способ диагностики окислительного стресса измерением экспрессии кислородчувствительных генов (варианты)

Формула изобретения

1. Способ диагностики окислительного стресса у млекопитающего, включающий:

измерение уровня экспрессии в коре головного мозга млекопитающего по меньшей мере трех генов, выбранных из группы, состоящей из Pdk4, Nid2, Golph2, Actr1a, Api5, Mrpl3, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herc1, Ssc1, Snrpb и Zfhx1b, и по меньшей мере одного гена из группы, включающей scl25b и Rn. 48050,

сравнение измеренного и обычного уровня экспрессии по меньшей мере трех вышеуказанных генов из группы, включающей Pdk4, Nid2, Golph2, Actr1a, Api5, Mrpl3, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herc1, Ssc1, Snrpb и Zfhx1b, и по меньшей мере одного гена из группы, включающей scl25b и Rn. 48050,

в случае если измеренный уровень экспрессии по меньшей мере трех генов, выбранных из группы, включающей Pdk4, Nid2, Golph2, Actr1a, Api5, Mrpl3, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herc1, Ssc1, Snrpb и Zfhx1b увеличен, по сравнению с обычным уровнем экспрессии данных генов, по меньшей мере в 1,5 раза и если измеренный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, включающей scl25b и Rn. 48050, снижен по сравнению с обычным уровнем экспрессии данных генов по меньшей мере в 1,5 раза определяют состояние окислительного стресса у вышеуказанного млекопитающего.

2. Способ по п.1, в котором экспрессию указанных генов измеряют с помощью биочипа.

3. Способ по п.1, в котором экспрессию указанных генов измеряют с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени.

4. Способ диагностики окислительного стресса у млекопитающего, включающий:

измерение уровня экспрессии в коре головного мозга млекопитающего по меньшей мере трех генов, выбранных из группы, состоящей из из Nid2, Golph2, Actr1a, Mrpl3, Scn7a, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Herc1, Zfhx1b, Rn.42485, MPP3, AI 101224, Abca1, Appbp1, Rn.96234, Nptxr, Rn. 16755, Vamp2, Ghr, Calm1, Cyp51, и ID1, а также генов sc125b и Rn. 48050,

сравнение измеренного и обычного уровня экспрессии по меньшей мере трех вышеуказанных генов, а также генов scl25b и Rn. 48050, и

в случае превышения измеренного уровня экспрессии по меньшей мере трех вышеуказанных генов над обычным уровнем экспрессии данных генов по меньшей мере в 1,5 раза и сохранения уровня экспрессии генов scl25b и Rn. 48050 на обычном уровне определяют состояние постгипербарической оксигенации у вышеуказанного млекопитающего.

5. Способ по п.4, в котором экспрессию указанных генов измеряют с помощью биочипа.

6. Способ по п.4, в котором экспрессию указанных генов измеряют с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям, а именно к области диагностики состояния окислительного стресса у млекопитающего. Настоящее изобретение относится как к способам диагностики состояния окислительного стресса в текущий момент, так и к способам диагностики состояния, которому предшествовал окислительный стресс.

Уровень техники

Оксидативный (окислительный) стресс (ОС) определяют как состояние дисбаланса между наличием в биологической системе оксидантов и антиоксидантов в сторону преобладания оксидантов (Меньшикова Е.Б. и др., 2006) /1/. Механизм формирования дисбаланса во взаимодействии активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантов может быть различным в зависимости от особенностей «запуска» окислительного стресса. Действительно, характер взаимодействия АФК и антиоксидантов будет отличаться при ОС, вызванном недостатком в пищевом рационе витамина Е, реакции воспаления и влиянии ионизирующей радиации. Таким образом, физиологическая и патогенетическая роли окислительного стресса, в конечном итоге, определяются соотношением между активностью систем генерации АФК и системами их утилизации, которые в различных органах и тканях могут существенно отличается между собой. Так, например, в тканях с активным кислородным метаболизмом наблюдается повышенная генерация активных кислородных форм кислорода, как и повышенная активность антикислородных и антирадикальных систем, включая и содержание жирорастворимых антиоксидантов. Важно подчеркнуть, что состояние баланса либо дисбаланса между системами генерации и утилизации АФК может формироваться на различном уровне неравновесности, что определяется системой прямых и обратных связей (Куликов В.Ю., 2002) /2/.

