ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях in vitro

Классы МПК:A01H4/00 Разведение растений из тканевых культур
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):НИКИТСКИЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД - НАЦИОНАЛЬНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2014-06-19
публикация патента:

Способ регенерации адвентивных микропобегов Hyssopus officinalis L. в условиях in vitro включает отделение листьевых дисков от микропобегов после 4-5 пассажа, полученных в культуре in vitro, дальнейшее культивирование их на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией макроэлементов и дополненной веществом цитокининового типа действия, а именно тидиазуроном, при этом культивирование проводят при пониженной интенсивности освещения. 4 табл.

Изобретение относится к биотехнологии получения посадочного материала и может быть использовано для быстрого размножения, селекции и генетических манипуляций иссопа (Hyssopus officinalis L.) в условиях in vitro.

Известен способ получения микропобегов H.officinalis в культуре in vitro с использованием вегетативных почек Lt C.L. Multiplication in vitro de I'Husope (Hyssopus officinalis L.) // Revue Suisse de Vitic. Arboric. Hortic. - 1987.-V.19, № 6. - P. 363-367. Вегетативные почки иссопа, отобранные от материнских растений, после стерилизации гипохлоритом кальция помещают на питательную среду, которая содержит макро- и микроэлементы на основе Мурасиге и Скуга (1962) - МС, дополнена 3% сахарозой, 0,7 % агаром (Difco Bacto-Agar, Germany), 1,0 мг/л тиамином, 0,5 мг/л пиридоксином, 0,5 мг/л никотиновой кислотой, и используют 100 мг/л раствора: 4,44 мкМ 6-бензиламинопурина (БАП), 1 мкМ 3-индолилмасляной кислоты (ИМК) и 0,57 мкМ гибереловой кислоты (ГК). Среднее количество микропобегов на эксплант достигает 6±1,5 (при концентрации БАП - 4,44 мкМ и ИМК - 0,49 мкМ).

Недостатком способа является низкий коэффициент размножения микропобегов, использование морфогенетических потенций только одного экспланта (вегетативная почка).

Известен способ регенерации микропобегов из листовых эксплантов Actinidia deliciosa в культуре in vitro, который использовали как прототип (Заявка № 2002120668 от 27.12.2002 г.). Метод включает в себя отбор листовых эксплантов от растений, полученных в культуре in vitro, и культивирование высечек листа на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины МС, дополненной фитогормонами - БАП и индолилуксусной кислотой (ИУК). Через 4 недели культивирования на листовых эксплантах формируются адвентивные почки и микропобеги. Культивирование происходит при температуре 25°С, 16-часовом фотопериоде и интенсивном освещении 2-3 клк.

При использовании данного способа, с целью получения микропобегов из листовой ткани иссопа, культивируя их на питательной среде с БАП и ИУК, не удавалось добиться массового образования адвентивных почек из листовых эксплантов.

В основу изобретения поставлена задача: усовершенствовать способ регенерации растений из листовой ткани в условиях in vitro за счет подбора условий культивирования листовых дисков H.officinalis с целью максимального выхода генетически однородного растительного материала.

Поставленная задача решается тем, что в способе прямой регенерации микропобегов H.officinalis, которая состоит из отделения листовых эксплантов от растений, полученных в культуре in vitro, и культивирования эксплантов на питательной среде, которая содержит половинную концентрацию макро- и микросолей, витамины на основе МС и фитогормоны, в соответствии с изобретением на питательную среду в качестве фитогормона вводят вещество цитокининового типа действия, листовые экспланты иссопа отделяют от микропобегов после 4-5 пассажа в культуре in vitro и их культивирование проводят при низкой интенсивности освещения.

Существенные признаки заявленного способа имеют причинно-следственную связь с достигнутым результатом. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа, после первых трех субкультивирований на листовых эксплантах формировался каллус или единичные адвентивные почки, которые в дальнейшем не образовывали микропобеги. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 4-5 пассажей в культуре in vitro интенсивность образования адвентивных почек и регенерация микропобегов достигали 90%. В случае использования высечек листа с микропобегами иссопа после 6-8 пассажей наблюдали массовую регенерацию микропобегов, однако основная их часть была витрифицирована (обезвожена) и не способна для дальнейшего размножения.

Частота побегообразования увеличивалась при снижении интенсивности освещения до 1-1,5 клк и достигала 90%. Повышение интенсивности освещения до 2-3 клк (стандартные параметры для большинства растительных объектов) снижало частоту регенерации микропобегов до 50-60%.

