штамм гриба penicillium verruculosum b10 egii продуцент эндо-1.3/1.4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата
Классы МПК: | C12N1/15 модифицированные введением чужеродного генетического материала C12R1/80 Penicillium C12N15/52 гены, кодирующие ферменты или проферменты C12P1/02 микробных грибков |
Автор(ы): | Окунев Олег Николаевич (RU), Беккаревич Александра Олеговна (RU), Матыс Вероника Юрьевна (RU), Бубнова Тамара Викторовна (RU), Кошелев Анатолий Владимирович (RU), Немашкалов Виталий Алексеевич (RU), Рожкова Александра Михайловна (RU), Синицын Аракадий Пантелеймонович (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2012-09-19 публикация патента:
10.11.2014 |
Изобретения касаются штамма гриба Penicillium verruculosum B10 EGII и способа получения кормового комплексного ферментного препарата. Представленный штамм является продуцентом эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы, целлюлазы, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазы и ксиланазы. Получен на основе штамма Penicillium verruculosum ВКМ F-3764D, путем трансформации его плазмидами pSTA10 и pPrCBHI-EGII. В плазмиде pPrCBHI-EGII нуклеотидная последовательность структурного гена эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы Penicillium verruculosum совмещена с нуклеотидными последовательностями промоторной области, сигнального пептида и терминатора гена cbhI целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum. Способ получения препарата, содержащего эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазу, целлюлазу, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазу и ксиланазу включает культивирование штамма гриба Penicillium verruculosum B10 EGII на оптимизированной питательной среде в ферментере и фильтрацию, ультрафильтрацию и лиофилизацию культуральной жидкости. Охарактеризованные изобретения могут быть использованы для получения кормового комплексного ферментного препарата, обогащенного эндоглюканазой. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 5 пр.
Формула изобретения
1. Штамм гриба Penicillium verruculosum B10 EGII продуцент эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы, целлюлазы, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазы и ксиланазы, полученный на основе штамма Penicillium verruculosum ВКМ F-3764D, путем трансформации его плазмидами pSTA10 и pPrCBHI-EGII, представленной на фиг.1, в которой нуклеотидная последовательность структурного гена эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы Penicillium verruculosum совмещена с нуклеотидными последовательностями промоторной области, сигнального пептида и терминатора гена cbhI целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum.
2. Способ получения кормового комплексного ферментного препарата, содержащего эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазу, целлюлазу, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="/images/img_patents/2/2532/2532838/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазу и ксиланазу, путем культивирования штамма гриба Penicillium verruculosum B10 EGII по п.1 на оптимизированной питательной среде в ферментерах с последующей фильтрацией, ультрафильтрацией и лиофилизацией культуральной жидкости.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологической промышленности, представляет собой способ получения кормового комплексного ферментного препарата с высокой эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазной активностью путем культивирования рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum - продуцента гомологичной эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы.
Эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканаза является одним из ключевых кормовых ферментов и гидролизует -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканы - некрахмальные полисахариды клеточной стенки зерна злаковых (ржи, овса, ячменя), за счет чего улучшается доступ пищеварительных ферментов животных и птиц к питательным компонентам корма. При этом уменьшается вязкость кормовой массы и облегчается ее прохождение через желудочно-кишечный тракт животных. Пищеварительные ферменты животных и птиц не содержат целлюлолитических ферментов, участвующих в расщеплении целлюлозы - основного некрахмального полисахарида растительной клеточной стенки. Наличие длинных неперевариваемых молекул целлюлозы значительно снижает питательную ценность кормов и ухудшает процессы всасывания в кишечнике. Некоторые грибные эндо-1,3- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы расщепляют не только 1,3- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -, но и 4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидные связи, проявляя также и целлюлазную активность, и, следовательно, участвуют в расщеплении целлюлозы. В результате этого улучшается доступ пищеварительных ферментов сельскохозяйственных животных к основным питательным компонентам корма - крахмалу и белку, - и значительно повышается усвояемость кормов.
Современные кормовые ферментные препараты невозможно представить без наличия в них -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы, а также ксиланазы, пектинлиазы и других ферментов. Продуцентами этих ферментов являются, в основном, мицелиальные грибы. Известны патенты на различные виды и штаммы грибов, как природного происхождения, так и рекомбинантные штаммы, созданные с использованием генно-инженерных манипуляций. Природные штаммы не содержат чужеродной ДНК, не присущей изначально данному штамму, однако ферментный спектр у них не всегда идеальный для создания кормовых препаратов с заданными свойствами. Поэтому рекомбинантные штаммы грибов находят все большее применение в современной технологии производства кормовых добавок.