С определенной степенью уверенности можно утверждать, что регуляторная (физиологическая) роль ОС проявляется при сохранении сопряжения между генерацией АФК и активностью систем их утилизации (Куликов В.Ю., 1985) /3/. Например, при генерации нейтрофилами крови АФК в условиях индукции наблюдается параллельное увеличение содержания супероксиддисмутазы (СОД) и восстановленного глутатиона. В этом случае АФК выполняют киллерные (физиологические) функции, обеспечивая микробицидный потенциал клетки. Гиперпродукция АФК может сопровождаться последовательной депрессией одних антиоксидантов и включением в системы детоксикации других, поскольку антиоксидантные системы являются многоуровневыми и многопараметрическими системами, функционирующими за счет наличия определенных регуляторных контуров.

Окислительный стресс (ОС), являющийся результатом разбалансировки генерации и разложения активных форм кислорода (АФК) и азота, может приводить к повреждению клетки в течение старения, а также связанных со старением нейродегенеративных заболеваний (Lescai e.al., 2009; Coppede, Migliore, 2010) /4, 5/.

Известен способ оценки окислительного стресса в головном мозге при реперфузионном синдроме травматического и нетравматического генеза (RU2200320, 10.03.2003) /6/, заключающийся в измерении уровня хемилюминесценции (ХЛ) в крови, отличающийся тем, что регистрируют уровень люминолзависимой спонтанной ХЛ цельной крови, взятой из правой и левой яремных вен, определяют светосумму свечения крови и при ее значении, равном 40 отн. ед. и выше хотя бы в одной из вен, окислительный стресс оценивают как высокий. Однако данный способ подходит для оценки окислительного стресса только в текущем состоянии пациента и не позволяет судить о том, подвергался ли пациент ранее окислительному стрессу.

Из уровня техники известен способ диагностики окислительного стресса организма (RU2236008, 10.09.2004) /7/, включающий определение уровня белковых и небелковых серосодержащих компонентов анти/прооксидантной системы организма и малонового альдегида, отличающийся тем, что в гемолизате определяют уровень тиоловых групп, по разнице между показателями среднего количества тиоловых групп гемолизата практически здоровых людей, равного 0,1740,004 оптической единицы, и количеством тиоловых групп гемолизата обследуемого человека определяют количество дисульфидных групп и при значении этой разницы, равной 0,000±0,008 оптической единицы, определяют отсутствие окислительного стресса, а при положительном значении этой разницы дополнительно определяют количество промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и дополнительно определяют количество продуктов модификации биомолекул после предварительной химической индукции Fe2+ процессов перекисного окисления, определяют коэффициент окислительной модификации биомолекул эритротроцитов по формуле

КОМБэр=(ТБЧэр+ТБЧэрInd)(Ед-sh-гр-Ei-sh-гр)100,

где КОМБэр - коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов в окислительных единицах активности, ОЕА; ТБЧэр - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в оптических единицах, ОЕ; ТБЧэрInd - количество в эритроцитах промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул: белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, индуцированных Fe2+ в оптических единицах, ОЕ; Ед-sh-гр - показатель среднего количества тиоловых групп гемолизата у практически здоровых людей, выраженный в оптических единицах, ОЕ, равный 0,174±0,004 ОЕ; Ei-sh-гр - количество тиоловых групп гемолизата обследуемого человека, выраженное в оптических единицах, ОЕ; 100 - расчетный коэффициент, и чем выше положительное значение КОМБэр, тем выше уровень окислительного стресса организма. Данный способ относится к медицине и может быть использован при диагностике и лечении различных заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, однако он не позволяет устанавливать, подвергался ли ранее организм воздействию окислительного стресса.

