способ затирания

Формула изобретения

1. Способ производства затора, включающий образование затора из крупки и контактирование указанного затора с альфа-амилазой, глюкоамилазой и пуллуланазой, причем указанная пуллуланаза имеет аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 4.

2. Способ по п.1, в котором пуллуланаза получена из Bacillus acidopullulyticus.

3. Способ по п.1, в котором глюкоамилаза и/или альфа-амилаза получены из Aspergillus niger или Talaromyces emersonii.

4. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий контактирование затора с ферментом, выбранным из группы, состоящей из целлюлазы, изоамилазы, ксиланазы и протеазы.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором крупка включает соложеное и/или несоложеное зерно.

6. Способ по п. 5, в котором соложеное и/или несоложеное зерно выбрано из списка, состоящего из ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса, кукурузы и риса.

7. Способ по п.5, в котором соложеное зерно включает соложеное зерно, выбранное из соложеного ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса, кукурузы и риса.

Описание изобретения к патенту

Ссылка на перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей в машиночитаемой форме. Машиночитаемая форма включена в настоящую заявку путем отсылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу затирания для производства пивного сусла и производства пива.

Уровень техники

В современных способах затирания в качестве добавки при затирании солода с низким содержанием ферментов, или для того чтобы можно было использовать любые зерновые добавки, часто добавляют ферменты. Ферменты могут также применяться при затирании хорошо растворенных солодов с высоким содержанием ферментов, чтобы повысить извлечение экстракта, а также количество сбраживаемых сахаров. Таким образом, известно применение деветвящих ферментов, например изоамилазы или пуллуланазы, для повышения выхода сбраживаемых сахаров. Деветвящие ферменты могут применяться в способах производства низкокалорийного пива. Такие способы являются объектом Willox et al. (MBAA, Technical Quarterly, 1977, 14; 105), патентов США 4528198, 4666718 и 4318927, а также GB 2056484 и GB 2069527.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что в случае применения определенной пуллуланазы затирание можно выполнить при использовании меньшего количества фермента.

Таким образом, в первом аспекте изобретение обеспечивает способ производства пивного сусла, включающий формирование затора из крупки и контактирование указанного затора с пуллуланазой (E. C.3.2.1.41), которая имеет аминокислотную последовательность, которая: a) является, по меньшей мере, на 50% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, или b) кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в мягких условиях с i) комплементарной цепью нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, или ii) подпоследовательностью (i) длиной, по меньшей мере, 100 нуклеотидов.

Во втором аспекте изобретение обеспечивает затор, полученный способом согласно первому аспекту.

В третьем аспекте изобретение обеспечивает сконцентрированное и/или высушенное сусло, полученное способом согласно первому аспекту.

В четвертом аспекте изобретение обеспечивает пиво, полученное из сусла согласно второму и третьему аспекту.

В пятом аспекте изобретение обеспечивает композицию, пригодную для применения в способе согласно первому аспекту, которая включает пуллуланазу (E.C. 3.2.1.41), глюкоамилазу и возможно альфа-амилазу, причем пуллуланаза имеет аминокислотную последовательность, которая: a) является, по меньшей мере, на 50% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, или b) кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в мягких условиях с i) комплементарной цепью нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, или ii) подпоследовательностью (i) длиной, по меньшей мере, 100 нуклеотидов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы производства пива широко известны в уровне техники и обычно включают стадии соложения, затирания и сбраживания. Затирание представляет собой процесс превращения крахмала в молотом ячменном солоде и твердых добавках в сбраживаемые и несбраживаемые сахара с получением сусла требуемого состава. Традиционное затирание включает смешивание молотого ячменного солода и добавок с водой при заданной температуре и объеме, с продолжением биохимических изменений, начатых в процессе соложения. Процесс затирания проводят в течение некоторого времени при различных температурах, чтобы активировать эндогенные ферменты, ответственные за деградацию белков и углеводов. Безусловно, самым важным изменением, протекающим при затирании, является превращение молекул крахмала в сбраживаемые сахара. Основными ферментами, ответственными за превращение крахмала в традиционном способе затирания, являются альфа- и бета-амилазы. Альфа-амилаза очень быстро гидролизует нерастворимый и растворимый крахмал, расщепляя молекулы крахмала на многочисленные молекулы с более короткой цепью, которые могут подвергаться расщеплению бета-амилазой. Образующимся дисахаридом является мальтоза. В дополнение к мальтозе, образовавшейся в процессе затирания, также образуются короткие разветвленные олигомеры глюкозы. Короткие разветвленные олигомеры глюкозы являются несбраживаемыми сахарами и добавляются к вкусу, а также повышают количество калорий готового пива.

После затирания, когда весь крахмал уже гидролизован, необходимо отделить жидкий экстракт (сусло) от твердой фазы (дробины). Отделение сусла, фильтрование, является важным, поскольку твердые частицы содержат большие количества белка, плохо растворенного крахмала, жиров, силикатов и полифенолов (танинов). После отделения сусла от дробины сусло можно сбраживать пивными дрожжами с получением пива.

