестве модуляторов сиртуина -  патент 2527269 (27.08.2014)
способ повышения фармакологической активности действующего вещества лекарственного средства и фармацевтическая композиция -  патент 2526153 (20.08.2014)
способ комплексного лечения артериальной гипертонии при метаболических нарушениях -  патент 2525593 (20.08.2014)
способ коррекции ожирения абдоминального типа -  патент 2525007 (10.08.2014)
применение apl пептида для лечения воспалительной болезни кишечника и диабета типа 1 -  патент 2524630 (27.07.2014)


Наверх