Также известен способ диагностики нарушений метаболизма в организме, вызванных окислительным стрессом, включающий определение активности ферментов 1-й и 2-й линии антирадикальной защиты и интенсивности свободнорадикального окисления, отличающийся тем, что в комплексе определяют активность супероксиддисмутазы (СОДi) и каталазы (KATi) в гемолизате, далее оценивают изменение этих показателей относительно нормы, которая соответствует значениям СОДk=0,16±0,02 и KATk=115,55±9,41, и при значении соотношения этих показателей, равном 1,000±0,002, определяют отсутствие дисбаланса функционирования ферментов антирадикальной защиты, а при других значениях этого соотношения дополнительно определяют степень выраженности окислительного стресса по максимуму и площади вспышки хемилюминесценции и оценивают дисбаланс функционирования ферментов антирадикальной защиты по формуле:

ИПФФАРЗi=100·(KATi/KATki/:COДi/COДk)ПХЛi/ПХЛk·MBXЛi/MBXЛk, где

ИПФФАРЗi - интегральный показатель функционирования ферментов антирадикальной защиты обследуемого, в единицах соотношения каталаза/супероксиддисмутаза, ед. соотн. КАТ/СОД, КАТ - активность каталазы гемолизата обследуемого (i) и контрольной группы (k), в единицах активности, ед. акт., СОД - активность супероксиддисмутазы гемолизата обследуемого (i) и контрольной группы (k), в единицах активности, ед. акт., ПХЛ - площадь хемилюминесценции обследуемого (i) и контрольной группы (k), в единицах площади, ед. пл., МВХЛ - максимум вспышки хемилюминесценции обследуемого (i) и контрольной группы (k), в условных единицах, усл. ед., при значении ИПФФАРЗi ниже 70,0 единиц определяют недостаточность каталазы, а при значении ИПФФАРЗi выше 130,0 единиц определяют недостаточность супероксиддисмутазы. Данное изобретение относится к медицине и может быть использовано в диагностике заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом при дисбалансе функционирования ферментов антирадикальной защиты, однако оно позволяет оценить состояние окислительного стресса, только если оно присутствует в настоящий момент.

Таким образом, диагностика того, подвергался ли организм окислительному стрессу ранее, является чрезвычайно полезной и актуальной задачей в современной медицине. Способы, раскрытые в настоящем изобретении могут применяться в диагностике хронического зоба, оценке отдаленных последствий воздействия на организм экстремальных факторов, например последствия восхождений у альпинистов или оценка состояния водолазов после погружении.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является возможность оценки, подвергался ли организм млекопитающего воздействию окислительного стресса. Способы, основанные на измерении уровня и соотношения ферментов антиоксидантной защиты, не дают представления о том, подвергался ли ранее организм воздействию окислительного стресса, а позволяют оценить только текущее состояние организма.

Техническим результатом настоящего изобретения является расширение функциональных возможностей способа оценки окислительного стресса у испытуемого за счет измерения уровня экспрессии определенных генов.

Настоящее изобретение основано на открытии того, что при воздействии избыточного давления кислорода на организм млекопитающего изменяется экспрессия определенных генов. Более того, экспрессия некоторых генов после воздействия окислительного стресса не возвращается на исходный уровень, а остается повышенной по сравнению с экспрессией вышеуказанных генов при отсутствии воздействия окислительного стресса.

При воздействии окислительного стресса неожиданно было установлено повышение экспрессии следующих генов: Pdk4, Nid2, Golph2, Actria, Api5, Mrpl3, Scn7a, Асох3, Lamrl, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herd, Ssc1,Snrpb,Zfhx1b.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу диагностики окислительного стресса, включающему:

1) измерение уровня экспрессии у млекопитающего по меньшей мере трех генов, выбранных из группы, состоящей из Pdk4, Nid2, Golph2, Actria, Api5, Mrpl3, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herd, Ssd, Snrpb и Zfhxlb, а также по меньшей мере одного гена из группы, включающей sc125b и Rn. 48050,

