ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля

Классы МПК:A01N63/04 плесневые грибы или экстракты из них
C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них
C12N9/02 оксидоредуктазы (1), например люцифераза
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-03-14
публикация патента:

Изобретение относится к области биохимии и касается применения концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля. Изобретение позволяет снизить потери картофеля от заражения растений Андийским вирусом крапчатости. 2 пр.

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в агробиотехнологии, микробиологии и растениеводстве.

Известен ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа (1), известен ингибитор вируса иммунодефицита человека (2). В качестве ингибитора использовался метаболит штамма Trichoderma harzianum Rifai - гомогенный фермент L-лизин-ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля, патент № 2527899 -оксидаза.

В связи с ввозом в Россию большого количества импортного материала картофеля, существует опасность заражения здоровых растений картофеля Андийским вирусом крапчатости картофеля. Также большой риск распространения зараженного картофеля связан с увеличением международного обмена семенным и генетическим материалом как в форме клубней, так и в культуре in vitro и истинных семенах (3, 4).

Андийский вирус крапчатости картофеля (Andean potato mottle virus) широко распространен в высокогорье Анд в Чили, Эквадоре и Перу, а также в Бразилии. Он поражает главным образом картофель, однако может встречаться на баклажанах и некоторых других пасленовых культурах (3, 5).

Описание ингибиторов Андийского вируса крапчатости картофеля (Andean potato mottle virus) не обнаружено.

Техническим результатом изобретения является снижение потерь от заражения растений картофеля Андийским вирусом крапчатости картофеля.

Технический результат достигается тем, что предлагается применение концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля.

Штамм является известным (6), депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ F-180 (Москва, Дорожный 1-й проезд, д.1. Институт генетики и селекции, 1987 г.).

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai.

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (г.Пущино).

Использовали ферментёр типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г. Кириши, объёмом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментёр оснащён магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и рН.

Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор-0,1 %, 1,3% сульфата аммония, значение рН 5,8-6,0 устанавливали 10% раствором НСl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при t° +125°C. Затем подготовленный ферментёр засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°С, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину рН в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 часов, конечные значения рН от 5,3 до 7,5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин, в течение часа при температуре +2 - +4°С. Затем нативный раствор в объёме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Рибонуклеиновую кислоту (РНК) Андийского вируса крапчатости картофеля выделяли из положительного контроля (фирма DSMZ, Германия). Образцы растирали в фарфоровой ступке до гомогенного состояния с добавлением лизирующего буфера из набора «Проба НК», фирма OOO «Агродиагностика». Из предварительно приготовленных образцов выделяли РНК с использованием наборов «Проба НК», фирмы OOO «Агродиагностика», по протоколу из набора.

Для постановки обратной транскрипции (ОТ) в пробирки была добавлена следующая смесь для ОТ: ОТ-буфер AMV фирмы «Promega» (250 mM Трис-HCl, 250 mM KCl, 50 mM MgCl2 2,5 mM spermidine, 50 mM DTT) - 5 µl смесь дНТФ фирмы ЗАО «Диалат ЛТД» (дА, дТ, дГ, дЦ - по 200 µМ каждого) - 2,5 µl, РНазин - 40 ед. (1 µl), ревертаза AMV фирмы «Promega» (10 U/µl) - 3 µl, вода до общего объема 20 µl, РНК образца - 5 µl. Реакция обратной транскрипции (процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК) происходил при t° +42°С в течение 1 часа, при t° +95°С - 5 минут.

На этапе обратной транскрипции к выделенной и очищенной РНК вируса Андийского вируса крапчатости картофеля был добавлен концентрат культуральной жидкости в разных разведениях (от 5 до 0,025 Ед/мл). Далее для реакции амплификации готовили следующую смесь: 10x MagMIX - 2025 фирмы ЗАО «Диалат-ЛТД» - 2,5 µl на образец, праймеры АРМУ прямые и обратные - по 2 µl (10 ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля, патент № 2527899 mol/µl) на образец, кДНК - 5 µl, вода до 25 µl, минеральное масло. В результате выделена комплементарная-дезоксирибонуклеиновая кислота (кДНК). Для получения продуктов реакции (ампликонов) проводили нагревание смеси по следующей схеме: один цикл при t° +96°С в течение 15 минут, 30 циклов при t° +96°С в течение 30 секунд, при t° +65°С в течение 30 секунд и при t° +72°С в течение 30 секунд; один цикл при t° +72°С в течение 10 минут. Хранение осуществляли при t° +4°С. Полученные ампликоны (многократно увеличенное число копий изучаемого участка кДНК) вносили в 1,5% агарозный гель, после чего получали электрофореграммы и оценивали полученные результаты.

Пример 1.

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в концентрациях 1 Ед/мл, 2,5 Ед/мл и 5 Ед/мл. Также был взят контрольный образец кДНК, в который не был добавлен фермент. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации 1 Ед/мл и более кДНК вируса разрушается, при этом не наблюдается образования темной полосы.

Пример 2.

