штамм vibrio aquamarinus, способ определения токсичности проб с его помощью и тест-культура для определения токсичности проб

Формула изобретения

1. Штамм бактерий Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 (Vibrio aquamarinus DSM 26054) для определения химической токсичности проб.

2. Способ определения химической токсичности проб, включающий измерение люминесценции штамма по п.1 в присутствии по меньшей мере одного химического токсиканта пробы, измерение люминесценции штамма по п.1 в отсутствие указанного токсиканта и сравнение измеренных уровней люминесценции, при этом измерение люминесценции свидетельствует о токсичности пробы.

3. Способ по п.2, в котором определяют токсичность проб окружающей среды.

4. Способ по п.2 или 3, в котором токсикант представляет собой ZnSO₄, CuSO₄ или K₂Cr₂ O₇.

5. Способ по п.2 или 3, в котором токсикант представляет собой нефтепродукт.

6. Способ по п.5, в котором нефтепродукт представляет собой нефть, дизельное топливо или льяльную воду.

7. Способ по п.2 или 3, в котором токсикант представляет собой фенол.

8. Способ по п.2 или п.3, в котором токсикант представляет собой тяжелый металл.

9. Применение штамма по п.1 в качестве тест-культуры для определения химической токсичности проб.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штаммам бактерий для биотестирования токсичности объектов окружающей среды и может быть использовано при проведении эколого-токсических исследований, при мониторинге водных экосистем.

Уровень техники

Известен штамм бактерий Ph. phosphoreum (Cohn) Ford, который рекомендован для биотестирования воды на территории Украины (И.Ю.Малыгина, А.М.Кацев. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей, КНД 211.1.4.060-97) (1, 2). Известный штамм при проведении тестирования используется в лиофилизированном виде и требуется восстановление его активной формы. Кроме того, чувствительность данного штамма к токсическим веществам недостаточно высокая, в частности известный штамм позволяет определить наличие токсических веществ в концентрациях, превышающих ПДК.

Известен бактериальный тест «Эколюм», разработанный в России (МГУ, Москва) (3). Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные культуры генно-инженерного штамма люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах. Культура получена посредством генно-инженерного внедрения lux-оперона в специально подобранный штамм Е. coli. Производится согласно ТУ 6-09-20-236-93. (3) Используется для определения токсичности воды (4), почв (5), химических соединений, полимеров, материалов и изделий (6).

Недостатком известного штамма является недостаточно высокая чувствительность к токсическим веществам, в частности к их наличию в концентрациях на уровне ПДК и ниже. Для тестирования используется лиофилизированная культура, которая находится в биологически неактивной форме и для перехода к активному физиологическому состоянию ей требуется время для прохождения нескольких делений клеток. Недостатком следует считать и высокую себестоимость производства биосенсора вследствие использования дорогостоящего процесса лиофилизации. Кроме того, препарат биосенсора поставляется лишь при условии изначального приобретения прибора экологического контроля «Биотоке-10М».

Известны штаммы Vibrio fischeri ВКПМ В-9580 и Vibrio fischeri ВКПМ В-9579, выделенные из воды Черного моря, которые могут быть использованы для тестирования токсичности окружающей среды (7) (8).

В качестве прототипа выбран штамм Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 (8). Биотестирование основано на определении изменения интенсивности биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем.

Чувствительность данного штамма к токсическим веществам недостаточно высокая, в частности известный штамм недостаточно достоверно определяет наличие токсических веществ в концентрациях на уровне ПДК и ниже.

Раскрытие изобретения

Целью данного изобретения является получение нового, доступного и дешевого штамма бактерий, характеризующегося высокой чувствительностью биолюминесценции к действию токсических веществ самой разнообразной химической природы.

Для достижения поставленной цели предложен штамм бактерий Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 (Vibrio aquamarinus DSM 26054), выделенный из воды Черного моря, отобранной в районе Абрау-Дюрсо.

Одним из воплощений настоящего изобретения является штамм бактерий Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 (Vibrio aquamarinus DSM 26054) для определения токсичности проб.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к способу определения токсичности проб, включающий измерение люминесценции штамма бактерий Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 (Vibrio aquamarinus DSM 26054) в присутствии по меньшей мере одного токсиканта пробы, измерение люминесценции указанного штамма в отсутствии токсиканта и сравнение измеренных уровней люминесценции.