2) сравнение измеренного и обычного уровня экспрессии по меньшей мере трех вышеуказанных генов из группы, включающей Pdk4, Nid2, Golph2, Actria, Api5, Mrpl3, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herd, Ssci, Snrpb и Zfhxib, и по меньшей мере одного гена из группы, включающей sc125b и Rn. 48050,

3) в случае превышения измеренного уровня экспрессии по меньшей мере трех генов, выбранных из группы, включающей Pdk4, Nid2, Golph2, Actria, Api5, Mrp13, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herd, Ssc1, Snrpb и Zfhx1b, над обычным уровнем экспрессии данных генов по меньшей мере в 1,5 раза и снижения по меньшей мере в 1,5 раза уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, включающей sc125b и Rn. 48050, определяют состояние окислительного стресса у вышеуказанного млекопитающего.

В одном из вариантов настоящего изобретения экспрессию вышеуказанных генов измеряют с помощью биочипа.

В другом варианте настоящего изобретения экспрессию вышеуказанных генов измеряют с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПНР) в реальном времени.

В различных вариантах настоящего изобретения могут использоваться различные способы определения экспрессии генов, доступные квалифицированному специалисту, включая, но не ограничиваясь, различные виды биочипов и модификации метода ПЦР.

Кроме того, неожиданно было установлено, что через три месяца после воздействия окислительного стресса, следующие гены сохраняют повышенный уровень экспрессии по сравнению с контролем: Nid2, Golph2, Actria, Mrp13, Scn7a, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Herd и Zfhx1b. Также наблюдалась сверхэкспрессия следующих генов: Rn.42485, MPP3, AI101224, Abcal, Appbpl, Rn.96234, Nptxr, Rn.16755, Vamp2, Ghr, Calm1, Cyp51, и ID1.

Соответственно, в одном из вариантов настоящее изобретение представляет собой способ диагностики окислительного стресса, включающий:

1) измерение уровня экспрессии у млекопитающего по меньшей мере трех генов, выбранных из группы, состоящей из Nid2, Golph2, Actria, Mrpl3, Scn7a, Lamrl, Sv2b, Stmn2, ТгрсЗ, Herd, Zfhxib, Rn.42485, MPP3, AI101224, Abcal, Appbpl, Rn.96234, Nptxr, Rn.16755, Vamp2, Ghr, Calml, Cyp51, и ID1, а также генов scl25b и Rn. 48050,2) сравнение измеренного и обычного уровня экспрессии по меньшей мере трех вышеуказанных генов, а также генов sc125b и Rn. 48050, и

3) в случае превышения измеренного уровня экспрессии по меньшей мере трех вышеуказанных генов над обычным уровнем экспрессии данных генов по меньшей мере в 1,5 раза и сохранения уровня экспрессии генов scl25b и Rn. 48050 на обычном уровне определяют состояние постгипербарической оксигенации у вышеуказанного млекопитающего.

Краткая характеристика генов, изменивших уровень экспрессии в ответ на окислительный стресс.

Scn7a - натриевый канал, потенциалзависимый, тип VII, альфа.

Тrрс3 - рецептор транзиторного потенциала катионного канала, подтип С, член 3.

Cim1 - ген, кодирующий белок кальмодулин. Кальмодулин контролирует большое количество ферментов и других белков посредством связывания ионов кальция. Убиквинизация и фосфорилирование приводит к снижению активности.

Crebzf. Сильно активизирует транскрипцию, когда связывается с HCFC1. Подавляет экспрессию HSV белков в клетках, инфицированных вирусом HCFC1-зависимым образом. Также подавляет HCFC1-зависимую транскрипционную активацию CREB3 и уменьшает количество CREB3 в клетке. Способен снижать экспрессию некоторых клеточных генов в CREBZF-экспрессирующих клетках.

Sv2b. Обе формы SV2 экспрессируются во всех мозговых областях, SV2B экспрессируется на самом высоком уровне в коре и гиппокампе, тогда как самый высокий уровень экспрессии SV2A наблюдается в подкорковых областях. Возможно, играет роль в контролировании регуляции секреции в нервных и эндокринных клетках.

Nptxr. Белок, кодируемый этим геном - интегральный мембранный белок, функционирующий в качестве нейронного рецептора.