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в разных концентрациях (1, 0,1, 0,05, 0,025 Ед/мл). Также был взят контрольный образец кДНК без добавления фермента. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации более 1 Ед/мл кДНК вируса разрушалось, при этом не наблюдалось образования темной полосы. При большем разведении фермента (0,1, 0,05, 0,025 Ед/мл) вирусная кДНК сохраняется и наблюдается темная полоса.

Источники информации

1. Ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа. Патент РФ № 2022012, 1994. Алексеев С.Б., Берёзов Т.Т., Анджапаридзе О.Г. и другие.

2. Ингибитор вируса иммунодефицита человека. Патент РФ № 2022011, 1994. Алексеев С.Б., Веса B.C., Смирнова И.П. и другие.

3. ЕРРО. Phytosanitary procedures PM 3/21 (2). Post-entry quarantine for potato // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 2004, vol.34, p.443-454.

4. Fribourg, C.E.; Jones, R.A.C.; Koenig, R. (1979) Andean potato mottle virus. CMI / AAB Descriptions of Plant Viruses No.203. Association of Applied Biologists, Wellesboume, UK.

5. Salazar, L.F.; Harrison, B.D. Particle properties and strains of Andean potato mottle virus. Journal of General Virology, 1978, 39, 171-178.

6. Смирнова И.П., Берёзов Т.Т., Чекунова Л.Н. Штамм Trichoderma harzianum Rifai продуцент L - лизино-ингибитор андийского вируса крапчатости картофеля, патент № 2527899 -оксидазы. Авторское свидетельство. 1991 г., № 1044043.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Применение концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2527899

patent-2527899.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A01N63/04 плесневые грибы или экстракты из них

Патенты РФ в классе A01N63/04:
штамм одноклеточных водорослей dunaliella salina - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью -  патент 2497945 (10.11.2013)
вододиспергируемый состав для доставки грибов, предназначенных для биоконтроля, снижающий содержание афлатоксина -  патент 2495118 (10.10.2013)
ингибитор возбудителя бактериального ожога плодовых культур (erwinia amylovora) -  патент 2493247 (20.09.2013)
энтомопатогенный биопрепарат для защиты растений от вредителей и способ его получения -  патент 2487542 (20.07.2013)
фунгицидная композиция для протравливания семян -  патент 2485779 (27.06.2013)
продуцент ингибитора вируса некротической пятнистости бальзамина -  патент 2481392 (10.05.2013)
штамм trichoderma harzianum rifai - продуцент ингибитора вируса кольцевой пятнистости табака (tobacco ringspot virus) -  патент 2475528 (20.02.2013)
средство для предпосевной обработки семян гороха -  патент 2469538 (20.12.2012)
способ получения средства для защиты сельскохозяйственных культур -  патент 2445775 (27.03.2012)
способ получения энтомопатогенного препарата -  патент 2421995 (27.06.2011)

Класс C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N1/14:
ранозаживляющее средство на основе штамма trichoderma harzianum rifai -  патент 2528065 (10.09.2014)
питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала -  патент 2527074 (27.08.2014)
способ восстановления чувствительного слоя биосенсора -  патент 2524438 (27.07.2014)
способ получения противовирусного средства и противовирусное средство -  патент 2522880 (20.07.2014)
штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной альфа-амилазы -  патент 2514224 (27.04.2014)
штамм fusarium sambucinum - продуцент грибной белковой биомассы -  патент 2511427 (10.04.2014)
способ получения грибной белковой биомассы -  патент 2511041 (10.04.2014)
мутантный штамм glarea lozoyensis и его применение -  патент 2507252 (20.02.2014)
способ обнаружения микроскопических грибов рода coccidioides poasadasii 36 s и coccidioides immitis c-5 -  патент 2503715 (10.01.2014)
способ получения кератиназы из penicillium citrinum -  патент 2499833 (27.11.2013)

Класс C12N9/02 оксидоредуктазы (1), например люцифераза

Патенты РФ в классе C12N9/02:
способ определения активности пероксидаз и субстратная смесь для определения активности пероксидаз -  патент 2525137 (10.08.2014)
гены дельта-8-десатуразы, ферменты, кодируемые ими, и их применение -  патент 2517615 (27.05.2014)
трансгенные растения -  патент 2515927 (20.05.2014)
укороченная мутантная люцифераза из metridia longa для применения в качестве биолюминесцентного репортера в живых клетках -  патент 2495929 (20.10.2013)
полипептиды для энантиоселективного ферментативного восстановления промежуточных соединений -  патент 2486239 (27.06.2013)
мутанты fad-2 и высокоолеиновые растения -  патент 2484137 (10.06.2013)
способ количественного определения дегидрогеназной активности микроорганизмов -  патент 2476598 (27.02.2013)
ингибитор вируса клещевого энцефалита -  патент 2473689 (27.01.2013)
способ получения субстанции l-лизин-альфа-оксидазы -  патент 2471866 (10.01.2013)
дельта-5-десатураза и ее применение для получения полиненасыщенных жирных кислот -  патент 2469092 (10.12.2012)


Наверх