В другом воплощении настоящего изобретения вышеуказанным способом определяют токсичность проб окружающей среды.

В еще одном воплощении настоящего изобретения токсикант представляет собой ZnSO₄, CuSO ₄ или K₂Cr₂O₇. Также токсикант может представлять собой нефтепродукт, полихлорированный бифенил или тяжелый металл.

Также настоящее изобретения в одном из воплощений представляет собой применение штамма бактерий Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 (Vibrio aquamarinus DSM 26054) в качестве тест-культуры для определения токсичности проб.

Осуществление изобретения

Для выделения штамма биолюминесцентных бактерий из морской воды использовали метод мембранных фильтров. Бактерии концентрировали из анализируемой воды на мембранный фильтр и затем выращивали их на селективных средах для светящихся бактерий. Выделение биолюминесцентных бактерий проводили, визуально анализируя наличие биолюминесценции. При обнаружении люминесценции выделяли чистую культуру бактерий стандартными методами.

Определение проводили по результатам анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК. По результатам проведенного анализа тестируемый штамм микроорганизм относится к роду Vibrio (гомология 98%).

Новый биолюминесцентный штамм был фенотипически и генотипически охарактеризован. Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определителе бактерий Bergey (9).

Для окончательного установления вида штамма выполнена идентификация по генетическим характеристикам во ФГУП «ГосНИИГенетика», ВКПМ. Определение проводили по результатам анализа секвенсов вариабельных участков 16S рДНК.

Филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей 16S rRNA, показал, что данный штамм относится к новому неизвестному виду рода Vibrio. На основании всех этих данных штамм был отнесен к новому виду, который получил название Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 {Vibrio aquamarinus DSM 26054).

Данный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками: клетки диаметром около 1-1,5 мкм и длиной 2-3 мкм, прямые, слегка изогнутые палочки, подвижные за счет единственного полярного жгутика. Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах. На TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar) колонии зеленого цвета, 3-5 мм в диаметре. На среде LB с с добавлением 1,7% NaCl растет в виде люминесцирующих полупрозрачных колоний округлой формы, с ровным краем, желтоватого цвета. Для роста нуждаются в присутствии в среде от 0,5 до 5% (оптимум 1-4%) NaCl (w/v), но не при 8 или 10%; и температурах 10-35°С (оптимум 20-25°С).

Физиолого-биохимические признаки: факультативный анаэроб. Грамотрицательный, оксидазоположительный, каталазоположительный. По образованию индола положительный. Сероводород не образует. Желатин не гидролизует. Крахмал гидролизует. Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) отрицательная.

Положительный по следующей ферментативной активности: Ala-Phe-Pro-ариламидаза, -глюкозидаза, L-пролинариламидаза, амилаза, нитратредуктаза.

Отрицательный по следующей ферментативной активности: L-пирролидонариламидаза, D-целлобиоза, -галактозидаза, -N-ацетилглюкозаминидаза, глютамилариламидаза pNA, -глютамилтрансфераза, -ксилозидаза, -аланинариламидаза pNA, липаза, палатиноза, тирозинариламидаза, уреаза, -глюкозидаза, -N-ацетилгалактозаминидаза, -галактозидаза, фосфатаза, глицинариламидаза, орнитиндекарбоксилаза, лизиндекарбоксилаза, -глюкуронидаза, Glu-Gly-Arg-ариламидаза, дезаминаза фенилаланина, аргининдегидролаза, желатиназа.

Катаболизирует такие углеводы, как D-глюкоза, D-мальтоза. Не утилизирует D-целлобиозу, арабинозу, D-маннозу, рамнозу, D-тагатозу, D-трегалозу, сахарозу, раффинозу, лактозу. Не утилизирует спирты адонитол, L-арабит, D-маннит, D-сорбит, инозит, дульцит, а также следующие соли: малонат, 3-кето-В-глюконат, L-лактат, сукцинат, L-малат, цитрат (натрия).

Не устойчив к O/129 (2,4-диамино-6,7-диизопропилптеридин) вибриостатическому агенту.

Штамм не обладает токсичными и патогенными свойствами. Излучает свет, визуально регистрируемый в темноте. Спектр люминесценции Vibrio aquamarinus приходится на «синюю» область. Максимум спектра биолюминесценции составляет 478 нм.