Vamp2. Белок, кодируемый этим геном - член семейства везикуло-ассоциированных мембранных белков (УАМР)/синаптобревина. Синаптобревины, синтаксины и 25-кДа синаптосомально-ассоциированный белок SNAP25 - главные компоненты белкового комплекса, вовлеченного в докинг и/или слияние синаптических пузырьков с предсинаптической мембраной. Белок формирует устойчивый комплекс с синтаксином и синаптотагмином. Он также формирует отдельный комплекс с синаптофузином.

Stmn2 - ген, кодирующий белок статмин 2, который является ключевым регулятором роста нейронов посредством регуляции стабильности микротрубочек. Максимальный уровень экспрессии гена наблюдается в развивающемся мозге на 7-й день после рождения и коррелирует с началом дифференцировки нейронов. Также принимает участие во внутриклеточной сигнальной трансдукции.

Nid2 - ген, кодирующий белок нидоген, являющийся гликопротеином клеточной адгезии, вероятно, участвует во взаимодействиях с внеклеточным матриксом, связывает ионы кальция. Также есть данные об участии нидогена 2 в передаче нервномышечных испульсов, при этом нидоген 2 локализуется в синапсах (Fox MA et al., 2008) /8/.

Lamr1 - 40S рибосомальный белок SA, необходим для сборки и стабилизации 40S рибосомальной субъединицы. Также функционирует в качестве клеточного рецептора к ламинину, играет роль в адгезии клеток к базальной мембране и последующей активации путей сигнальной трансдукции, может участвовать в детерминации клеток и морфогенезе тканей.

Herd - возможная Е3 убиквитин-протеин лигаза. Участвует в мембранном транспорте посредством активности в качестве фактора обмена гауниновых нуклеотидов (GEF) и способности связываться с клатрином. Действует в качестве GEF для Arf и Rab. Может также действовать в качестве убиквинтин-протеин лигазы, которая акцептирует убиквитин с Е2 убиквитин-связывающего фермента в форме тиоэфира и затем непосредственно транспортирует убиквитин на целевой субстрат.

Rn.96234. Этот белок может играть отрицательную роль в клеточной миграции в качестве антагониста активности Rac в процессе организации цитоскелета и движении клеток.

Golph2 - функция гена неизвестна, наблюдается сверхэкспрессия в ответ на вирусную инфекцию, индуцируется белком Е1А аденовируса.

Actria. Этот ген кодирует 42,6 кДа субъединицу динактина, макромолекулярного комплекса, состоящего из 10-11 субъединиц, имеющих массу от 22 до 150 кДаD. Динактин связывается как с динеином микротрубочек, так и с цитоплазматическим динеином. Он вовлечен во множество различных клеточных функций, включая транспортировку из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, центростремительное движение лизосом и эндосом, образование веретена деления, движения хромосом, позиционирование ядра и аксоногенеза.

Асох3 - пероксисомальная ацил-КоА оксидаза 3, также известная как пристаноил-СоА оксидаза (АСОХ3), вовлечена в десатурацию разветвленных жирных кислот с 2 метилами в пероксисомах.

Pdk4. Этот ген - член PDK/BCKDK семейства протеинкиназ и кодирует митохондриальный белок с гистидиновым киназным доменом. Этот белок локализуется в митохондриальном матриксе и ингибирует пируватдегидрогеназный комплекс посредством фосфорилирования одной из его субъединиц, таким образом способствуя регулированию метаболизма глюкозы.

Abca1 - общая функция в качестве откачивающего насоса холестерина в клеточном пути удаления липидов.

Сyp51. Этот ген кодирует член суперсемейства ферментов цитохром Р450. Цитохром Р450 белки - монооксигеназы, которые катализируют множество реакций, участвующих в метаболизме лекарственных препаратов и синтезе холестерина, стероидов и других липидов.