В качестве вещества цитокининового типа действия, которое индуцирует образование и развитие меристем, а также регенерацию микропобегов в питательной среде, использовали тидиазурон (TDZ) - C9 H8N4OS.

Предложенный способ выполняется таким образом: приготавливают питательную среду согласно существующей методике. Состав питательных сред представлен в таблице 1.

Состав питательной среды для размножения растений иссопа

Таблица 1

Компоненты Питательные среды для разных этапов размножения
способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях   in vitro, патент № 2529837 12 3
способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях   in vitro, патент № 2529837 Культура вегетативных почек Культура листовых дисков Укоренение in vitro
способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях   in vitro, патент № 2529837 Макроэлементы, мг/л:
NH4NO3 825,0825,0412,5
KNO3 950,0950,0475,0
СаС12·2Н2 О220,0220,0 110,0
MgSO 4способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях   in vitro, патент № 2529837 .7H2O185,0 185,092,5
КН2РО4 85,085,042,5
Na2EDTA 37,337,337,3
FeSO4·7H2 O27,827,8 27,8
способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях   in vitro, патент № 2529837 Микроэлементы, мг/л:
Н3ВО3 6,26,23,1
MgSO4·4H2 O22,322,3 11,15
ZnSO 4·7H2O8,6 8,64,3
KJ0,830,83 0,415
Na 2M0O4·2H2O 0,250,250,125
CuSO4·6H2 O0,0250,025 0,0125
способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях   in vitro, патент № 2529837 Органические вещества:
Глицин, мг/л 2,02,02,0
Мезоинозит, мг/л 50,050,025,0
Никотиновая кислота, мг/л 0,50,50,5
Пиридоксин - НСl,

мг/л
0,50,5 0,5
Тиамин - НСl, мг/л 0,10,10,1
Зеатин, мкМ 2,28--
Тидиазурон, мкМ- 4,0-7,0-
Кинетин, мкМ4,6 --
ИМК, мкМ0,49- 8,0-11,0
Сахароза, мг/л30000,030000,0 15000,0
Агар, мг/л6000,06000,0 6000,0
рН 5,65,6 5,6

Сегмент микропобега иссопа с латеральной почкой помещают на питательную среду для культивирования вегетативных почек. Интенсивность освещения составляет 2,5-3 клк, температура 25±1°С, фотопериод 16 часов. Через пять суток наблюдают образование микропобегов. Нормально сформированные микропобеги без морфологических изменений через 2 недели культивирования удлиняются до 3-4 см. Их микрочеренкуют на сегменты с латеральной почкой и снова помещают на исходную среду № 1 (табл.1). Микрочеренкование производят через 2-3 недели культивирования. Вначале коэффициент размножения не превышает 1:2, но после 4-5 пассажа достигает 1:4. У листьев микропобегов после 4-5 субкультивирования вырезают диски, которые помещают на питательную среду № 2 (табл.1), которая содержит половинную концентрацию макроэлементов, полный набор микроэлементов и витаминов по МС, дополненную цитокинином - тидиазуроном в концентрации 4,0-7,0 мкМ (табл.2). Из данных таблицы видно, что максимальное количество адвентивных почек и микропобегов образуется на листовых эксплантатах после 8 недель при оптимальной концентратции тидиазурона. Через 8 недель культивирования листовых эксплантов происходит активное формирование адвентивных почек (16-20 шт./эксплант), при концентрации тидиазурона 9,0 мкМ листовые экспланты формируют каллус.

Влияние количества пассажей микропобегов на регенеративную способность листовых дисков подтверждается данными таблицы 3. Из данных таблицы видно, что листовые экспланты, взятые с микропобегов иссопа после 3-х субкультивирований в условиях in vitro, образуют каллус; адвентивные почки и микропобеги отсутствуют. Максимальное количество адвентивных почек и побегов образуется на эксплантах, отобранных с листовых микропобегов иссопа, после 4-5 субкультивирований в условиях in vitro. После 6-8 пассажей на листовых эксплантах образуется масса обезвоженных и в дальнейшем нежизнеспособных микропобегов иссопа.