Хранится штамм на питательном агаре с 3% NaCl, pH 7,2-7,4.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма:

- хранение бактерий в морозильной камере холодильника-рефрижератора при температуре -18°С в питательном бульоне с 1,7% NaCl, содержащем в качестве криопротектора стерильный глицерин;

- хранение бактерий в низкотемпературном холодильнике при температуре -60°С в питательном бульоне с 3,0% NaCl, содержащем в качестве криопротектора стерильный глицерин;

- замораживание клеток в жидком азоте в питательном бульоне с 1.7% NaCl, содержащем в качестве криопротектора стерильный глицерин;

- в герметично запаянных ампулах в лиофильно-высушенном состоянии.

Размножение культуры осуществляется путем пересева на питательный агар с 3,0% NaCl.

Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для биотестирования токсичности, так как характеризуется высокой чувствительностью биолюминесценции к действию широкого спектра токсикантов.

Пример 1

Реализация использования штамма бактерий Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 в качестве тест-культуры для определения токсичности факторов среды химического происхождения была проведена на токсикантах ZnSO₄, CuSO₄, KiCr₂ O₇. додецилсульфата натрия (ДСН) и фенола.

Штамм Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 выращивали на LB-агаре с 3,0% NaCl при температуре 25°С в течение ночи.

Затем готовили суспензию ночной культуры светящихся бактерий. Для этого ночную культуру разводили при помощи денситометра DEN-1 («BioSan») до мутности 1 единица Мак-Фарланда (концентрация 3·10⁸ клеток/мл). Затем разбавляли суспензию в 100 раз. Суспензия бактерий готовилась таким образом, чтобы конечная концентрация NaCl составила 3%; глюкозы - 0,01% в 0,001 М трис-HCl буфере (рН 7,4).

Аликвоты культуры по 180 мкл переносили в лунки, часть из них служила контролем (в них добавляли 20 мкл дистиллированной воды). В другие лунки вносили по 20 мкл растворов токсикантов.

Измерение люминесценции проводилось на микропланшетном люминометре LM-01T (Immunotech). Измерение проводилось в течение 35 минут с интервалом между измерениями 5 мин при температуре 20-25°С.

Результаты измерений интенсивности биолюминесценции представляли в условных единицах свечения (уес).

Оценку токсичности пробы проводили по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб. Для сравнительной оценки чувствительности использовали характеристику ЕС50 (effective concentration) - концентрацию вещества, вызывающую 50% снижение биолюминесценции бактериальной суспензии.

Полученные данные по чувствительности штаммов светящихся бактерий (средние значения ЕС₅₀) ко всем исследованным токсикантам представлены в таблице 1. В таблице также приводятся данные по чувствительности к этим же токсикантам lux-штамма Vibrio jischeri ВКПМ В-9579.

Сравнение чувствительности биолюминесценции штаммов к исследованным токсическим веществам показало, что штамм Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 более чувствителен, чем Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 (по средним значениям ЕС₅₀).

Таблица 1
	ЕС 50, мг/л
Штамм	ZnSO 4	CuSO4	ДСН	K2Cr2O7	Фенол
Vibrio aquamarinus ВКПМ B-11245	0,3	0,4	10	1-10	225-275
Vibrio fischeri	2-3	1-1,5	150	10-50	125-150
ВКПМ В-9579

Величина ЕС₅₀ для ZnSO₄·7H₂O у штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 составляет 0,3 мг/л (концентрация цинка составляет 0,068 мг/л), а концентрация ЕС₅₀ для CuSO₄ ·3H₂O - 0,4 мг/л (соответственно, концентрация меди составляет 0,102 мг/л).

Величина ЕС₅₀ у штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ B-11245 для бихромата калия находится в диапазоне концентраций от 1 до 10 мг/л.

Для фенола величина EC₅₀ для штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 составила 225-275 мг.

По сравнению с биосенсорным штаммом Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 (по нижней границе его чувствительности) штамм Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 более чувствителен к ZnSO₄ (в 7 раз), CuSO₄ (в 2,5 раза), ДСН (в 15 раз). К бихромату калия штамм Vibrio aquamarinus ВКПМ B-11245 более чувствителен (в 10 раз). К фенолу Vibrio aquamarinus немного менее чувствителен.