В последнее время повышенное внимание уделяется мультикопийным грибным продуцентам секретируемых ферментов, у которых продуктивность штаммов значительно повышалась за счет амплификации копий генов, кодирующих эти ферменты. Это относится и к кормовым ферментам. В качестве продуцентов -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканаз, используемых в качестве кормовых ферментов, заявлены культуры Trichoderma longibrachiatum (US Patent 5419778), Tr. reesei (WO Patent 94/28117), Humicola insolens (WO Patent 91/17243), Penicillium emersonii (US Patent 388072), Penicillium canescens (RU Патент 2288267), Penicillium funiculosum (RU Патент 2287570). Известны грибные продуценты ксиланаз - Aspergillus niger (US Patent 5358862), Tr. Reesei (Nevalainen et.al, US Patent 5298405), H.insolens (Schulein et al., 1997, US Patent 5610048).
Продуцентом целлюлаз и сопутствующих ферментов является штамм гриба Penicillium verruculosum, продуцирующий комплекс целлюлаз, ксиланаз и ксилоглюканаз для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы (RU Patent 2361918).
Наиболее близкими по технической сущности к предлагаемому изобретению является патент RU № 2378372 «Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба Penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба Penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата».
Техническая задача, на решение которой направлено разработанное изобретение, - получение с помощью рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum кормового комплексного ферментного препарата, обогащенного эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазой и содержащего -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазу, целлюлазу и ксиланазу.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в получении кормового комплексного ферментного препарата с высокой эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазной активностью и содержащего также сопутствующие ферменты при культивировании нового мультикопийного штамма гриба Penicillium verruculosum продуцента гомологичной эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы.
Для получения указанного технического результата предлагается использовать новый мутантный штамм Penicillium verruculosum В10 с повышенной активностью -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -1,4-глюкозидазы, синтезирующий также целлюлазы и ксиланазы, и генетическую конструкцию, обеспечивающую экспрессию гомологичного гена эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы в клетках грибного штамма Penicillium verruculosum В10, используемого в качестве хозяина.
Кроме того, для получения указанного технического результата предложено использовать способ получения ферментного препарата, обогащенного гомологичной эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазой и содержащего сопутствующие ферменты -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазу, целлюлазы и ксиланазы, путем культивирования указанного выше нового штамма гриба Penicillium verruculosum (B10 EGII), мультикопийного по гомологичному гену 1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы, на оптимизированной питательной среде в ферментерах с последующей фильтрацией, ультрафильтрацией и лиофилизацией культуральной жидкости.
Указанные варианты не исчерпывают возможности разработанного метода.
Разработка способа получения комплексного ферментного препарата, обогащенного эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазой, осуществляется путем выполнения нескольких последовательных этапов.
Этап 1. Путем селекции и многоступенчатого мутагенеза из исходного штамма Penicillium verruculosum ВКМ F-3764D получают штамм В10 с повышенной активностью -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -1,4-глюкозидазы и синтезирующий также внеклеточные целлюлазы, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы и ксиланазы.
Этап 2. Методом мутагенеза Penicillium verruculosum В10 получают реципиентный штамм Penicillium verruculosum B10 NiaD-, ауксотрофный по гену нитратредуктазы (NiaD) и сохранивший способность к синтезу внеклеточных ферментов, включая -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазу, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы, целлюлазы и ксиланазы.
Этап 3. Путем клонирования в фаговом векторе выделяют фрагмент ДНК Penicillium verruculosum, кодирующий ген секретируемой эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы. Включают этот фрагмент ДНК в структуру векторной молекулы. Получают экспрессионную плазмиду pPrCBHI-EGII (рис.1), в которой нуклеотидная последовательность структурного гена эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы Penicillium verruculosum совмещена с нуклеотидной последовательностью промоторной области, сигнального пептида и терминатора гена cbhl целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum.
Этап 4. Полученной экспрессионной плазмидой с включенным геном эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы проводят котрансформацию штамма Penicillium verruculosum B10 NiaD-, вместе с плазмидой, несущей последовательность NiaD гена, как маркера селекции, получают трансформанты Penicillium verruculosum B10 EGII и осуществляют отбор клонов, секретирующих в культуральную среду эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы. Проводят культивирование отобранных трансформантов и выбирают наиболее продуктивный клон.