Таблица 2

Влияние концентрации тидиазурона на частоту регенерации микропобегов иссопа из листовых эксплантов условиях in vitro

Концентрация тидиазурона, мкМ Количество листовых эксплантов с микропобегами, % (*)
Форма 80882Форма 38285
4 недели8 недель 4 недели8 недель
0,51,2±0,1 8,0±1,41,5±0,1 9,0±1,2
1,01,5±0,1 8,0±1,42,0±0,2 10,0±3,5
3,0 10,0±2,020,0±2,5 20,0±3,040,0±7,9
6,025,0±3,0 55,0±3,045,0±5,0 90,0±4,0
9,05,0±0,5 9,0±1,610,0±2,0 20,0±2,5

(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.

Таблица 3

Влияние количества субкультивирований микропобегов на регенерационную

способность листовых эксплантов иссопа в условиях in vitro

№ пассажаРегенерационная способность листовых дисков
Морфогенетические процессыКоэффициент размножения
1-3Образование каллуса0
4-5Адвентивное побегообразование 1:16-1:20
6-8 Образование обезвоженных микропобегов 1:10

Снижение интенсивности освещения до 1-1,5 клк стимулирует образование микропобегов иссопа в условиях in vitro. Это подтверждается данными таблицы 4.

Таблица 4

Влияние интенсивности освещения на частоту регенерации микропобегов иссопа у листовых эксплантов в условиях in vitro

Интенсивность освещения, клк Количество листовых эксплантатов с микропатогенами, % (*)
Форма 80882Форма 38285
00,00,0
180,0±5,0 35,0±11,0
1,590,0±4,0 50,0±4,3
2 75,0±5,040,0±7,9
2,555,0±3,0 27,0±3,0
335,0±5,0 16,0±6,1

(*)форма 80882 - иссоп с синим окрашиванием венчика цветка; форма 38285 - иссоп с розовым окрашиванием венчика цветка.

Из данных таблицы видно, что при отсутствии освещения не происходит образование адвентивных почек и побегов. Оптимальный уровень интенсивности освещения для инициации побегообразования и пролиферации микропобегов иссопа составил 1,5 клк. Частота регенерации и количество микропобегов на листовой диск значительно уменьшились при интенсивности освещения 2 клк, а при интенсивности освещения 3 клк только низкий процент листовых дисков был способен к регенерации и чаще всего экспланты погибали.

Следует отметить, что адаксиальное размещение листовых дисков иссопа на питательной среде повышает частоту регенерации микропобегов иссопа до 90%. В течение года из листовых дисков от одного растения иссопа можно получить около 10000 микропобегов, которые отделяют и в дальнейшем укореняют.

Укоренение микропобегов проводят на питательной среде № 3 (табл.1), которая содержит 8,0-11,0 мкМ ИМК. Культуральные сосуды выставляют на стеллажи. Интенсивность освещения составляет около 2 клк, температура 21±1°С, фотопериод 14 часов. Через 2-2,5 недели наблюдается образование максимального количества корешков длиной 5-6 см. Число укорененных побегов иссопа в условиях in vitro составляет 63-72 % (в зависимости от формы иссопа). Полученные растения готовы к высадке в субстрат и адаптации in vivo.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ регенерации адвентивных микропобегов Hyssopus officinalis L. в условиях in vitro включает в себя отделение листовых дисков от растения, полученных в культуре in vitro, культивирование их на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, дополненной фитогормонами, который отличается тем, что листовые диски отделяют после 4-5 пассажей микропобегов в культуре in vitro, далее культивируют их на модифицированной среде МС с половинной концентрацией микроэлементов и дополнительными веществами цитокининового типа действия, а именно тидиазуроном в концентрации 4,0-7,0 мкМ, причем культивирование проводят при низкой интенсивности освещения, которая составляет 1,0-1,5 клк.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2529837

patent-2529837.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A01H4/00 Разведение растений из тканевых культур

Патенты РФ в классе A01H4/00:
способ получения лапчатки белой (potentilla alba) -  патент 2525676 (20.08.2014)
способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза -  патент 2524424 (27.07.2014)
способ размножения цимбидиума in vitro -  патент 2523604 (20.07.2014)
способ микроклонального размножения подвоев яблони -  патент 2523305 (20.07.2014)
способ длительного хранения in vitro растений осины -  патент 2522823 (20.07.2014)
способ микрочеренкования винограда in vitro -  патент 2521992 (10.07.2014)
способ получения растений-регенерантов земляники (in vitro) -  патент 2516341 (20.05.2014)
способ микроклонального размножения ольхи черной in vitro -  патент 2515385 (10.05.2014)
способ введения в культуру клеток льна многолетнего -  патент 2506741 (20.02.2014)
способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта "королек" in vitro -  патент 2490871 (27.08.2013)


Наверх