Ssc1 - белок 1, похожий на синтетазу длинноцепочечных жирных кислот (Е1o2), изоформа CRA_b. Ssc1 - повсеместно экспрессируемый ген, продукт которого принадлежит к высококонсервативным микросомальным ферментам, участвующим в синтезе длинноцепочечных жирных кислот. Есть данные о коэкспрессии гена Ssc1 с геном p55Cdc (Asadi A, Jorgensen J, JacobssonA., 2002) 191.

Mrpl3 - рибосомная рибонуклеиновая кислота (rRNA) - РНК компонент рибосомы.

Api5 - ингибитор апоптоза 5.

Zfhx1b - ген, который кодирует Smad-взаимодействующий белок 1 (SIP1) и представляет собой член delta-EFl/Zfh1 семейства двухсвязывающих цинковых пальцев/гомеодоменных белков.

Snrpb кодирует один из нескольких ядерных белков, которые часто обнаруживаются среди U1, U2, U4/U6, и U5 маленьких рибонуклеопротеиновых частиц (snRNPs).

Rn.16755 - ген, кодирующий белок, подобный MutS белку. В Е. соli, MutS белок помогает в распознавании мис-матч нуклеотидов, до их репарации.

Appbp1. Этот белок необходим для прохождения клеткой в течение клеточного цикла S/M контрольной точки.

Rn.108205 - ингибитор связывания ДИК. Белки-игибиторы ДНК связывания типа спираль-петля-спираль не имеют основного ДНК-связывающего домена, однако способны образовывать гетеродимеры с другими белками типа спираль-петля-спираль, таким образом ингибируя связывание ДНК. Белки данного семейства функционируют в качестве ингибиторов клеточной дифференцировки и экспрессия их генов супрессируется по мере клеточной дифференцировки. Играют одну из ключевых ролей в дифференцировке нейронов (Nagata Y., Todokoro К., 1994) /10/.

МРР3 - белок, кодируемый данным геном относится к семейству белков DLG, которые имеют общую структурную организацию и вовлечены в пути сигнальной трансдукции, а также участвуют в опосредовании белок-белковых взаимодействий на границе цитоплазмы и клеточной мембраны.

Ghr - рецептор гормона роста, участвующий в регуляции постнатального роста организма. При связывании лиганда активирует JAK2/STAT5 сигнальный путь. Растворимая форма (GHBP) выступает в качестве резервного хранилища гормона роста в плазме и может служить модулятором/ингибитором сигналинга, опосредованного гормоном роста.

О функциях генов Rn.42485 и AI101224 в настоящее время нет никаких, даже предположительных данных.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показан результат гель-электрофореза тотальной выделенной РНК.

На Фиг.2 показан результат гель-электрофореза амплифицированной РНК.

Осуществление изобретения

Пример 1. Экспрессия генов крыс, подверженных ГБО через 3 дня после воздействия.

Эксперимент были выполнен на 24 белых аутбредных крысах. Животные рандомизировались и обрабатывались высоким давлением кислорода в 25-литровой барокамере, содержащей щелочной поглотитель углекислого газа. Скорость увеличения давления и декомпрессии составляли 0.1 МПа/мин. Гипербарическая оксигенация (ГБО) при 0.2 МПа в течение 1 часа использовалась для создания условий окислительного стресса.

Дизайн эксперимента:

I - интактные крысы - контроль (n=12).

II - животные, подвергнутые ГБО при 0.2 МПа в течение 1 часа через 3 ч после рождения и забитые 3 дня спустя (n=12).

Сбор тканей

Экспериментальных и интактных животных декапитировали спустя 3 дня после ГБО. Мозг быстро извлекали и погружали в лед. Для исследования использовалась лобная кора над глазами животных. Для дальнейшего выделения рибонуклеиновой кислоты лобную кору от каждого животного помещали в тубу микроцентрифуги и быстро замораживали на сухом льду. Исследования проводились на биочипах фирмы Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния, содержащего 12289 образцов генов для гибридизации. Биологический материал отбирался от каждого из 24 животного (один чип на 2 животных: контроль - ГБО).