Этап 5. Проводят процесс культивирования наиболее активного рекомбинантного штамма продуцента эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы на оптимизированной питательной среде в ферментерах и из культуральной жидкости с помощью фильтрации, ультрафильтрации и лиофилизации получают ферментные препараты.
Штаммы мицелиального гриба Penicillium verruculosum B10 EGII депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под номером соответственно ВКМ F-4472D.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. С помощью селекции и многоступенчатого мутагенеза из исходного штамма Penicillium verruculosum ВКМ F-3764D получают мутант с повышенной способностью к биосинтезу -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазы при культивировании на твердых и в жидких средах. При этом сохраняется высокая активность других карбогидраз, целлюлазы (КМЦ-азы), -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы и ксиланазы. Кроме того, при культивировании на среде с глюкозой (1-2%) биосинтез карбогидраз у полученного мутанта снижается незначительно, т.е. он устойчив к катаболитной репрессии.
Далее получают посевной материал гриба на сусло- или СМ-агаре (29°С, 7 суток и при комнатной температуре 7 суток), затем суспензией спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% Твина 80, засевают в качалочные колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие 100 мл среды для культивирования следующего состава (в г/л): МКЦ - 40, пшеничные отруби - 10, дрожжевой экстракт - 10, (NH4)2SO4 - 5, КН 2РО4 - 5, MgSO4×7H2 O - 0,3, СаСl2×2Н2O - 0,3, рН 4,5. Колбы инкубируют на качалке (200 об/мин) при 30°С в течение 120-144 ч. После окончания культивирования в колбах -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазная активность составляет 80-100 ед./мл, КМЦ-азная активность - 20-30 ед./мл, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазная активность - 15-20 ед./мл, и ксиланазная активность -40-50 ед./мл.
Затем проводят культивирование мутанта Penicillium verruculosum В10 в ферментерах (1- и 10-литровых с рабочим объемом 0,7 и 7,0 л соответственно и содержащих среду того же состава, что и качалочные колбы) при рН 4,5-5,0, температуре 30°С и оборотах мешалки 400 об/мин., время культивирования 120-144 час.Через 32 часа после начала ферментации (и до конца ферментации) осуществляют подпитку глюкозой в режиме fed batch. После окончания культивирования в ферментере -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазная активность составляет 650-700 ед./мл, КМЦ-азная активность - 550-600 ед./мл, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазная активность - 600-650 ед./мл и ксиланазная активность -700-750 ед./мл.
После окончания ферментации культуральную жидкость, содержащую целлюлазный комплекс и сопутствующие ферменты, собирают и подвергают ультрафильтрации на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа), ультраконцентрат лиофильно высушивают с получением сухого ферментного препарата.
-глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазная активность сухого ферментного препарата составляет 5200-5700 ед./г, КМЦ-азная активность - 4500-5000 ед./г, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазная активность - 4500-5000 ед./г, ксиланазная активность -5500-6000 ед./г.
Пример 2. Методом мутагенеза Penicillium verruculosum В10 получают реципиентный штамм Penicillium verruculosum В10 NiaD-, ауксотрофный по гену нитратредуктазы (NiaD) и сохранивший способность к синтезу внеклеточных ферментов, включая -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазу, целлюлазы и ксиланазы.
С этой целью споровую суспензию гриба Penicillium verruculosum В10 подвергают облучению (УФ), затем проводят селекцию мутантов на среде с хлоратом натрия, отбирают колонии, которые растут на среде с NH4CI и усваивают другие формы азота, кроме NaNCb, и отбирают штамм Penicillium verruculosum В10-53 NiaD-, который не отличается от исходного штамма ни по биохимическим, ни по морфологическим и ни по биотехнологическим (продукция ферментов) признакам.
На заключительном этапе проводят трансформацию полученного мутанта Penicillium verruculosum В10-53 NiaD- плазмидой pSTA10, несущей ген нитратредуктазы (niaD+) Aspergillus niger, для возврата штамма к способности расти на среде с NaNO 3. Она необходима для комплементации ауксотрофного признака NiaD- в штамме-реципиенте для возврата штамма к прототрофности, (в данном случае к способности расти на среде с NaNO3 ).
Далее проверяют аксотрофный мутант Penicillium verruculosum В10-53 NiaD- на способность к продукции карбогидраз при культивировании в колбах и в ферментере, как описано в примере 1. По продукции целевого (эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> глюканазы) и сопутствующих (целлюлазы, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазы и ксиланазы) ферментов реципиентный штамм не отличается от исходного Penicillium verruculosum В10.
