способ получения бактериофага

Классы МПК:C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их
A61K35/76 вирусы
Автор(ы):, , , , , , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2013-06-07
публикация патента:

Представленный способ получения бактериофага включает: засев бактериальной культуры штамма-хозяина в титре 108 -109 КОЕ/мл в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивирование в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 105-106 БОЕ/мл и культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм. Получают фаголизат и отсасывают в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании. Центрифугируют и стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм. Охарактеризованное решение обеспечивает универсальную возможность получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильность титра бактериофагов в фаголизате и возможность его применения для использования в пищевой промышленности 2 з.п. ф-лы, 3 пр.

Формула изобретения

1. Способ получения бактериофага с использованием культивирования бактериофагов на культуре бактерий на плотной питательной среде, отличающийся тем, что бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 108-109 КОЕ/мл засевают в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 105-106 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования, культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0-7,2 в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30-45 минут при 5000-6000 об./мин, стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после центрифугирования смешивают надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги, затем стерилизуют смесь надосадочных жидкостей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сосуда для культивирования используют стеклянный микробиологический матрац.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии получения продукции, содержащей бактериофаги.

Бактериофаги - это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, принадлежащих к одному штамму или антигенно-гомологичным штаммам одного вида или рода с последующим лизисом (после внутриклеточной репликации) клетки-хозяина - вирулентные фаги или интегрированием в бактериальный геном с образованием лизогенов - умеренные фаги (Adams H.M. Bacteriophages. - New York: Interscience Publishers, Inc., London: Interscience Publishers ltd., 1959. - 592 p.). По многочисленным данным литературы, фаги могут быть использованы в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных и сельскохозяйственных культур (Alisky J., Iczkowski К., Rapoport,A., Troitsky N. Bacterio-phages show promise as antimicrobial agents // The Journal of infection. - 1998. - Vol.36, № 1. P.5-15; Brussow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience // Microbiology. - 2005. - Vol.151, Pt.7. - P.2133-2140; Бондаренко В.М. Клинический эффект и пути рационального использования лечебных бактериофагов в медицинской практике // Приложение к Журналу инфектологии. - 2011. - Т.3, № 3. - С.15-19). Ряд авторов допускают возможность практического применения бактериофагов как средств деконтаминации в пищевой промышленности как безопасной для человека и безвредной для окружающей среды альтернативы химическим и физическим методам элиминации бактерий (Greer G.G. Bacteriophage control of foodborne bacteria // Journal of food protection. - 2005. - Vol.68, № 5. - P.1102-1111; Lang L.H. FDA approves use of bacteriophages to be added to meat and poultry products // Gastroenterology. - 2006. - Vol.131, № 5. - P.1370-1372; Алешкин А.В., Зейгарник М.В. Возможности применения бактериофагов в качестве пробиотических средств деконтаминации в области питания // Вопросы диетологии. - 2012. - Т. 2, № 4. - С.24-34).

Одним из приоритетных показателей производства фагосодержащей продукции является получение фаголизатов с исходно высоким титром бактериофагов (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С.17-19).

Известным, предложенным для различных бактериофагов способом получения фаголизатов с высоким титром бактериофагов является культивирование бактерий штамма-хозяина с бактериофагом на плотной питательной среде с последующим получением суспендированного фаголизата с поверхности плотной питательной среды (SU 64612, 30.04.1945; Кузьмин Н.А., Комаров Б.А. Способ быстрого получения сибиреязвенных фагов в высоких концентрациях // Лабораторное дело. - 1967. - № 12. - С.741-743).

Основными недостатками данных аналогов заявляемого изобретения являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и отсутствие или недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении фаголизата с титром бактериофага 1011 -1013 БОЕ/мл.

Наиболее близким аналогом - прототипом - является способ получения концентрированных препаратов фага, заключающийся в посеве на чашки с агаром смеси из концентрированной культуры бактерий и фага в количестве, достаточном для получения сплошного лизиса. После инкубации при 37°C в течение 12-18 часов в чашки наливают 3-5 мл бульона и оставляют на 20 минут. Затем бульон сливают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отсасывают. Согласно прототипу приготовленный таком образом фаг может содержать 1011-1012 частичек на 1 мл (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С.18).

Основными недостатками прототипа являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 1011-10 13 БОЕ/мл.

Главной задачей заявляемого изобретения является обеспечение универсальности способа получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильности титра бактериофагов в фаголизате с его очисткой для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 1011-1013 БОЕ/мл.

Задача решена тем, что бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 108-109 КОЕ/мл засевают в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 105-106 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования, культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0-7,2 в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30-45 минут при 5000-6000 об./мин, стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. После центрифугирования можно смешивать надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги, затем стерилизовать смесь надосадочных жидкостей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускать полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. В качестве сосуда для культивирования можно использовать стеклянный микробиологический матрац.

В результате впервые проведенных нами исследований была определена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков: установлены универсальные, промышленно применимые условия эффективного культивирования бактериофагов (форма и толщина слоя плотной питательной среды, толщина слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды, герметизация сосуда для культивирования), подобран титр маточного бактериофага, определены варианты и количества суспендирующего раствора, необходимые для обеспечения высокой концентрации бактериофагов в фаголизате и качественной очистки фагов, предложена оптимальная последовательность и продолжительность операций очистки фаголизата.