Выделение РНК и обработка Affymetrix GeneChip

Общая РНК была выделена на основе протокола Invitrogen с использованием TRIzol реактива. Один миллилитр раствора TRIzol добавляли к каждой пробирке, содержащей замороженный блок ткани, и подвергали гомогенизации. После центрифугирования РНК преципитировалась из водного слоя, отмывалась и растворялась в воде, свободной от РНКазы. Концентрация РНК и ее целостность оценивалась спектрофотометрией и гель-электрофорезом (Фиг.1 и Фиг.2). Образцы РНК хранились при - 80°С.

Соотношение 28S/18S 1:2

Соотношение 260/280 2.07

Общее количество тотальной РНК 68(6) и 73 (8) мкг

Степень амплификации >40

Исследование экспрессии генов

Исследование экспрессии генов выполнялась на основе системы Affymetrix GeneChip. Проводилась обратная транскрипция полученной РНК, и кДНК подобласти СА1 каждого животного была помечена красителями Сy3 и Сy5 в соответствии с протоколом производителя и загружена на отдельном чипе гена крысы. Вкратце, средний выход 40 мкг меченной биотином кДНК мишени был получен из 5 мкг общей РНК от каждого СА1 образца, из которых 20 мкг кДНК были помещены на один чип. Гибридизация проводилась в течение ночи в печи с вращающимся подом (Affymetrix) при 45°С. Затем чипы были промыты и прокрашены на жидкостной станции (Affymetrix) и отсканированы при разрешающей способности 3 мкм в конфокальном сканере (Agilent Affymetrix GeneArray Scanner) с использованием программного обеспечения GeneSpring GT (Agilent). Сканирование чипов проводилось при 532 нм и 633 нм

Статистический анализ

Данные были нормализованы, используя Robust Multichip Average (RMA) посредством RMA Express. Были использованы алгоритмы для определения различий в экспрессии генов из руководства к Microarray Suite 4.0.

Анализ данных, полученных на биочипах

Для сравнения данных биочипов между различными обработками использовалась трансформированная Z-оценка (Cheadle et al., 2003). Трансформированная Z-оценка позволяет анализировать данные чипов, независимые от первоначальной интенсивности пикселей и может использоваться при определении р-значений для оценки достоверности, вычислять изменения экспрессии генов после ГБО обработки, Z-оценки были преобразованы к Z-отношениям, которые представляют собой подобные кратным изменения для каждого гена. Статистический анализ базировался на увеличении или уменьшении, по крайней мере, в 2.0 раза экспрессии гена при достоверности р<0.05.

Результаты

Через 3 дня после преадаптационной обработки наблюдалась сверхэкспрессия (более чем полуторакратное увеличение экспрессии гена, по сравнению с экспрессией соответствующего гена в контроле, не подвергавшемся воздействию гипербарической оксигенации) генов следующих структурных белков и факторов транскрипции в мозгу новорожденных крыс: Pdk4, Nid2, Golph2, Actrla, Api5, Mrpl3, Scn7a, Асох3, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Crebzf, Herd, Ssci, Snrpb, Zfhx1b.

Также наблюдалось снижение экспрессии по сравнению с контрольным уровнем следующих генов: sc125b и Rn. 48050.

Таблица 1
Список генов, изменивших уровень экспрессии в ответ на окислительный стресс через 3 ч после воздействия
Ген	Номер последовательности UniGene или Genbank	Отношение Сy3/Cy5
Scn7a	Rn.54541	9,634
ТгрсЗ	Rn.45385	7,7
Nid2	Rn.988892	7,001
Lamrl	Rn. 999	3,193
Herd	Rn. 77165	8,821
Ssd	AF 322919	6,494
Stmn2	Rn. 34335	6,352
Golph2	BC 003961	6,375
Actria	Rn. 32312	5,258
Crebzf	Rn. 35776	8,028
Sv2b	Rn. 58137	6,665
АсохЗ	Rn. 10546	9,104
Pdk4	XM_124831	4,274
Mrpl3	XM_135086	7,825
Api5	XM_123850	2,744
Zfhxib	XM_123784	2,215
Snrpb	BC 032932	2,174
scl25b	BC 008171	0,254
Pin4	Rn. 160194	0,476

Пример 2. Экспрессия генов крыс, подверженных ГБО через 3 месяца после воздействия.