Пример 3. Путем клонирования в фаговом векторе выделяют фрагмент ДНК Penicillium verruculosum, кодирующий ген секретируемой эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы. Включают этот фрагмент ДНК в структуру векторной молекулы. Получают экспрессионную плазмиду pPrCBHI-EGII (Фиг.1), в которой нуклеотидная последовательность структурного гена эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы Penicillium verruculosum совмещена с нуклеотидными последовательностями промоторной области, сигнального пептида и терминатора гена cbhI целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum.
Карта кольцевой формы трансформационной плазмиды pPrCBHI-EGII, несущей целевой ген гомологичной эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы (EGII) Penicillium verruculosum, представлена на Фиг.1
Полученной экспрессионной плазмидой (10-20 мкг) с включенным геном эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы проводят котрансформацию штамма Penicillium verruculosum В10, вместе с плазмидой (1-3 мкг), несущей последовательность NiaD гена, как маркера селекции, получают NiaD- трансформанты Penicillium verruculosum BIO EGII и осуществляют отбор клонов, с повышенной секрецией эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы.
Сначала трансформанты пересевают на чашки с минимальной средой с NaNO3 в качестве источника азота, инкубируют 140 часов при температуре 30°С до образования спор. Затем трансформанты культивируют в качалочных колбах, как указано в примере № 1. Далее отбирают трансформанты с увеличенной по сравнению с реципиентным штаммом эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазной активностью. Эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазную активность определяют по гидролизу -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкана ячменя.
При анализе культуральной жидкости отобранных трансформантов, проведенном с помощью ДДС-электрофореза в денатурирующих условиях, обнаружено увеличение количества белка полосы, соответствующего эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазе (36 кДа).
На следующем этапе проводят ферментацию наиболее активных трансформантов в 1- и 10-литровых ферментерах, используя среду и условия культивирования, как описано в примере № 1. После окончания культивирования в ферментере эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюказная активность составляет 1200-1250 ед./мл, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазная активность - 350-400 ед./мл, КМЦ-азная активность - 1100-1200 ед./мл, ксиланазная активность -200-250 ед./мл.
После окончания ферментации культуральную жидкость, содержащую эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазу и сопутствующие ферменты, собирают и подвергают ультрафильтрации на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа), ультраконцентрат лиофильно высушивают с получением сухого ферментного препарата. Эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазная активность сухого ферментного препарата составляет 17000-18000 ед./г, КМЦ-азная активность - 16000-17000 ед./г, -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазная активность - 5400-5500 ед./г, ксиланазная активность -3200-3500 ед./г.
Пример 4. Сравнительный анализ удельной активности ферментного комплекса Penicillium verruculosum В10 EGII.
С этой целью активности эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазы и сопутствующих ферментов, полученные, как указано выше, сравнивают с аналогичными ферментами коммерческих препаратов ферментов различных компаний, полученных с помощью штаммов-продуцентов мицелиальных грибов рода Trichoderma. При этом используют ферментативные препараты и методики, приведенные ниже.
Для анализа активности используют следующие коммерческие (промышленные) и лабораторные ферментные препараты: ферментные препараты Ксибетен-цел и Ксибетен-ксил (T.longibrachiatum) компании ООО «Промфермент» (Россия), препарат BioACE компании Dyadic International Ltd., США (T.longibrachiatum), препарат Celluclast 1.5L (T.reesei) компании Novozymes. Удельные активности ферментных препаратов (в ед./мг) приведены в таблице 1.
Таблица 1 | |||
Ферментный препарат | КМЦ-аза (эндо-l,3/l,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканаза) | Ксиланаза | -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидаза |
P.verruculosum B10 EGII | 17,6 | 11,8 | 7,3 |
P.verruculosum В10 | 11,6 | 21,2 | 18,10 |
Ксибетен-цел (Trichoderma) | 11,3 | .2,1 | 0,44 |
Ксибетен-ксил (Trichoderma) | 10,2 | 33,7 | 0,18 |
BioACE | 4,7 | 0,9 | 0,14 |
Celluclast 1.5 L | 14,0 | 2,1 | 0,19 |
Из данных таблицы 1 очевидно, что наибольшую удельную активность эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазаы проявляет ферментный препарат, полученный с помощью заявляемого штамма Penicillium verruculosum В10 EGII. При этом новый ферментный препарат сохраняет высокую активность целлюлазы (КМЦ-азы) и особенно -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазы и ксиланазы.