Из патентно-технической литературы и практики производства фагосодержащей продукции неизвестно о способе получения бактериофага с использованием культивирования бактериофагов на культуре бактерий на плотной питательной среде, который был бы идентичен заявляемому.

Отсюда правомерен вывод о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - обеспечения универсальности способа получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильности титра бактериофагов в фаголизате с его очисткой для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 10 11-1013 БОЕ/мл.

Между существующими признаками и решаемой задачей существует причинно-следственная связь, где каждый признак необходим и влияет на получение технического результата, а вместе взятые признаки достаточны для его получения. Правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ может быть реализован многократно с использованием присущих ему существенных признаков, а значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Заявляемое изобретение апробировано при получении вариантов очищенного фаголизата, содержащего различные бактериофаги. Ниже приводятся результаты этой апробации. При этом приведенные примеры получения бактериофагов показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

Пример 1. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Typhimurium, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Typhimurium - в титре 108 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Typhimurium засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,04 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 30 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 30 минут при 6000 об./мин, стерилизовали надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Полученный очищенный фаголизат в виде элюата содержал бактериофаги в титре 1013 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 единиц эндотоксина на 1 мл очищенного фаголизата (ЕЭ/мл).

Пример 2. Для получения бактериофага, активного в отношении Escherichia coli O104:H4, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Escherichia coli К 12 С600 - в титре 109 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3,2 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Escherichia coli К12 С600 засевали маточный бактериофаг в титре 106 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 14 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,0 в количестве 0,042 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 40 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 40 минут при 5500 об./мин.

Для получения бактериофага, активного в отношении Listeria monocytogenes, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Listeria innocua - в титре 109 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Listeria innocua засевали маточный бактериофаг в титре 10 5 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+22°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,2 в количестве 0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 45 минут при 5000 об./мин.

Смешивали надосадочные жидкости двух полученных фаголизатов.

Смесь надосадочных жидкостей стерилизовали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде элюата содержала эшерихиозный бактериофаг в титре 101 БОЕ/мл и листериозный бактериофаг в титре 1011 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.

Пример 3. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Typhimurium, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Typhimurium - в титре 108 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Typhimurium засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,1 в количестве 0,042 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 32 минуты при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 32 минуты при 6000 об./мин.

Для получения бактериофага, активного в отношении Listeria monocytogenes, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Listeria innocua - в титре 109 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.

Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Listeria innocua засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+24°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.

Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,2 в количестве 0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.

Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 45 минут при 5000 об./мин.

Смешивали надосадочные жидкости двух полученных фаголизатов.

Смесь надосадочных жидкостей стерилизовали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.

Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде элюата содержала сальмонеллезный бактериофаг в титре 1012 БОЕ/мл и листериозный бактериофаг в титре 1011 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2525141

patent-2525141.pdf

Класс C12N7/00 Вирусы, например бактериофаги; их композиции; приготовление или очистка их

холодоадаптированный штамм вируса гриппа в-в/виктория/2/63/87, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантов холодоадаптированных штаммов для живой гриппозной вакцины -  патент 2529772 (27.09.2014)
штамм "г 244/11" вируса блютанга 14 серотипа для вирусологических исследований, изготовления вакцинных и диагностических препаратов -  патент 2528057 (10.09.2014)
флавивирус с двухкомпонентным геномом и его использование -  патент 2527891 (10.09.2014)
поликатионное соединение "тривирон (triviron)" и способ его получения -  патент 2527256 (27.08.2014)
аттенуированный рекомбинантный парвовирус, пригодный для защиты собак от инфицирования парвовирусом -  патент 2527157 (27.08.2014)
кодон-оптимизированная кднк, кодирующая дисферлин человека, генно-инженерная конструкция, рекомбинантный аденовирус и фармацевтическая композиция для лечения дисферлинопатий -  патент 2527073 (27.08.2014)
вакцина против ящура типа а инактивированная сорбированная -  патент 2526570 (27.08.2014)
способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов -  патент 2526504 (20.08.2014)
способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины -  патент 2526494 (20.08.2014)
набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченого зонда для видоспецифичной экспресс-идентификации рнк вируса хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени -  патент 2525938 (20.08.2014)

Класс A61K35/76 вирусы

кодон-оптимизированная кднк, кодирующая дисферлин человека, генно-инженерная конструкция, рекомбинантный аденовирус и фармацевтическая композиция для лечения дисферлинопатий -  патент 2527073 (27.08.2014)
способ оценки противооспенной активности лечебно-профилактических препаратов -  патент 2526504 (20.08.2014)
способ оценки активности лечебно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы -  патент 2522483 (20.07.2014)
аденовирусные векторы и способы и применения, связанные с ними -  патент 2520823 (27.06.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив735 субтипа в для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2520813 (27.06.2014)
композиция антибактериальная, штамм бактериофага escherichia coli, используемый для получения такой композиции. -  патент 2518303 (10.06.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив742 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2513693 (20.04.2014)
штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов -  патент 2513692 (20.04.2014)
способ лечения обострений хронического ларингита -  патент 2510757 (10.04.2014)
видоспецифический вирулентный штамм бактериофага, обладающий литической активностью в отношении staphylococcus aureus, включая мультирезистентные штаммы -  патент 2503716 (10.01.2014)
Наверх