Высокая чувствительность Vibrio aquamarinus ВКПМ B-11245 свидетельствует о перспективности использования данного штамма для определения токсичности водных сред.

Пример 2

Несомненный интерес представляет реакция светящихся бактерий на низкие концентрации загрязнителей, сопоставимые с уровнем ПДК и ниже, что позволяет использовать этот штамм как тест-культуру при определении низких концентраций загрязнителей.

Были проведены измерения чувствительности биолюминесценции выделенных штаммов к действию токсических факторов химического происхождения в очень низкой концентрации. Использовались следующие токсиканты: ZnSO₄, CuSO₄, K2Cr2O7.

Тестирование токсичности проводили, как описывается в примере 1.

В таблице 2 представлены данные по чувствительности биолюминесценции Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 к вышеуказанным токсикантам в диапазоне концентраций от 0,00001 мг/л до 1,0 мг/л.

Как видно из таблицы 2, низкие концентрации токсикантов вызывают у Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 стабильную индукцию биолюминесценции.

Медь в концентрации 0,001-0,005 мг/л (ПДК меди - 0,005 мг/л для морской воды) повышает интенсивность люминесценции в пределах 35-32%.

Цинк в концентрации 0,001-0,005 мг/л (ПДК цинка - 0,05 мг/л для морской воды) повышает интенсивность биолюминесценции штамма в пределах 19-31%.

Бихромат калия (ПДК 0,05 мг/л), в концентрации 0,001-0,005 мг/л повышает интенсивность биолюминесценции штамма примерно на 38-35%.

Следует отметить, что заметная индукция свечения штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 наблюдалась на уровне ПДК токсикантов (10) для меди и бихромата калия, а также ниже ПДК - для меди, цинка и бихромата калия.

По данным, приведенным в патенте (8), для Vibrio fischeri ВКПМ В-9579 были зарегистрированы следующие показатели:

Медь в концентрации 0,001-0,005 мг/л увеличила люминесценцию в пределах 36-42%. Цинк в концентрации 0,001-0,01 мг/л повысил интенсивность биолюминесценции штамма в пределах 18-26%. Бихромат калия в концентрации 0,001-0,01 мг/л повысил интенсивность биолюминесценции штамма примерно на 30%.

Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245, по сравнению с биосенсорным штаммом Vibrio jischeri ВКПМ В-9579, более чувствителен к концентрациям токсикантов на уровне ПДК и ниже - величина индукции свечения штамма зачастую достигает большей величины и регистрируется при более низких концентрациях веществ.

Полученные данные свидетельствует о высокой чувствительности штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 и перспективности его использования для определения токсичности компонентов водной среды.

Пример 3

Были проведены эксперименты по использованию штамма бактерий Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 в качестве тест-культуры на токсичность нефтепродуктов.

Были апробированы нефть, дизельное топливо и подсланевая (льяльная) вода из машинного отделения судна в концентрациях от 0,00001 мг/л до 5,0 г/л.

Тестирование токсичности проводили, как описывается в примере 1.

Полученные данные по чувствительности биолюминесценции штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 ко всем исследованным нефтепродуктам представлены в таблице 3.

Нефть, начиная с концентраций ниже ПДК нефти (0,05 мг/л), подавляла свечение Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245. В концентрации 0,05 мг/л (ПДК) снижение интенсивности свечения достигало 13%.

Льяльные воды и дизельное топливо также подавляли свечение этого штамма, начиная с концентраций, ниже уровня ПДК. На уровне ПДК (0,05 мг/л) подавление свечения составляло 36% и 20%, соответственно.

Величина ЕС₅₀ для нефти, дизельного топлива и льяльных вод составила 100 мг/л.

Величина ЕС₅₀ для нефти, дизельного топлива и льяльных вод для штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579, по всей видимости, составляет более 1000 мг/л.

Сравнение чувствительности штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 и Vibrio jlscheri ВКПМ В-9579 (8) свидетельствует о более высокой чувствительности штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 и перспективности его использования для определения токсичности компонентов среды морских водоемов.