Эксперимент проводился аналогично Примеру 1, за исключением того, что дизайн эксперимента был следующим

Дизайн эксперимента:

I - интактные крысы - контроль (n=12).

II - животные подвергнутые ГБО при 0.2 МПа в течение 1 часа через 3 ч после рождения и забитые 3 месяца спустя (n=12).

Результаты

Через 3 месяца после обработки ГБО сохранялась сверхэкспрессия следующих генов: Nid2, Golph2, Actr1a, Mrpl3, Scn7a, Lamr1, Sv2b, Stmn2, Тrрс3, Herd и Zfhx1b. Также наблюдалась сверхэкспрессия следующих генов: Rn.42485, MPP3, AI101224, Abcal, Appbpl, Rn.96234, Nptxr, Rn.16755, Vamp2, Ghr, Calm1, Cyp51, и ID1.

При этом сниженной экспрессии генов sc125b и Rn. 48050 не наблюдалось.

Таблица 2
Список генов, изменивших уровень экспрессии в ответ на окислительный стресс через 3 м после воздействия
Ген	Номер последовательности UniGene или Genbank	Отношение Cy3/Cy5
Scn7a	Rn. 54541	1,52
Тrрс3	Rn. 45385	1,58
Nid2	Rn. 988892	1,76
Lamr1	Rn. 999	1,69
Herd	Rn. 77165	1,87
Stmn2	Rn. 34335	1,87
Golph2	BC 003961	1,54
Actr1a	Rn. 32312	2,01
Sv2b	Rn. 58137	1,77
Mrpl3	XM_135086	2,36
Zfhx1b	XM_123784
	Rn. 42485	2,48
MPP3	Rn. 123570	2,26
	AI 101224	2,62
Abca1	Rn. 106379	2,63
Appbp1	Rn. 4279	2,79
Nisch	Rn. 96234	2,80
Nptxr	Rn. 34907	2,44
LOC 100360342	Rn. 16755	2,07
Vamp2	Rn. 12939	2,17
Ghr	Rn. 2178	2,34
Calm1	RN. 4166	2,13
Cyp51	Rn. 107152	2,55
ID1	Rn. 108205	2,25

Источники информации

1. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.3., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М.: Фирма "Слово", 2006.

2. Куликов В.Ю. Окислительный стресс (физиология, патогенез, коррекция) / В.Ю.Куликов // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты: материалы Всерос. конф., Новосибирск, 4-6 ноября 2002. - Новосибирск, 2002. - С.43.

3. Куликов В.Ю. Реакции перекисного окисления липидов при адаптации и патологии органов дыхания на Крайнем Севере: дис д-ра мед. наук / В.Ю.Куликов. - Новосибирск, 1985.

4. Lescai F, Marchegiani F, Franceschi C. 2009. PON1 is a longevity gene: results of a meta-analysis.Ageing Res Rev. 8(4):277-284.

5. Coppede F, Migliore L. 2010. DNA repair in premature aging disorders and neurodegeneration. Curr Aging Sci. 3(1):3-19.

6. RU 2200320, 10.03.2003.

7. RU 2236008, 10.09.2004.

8. Fox MA, Но MS, Smyth N, Sanes JR. A synaptic nidogen: developmental regulation and role of nidogen-2 at the neuromuscular junction. Neural Dev. 2008 Sep 25; 3-24.

9. Asadi A, Jorgensen J, Jacobsson A //Elovll and p55Cdc genes are localized in a tail-to-tail array and are co-expressed in proliferating cells. J Biol Chem. 2002 May 24; 277(21):18494-500. Epub 2002 Mar 12.

10. Nagata Y, Todokoro К //Activation of helix-loop-helix proteins Id1, Id2 and Id3 during neural differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 1994 Mar 30; 199(3):1355-62.

Авторы: Шкурат Татьяна Павловна, Гуськов Глеб Евгеньевич, Бибов Михаил Юрьевич, Рыжков Павел Александрович.