Пример 5. Проверка сухих препаратов с помощью смоделированных лабораторных кормовых тестов. Эффективность полученных с помощью нового штамма-продуцента Penicillium verruculosum В10 EGII ферментных препаратов, обогащенных эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазой, проверяют с помощью кормовых тестов. В качестве модельных кормовых субстратов использовали смесь пшеничной и ячменной муки (в соотношении 60:40 по весу) и пшеничные отруби. Методика оценки эффективности действия ферментных препаратов основана на измерении концентрации восстанавливающих сахаров (ВС), освобождающихся при гидролизе модельных кормов. При этом используют ферментные препараты и методики, описанные ниже.
Таблица 2 | ||
Ферментный препарат | [ВС], г/л | |
Пшеница:ячмень 40:60 | Пшеничные отруби | |
P.verruculosum ЭГП- EGII | 1,29±0,09 | 1,45±0,1 |
P.verruculosum В10 | 1,28±0,08 | 1,27±0,06 |
Ксибетен-цел | 0,95±0,05 | 1,30±0,09 |
Ксибетен-ксил | 1,14±0,1 | 1,35±0,1 |
Из данных таблицы 2 очевидно, что наибольшую активность при гидролизе обоих модельных субстратов проявляют ферментные препараты, полученные с помощью нового штамма-продуцента Penicillium verruculosum В10 EGII.
Методы определения активности. Эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазную активность измеряют, проводя гидролиз 1%-ного раствора -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкана ячменя при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 5 минут. За единицу -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 под действием на -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкан вызывает образование количества ВС, эквивалентного 1 микромолю глюкозы, определяемого методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).
Целлюлазную (КМЦ-азную) активность измеряют, проводя гидролиз водорастворимой Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу эндоглюканазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора КМЦ концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентного 1 микромолю глюкозы, определяемого методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).
6-Глюкозидазную активность измеряют, проводя гидролиз 0,5 мг/мл п-нитрофенил- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -D-глюкозида (пНФГ) при рН 5,0 (0,05 М ацетатный буфер) и 40°С в течение 10 минут. Реакцию останавливают 1 М Na 2CO3, после чего измеряют оптическую плотность при 400 нм. За единицу -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при рН 5,0 и 40°С приводит к образованию 1 микромоля п-нитрофенола.
Ксиланазную активность измеряют проводя гидролиз березового ксилана (5 мг/мл) при рН 5,0 (0,1 М ацетатный буфер) и 50°С в течение 10 минут. За единицу ксиланазной активности принимают такое количество фермента, которое в течение 1 минуты при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора ксилана концентрацией 5 мг/мл приводит к образованию количества ВС, эквивалентного 1 микромолю ксилозы, определяемого методом Сомоджи-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156).
Лабораторные кормовые тесты. Методика оценки эффективности действия ферментных препаратов основана на измерении концентрации восстанавливающих сахаров методом Шомоди-Нельсона (А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156) при гидролизе модельных кормов. В качестве модельных кормовых субстратов использовали смесь пшеничной и ячменной муки (в соотношении 60:40 по весу) и пшеничные отруби. Перед использованием корма тщательно измельчают на механической мельнице и просеивают через сито с размером ячеек 0,14 мм. Концентрация кормов в реакционной смеси составляет 50 мг/мл. Гидролиз кормов проводят при 40°С, рН 5.0, 250 об/мин, в течение 3 часов. Сравнение эффективности действия различных ферментных препаратов на природные корма осуществляется при следующих нормировочных условиях: при равной дозе сухих препаратов по весу.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет осущеставить получение с помощью культивирования нового рекомбинантного штамма Penicillium verruculosum, трансформированного фрагментами ДНК с клонированым гомологичным геном, кормовых комплексных ферментных препаратов, обогащенных эндо-1,3/1,4- -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюканазную, содержащих -глюканазы, целлюлазы, -глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата, патент № 2532840" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -глюкозидазу, целлюлазу и ксиланазу и гидролизующих некрахмальные полисахариды клеточной стенки зерна злаковых (ржи, овса, ячменя), за счет чего улучшается доступ пищеварительных ферментов животных и птиц к питательным компонентам корма.
Класс C12N1/15 модифицированные введением чужеродного генетического материала
Класс C12N15/52 гены, кодирующие ферменты или проферменты
Класс C12P1/02 микробных грибков