Таблица 2
Название токсиканта	Контроль	Концентрация токсиканта, мг/л
		0,00001	0,0001	0,001	0,005	0,01	0,05	0,1	1
	Интенсивность биолюминесценции Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245, уес
Медь	349	359	394	473	461	356,5	221,5	188,5	38,5
Цинк	349	351	361	417	456	398	309	294,5	97
K2Cr7O7	349	365,5	451	481	473	460	397	346,5	181,5
	Интенсивность биолюминесценции Vibrio fischeri ВКПМ В-9579, уес
Медь	1,62	2,15	2,22	2,3*	2,2	2,08	1,83	1,69	0,803
Цинк	0,444	0,495	0,519	0,526	0,540	0,559	0,500	0,520	0,385
K2Cr2O7	0,430	0,512	0,545	0,562	0,575	0,557	0,553	0,544	0,552

Таблица 3
Название нефтепродукта	Концентрация нефтепродукта, мг/л
	Контроль	0,01	0,05	0,1	0,5	1	5	10	50	100	1000	5000
	Интенсивность биолюминесценции штамма Vibrio aquamarinus, yec
нефть	661	617,5	577	546,5	542	551,5	503	486,5	498,5	361,5	284,5	138
дизельное топливо	661	438	421	416	407	400	399,	396	382,5	350,5	336,5	197,5
льяльная вода	661	538,5	531	531	498	451,5	426,5	446,5	432,5	343,5	309	214
	Интенсивность биолюминесценции штамма Vibrio fischeri ВКПМ В-9579, yec
нефть	0,30	0,49		0,62		0,64		0,56		0,56	0,36
дизельное топливо	0,34	0,52		0,52		0,63		0,55		0,54	0,36
льяльная вода	0,31	0,45		0,46		0,48		0,53		0,54	0,30

Пример 4.

Для определения токсичности природных проб с помощью штамма бактерий Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 были взяты образцы донных отложений морских водоемов.

Образец с высоким содержанием тяжелых металлов и полихлорированных бифенилов был отобран в районе с высокой антропогенной нагрузкой на акватории Черного моря в порту г.Туапсе.

Другой грунт для биотестирования был отобран в условно чистом районе Черного моря в районе с.Архипо-Осиповка.

Тестирование токсичности проводили, как описывается в примере 1.

В таблице 4 представлены результаты биотестирования токсичности усредненных проб грунтов, отобранных в условно чистом районе моря и на акватории порта. В качестве контроля использовали 3,0% раствор NaCl.

Таблица 4
Район отбора донных отложений	Интенсивность биолюминесценции Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245, уес
	контроль	опыт	отклонение от контроля, %
Акватория в районе с.Архипо-Осиповка	1023	812	20,6
Порт г.Туапсе	1798	851	52,7

Из таблицы 3 следует, что интенсивность биолюминесценции водного экстракта донных отложений, отобранных в условно чистом районе Черного моря, превышала контрольный уровень на 20,6%, а интенсивность свечения пробы с экстрактом грунта из акватории морского порта - на 52,7%. Полученные данные свидетельствуют о чувствительности биолюминесценции штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 к действию токсикантов, присутствующих в донных отложениях морских водоемов.

Таким образом, тестирование токсичности одного из основных компонентов среды - донных отложений, продемонстрировало возможность использования предложенного штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 в качестве тест-культуры.

Источники информации

1. И.Ю.Малыгина, А.М.Кацев. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей. Экология моря. 2003. Вып.64.

2. КНД 211.1.4.060-97. Визначення токсичностi води на бактерiях Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford. - 21.05.97.

3. ТУ 6-09-20-236-93.

4. МР № 11-1/133-09. Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста «Эколюм».

5. МР № 11-1/134-09. Определение общей токсичности почв по интенсивности биолюминесценции бактерий.

6. МР № 11-1/131-09. Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста.

7. Патент RU 2346035, МПК C12N 1/20, C12R 1/01.

8. Патент RU 2342434, МПК C12Q 1/02, C12R 1/63 (прототип).

9. Определитель бактерий Берджи. Т.1. / Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, С.Уильямса. - М.: Мир, 1997. - 432 с.; Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Дж.Хоулта. - М.: Мир, 1980. - 496 с.

10. Нормативы качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативы предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения". - Утв. Приказом Росрыболовства от 18.01.2010. № 20. - 214 с.