Дополнительную информацию относительно обычных способов производства пива можно найти в "Technology Brewing and Malting", Wolfgang Kunze, Research and Teaching institute of Brewing, Berlin (VLB), 2nd revised Edition 1999, iSBN 3-921690-39-0.

Короткие разветвленные олигомеры глюкозы, образовавшиеся в процессе затирания, могут подвергаться дальнейшему гидролизу при добавлении экзогенных ферментов (ферментов, добавляемых к солоду в качестве добавок). Деветвящие ферменты, такие как пуллуланаза и изоамилаза, гидролизуют альфа-1-6 глюкозидные связи в данных олигомерах, высвобождая, таким образом, глюкозу или мальтозу, а также олигомеры с нормальной цепью, на которые действуют эндогенные (содержащиеся в солоде) и/или экзогенные ферменты, например, альфа-амилазы, бета-амилазы и глюкоамилазы.

Настоящее изобретение предоставляет новый способ, который может применяться для получения сусла с низким содержанием несбраживаемых сахаров. В указанном способе применяется селективная пуллуланазная активность.

Определения

По всему тексту настоящего описания используются различные термины, которые обычно известны средним специалистам в данной области техники. Некоторые термины применяются со специфическим значением, определенным ниже.

Используемый в настоящем описании термин "крупка" понимается как крахмалосодержащий или сахаросодержащий материал, который служит основой для производства пива, например ячменный солод и добавка. В большинстве случаев крупка не содержит добавок воды.

Термин "солод" понимается как любое соложенное зерно хлебных злаков, в частности ячменя.

Термин "добавка" понимается как часть зерна, которое не является ячменным солодом. Добавка может включать любой богатый крахмалом растительный материал, например несоложенное зерно, такое как ячмень, рис, кукуруза, пшеница, рожь, сорго обыкновенное и легко сбраживаемый сахар и/или сироп.

Термин "затор" понимается как крахмалосодержащая суспензия, включающая крупку, вымоченную в воде.

Термин "сусло" понимается как несброженный раствор, отделяемый после экстракции крупки в процессе затирания.

Термин "дробина" понимается как отжатые твердые частицы, остающиеся после экстракции крупки и отделения сусла.

Термин "пиво" понимается как сброженное сусло, то есть алкогольный напиток, сваренный из ячменного солода, возможно добавок и хмеля.

Термин "гомологичная последовательность" используется для описания последовательности, имеющей аминокислотную последовательность, которая идентична известной последовательности, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 75% или, по меньшей мере, на 80%, или, по меньшей мере, на 85%, или на 90%, или, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 99%, или даже, по меньшей мере, на 100%. Релевантной частью аминокислотной последовательности для определения гомологии является зрелый полипептид, то есть без сигнального пептида. Термин "гомологичная последовательность" также используется для описания последовательностей ДНК, которые гибридизуются в условиях низкой жесткости, средней жесткости, средней/высокой жесткости, высокой жесткости, или даже очень высокой жесткости, с известной последовательностью. Подходящие экспериментальные условия для определения гибридизации с низкой жесткостью, средней или высокой жесткостью между нуклеотидным зондом и гомологичной последовательностью ДНК или РНК включают погружение фильтра, содержащего гибридизуемые фрагменты ДНК или РНК, в 5×SSC (хлорид натрия/цитрат натрия, Sambrook et al., 1989) на 10 минут, и прегибридизацию фильтра в растворе, содержащем 5×SSC, 5× раствор Денхардта (Sambrook et al., 1989), 0,5% ДСН и 100 микрограмм/мл денатурированной ультразвуком ДНК спермы лосося (Sambrook et al., 1989), с последующей гибридизацией в том же растворе, содержащем случайно синтезированные (Feinberg and Vogeistein, 1983, Anal. Biochem. 132:6-13), ³² P-dCTP-меченные (удельная активность > 1×10⁹ имп/мин/микрограмм) зонды в концентрации 10 нг/мл, в течение 12 часов при температуре приблизительно 45°C. Затем фильтр дважды промывают в течение 30 минут в 2×SSC, 0,5% ДСН при температуре приблизительно 55°C (низкая жесткость), более предпочтительно приблизительно при 60°C (средняя жесткость), еще более предпочтительно приблизительно при 65°C (средняя/высокая жесткость), еще более предпочтительно приблизительно при 70°C (высокая жесткость), и наиболее предпочтительно приблизительно при 75°C (очень высокая жесткость). Молекулы, с которыми олигонуклеотидные зонды гибридизуются в указанных условиях, детектируют с использованием рентгеновской пленки.

Термин "идентичность", используемый в отношении последовательностей полипептида или ДНК и упомянутый в настоящем описании, понимается как степень идентичности между двумя последовательностями, указывающая отличие первой последовательности от второй. Идентичность надлежащим путем можно определить с помощью компьютерных программ, известных в уровне техники, таких как GAP, предоставляемой в пакете программ GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group. 575 Science Drive. Madison. Wisconsin, USA 53711) (Needleman and Wunsch, 1970, Journal of Molecular Biology 48: 443-453). Используются следующие параметры настройки для сравнения полипептидной последовательности: GAP creation penalty 3,0 и GAP extension penalty 0,1. Степень идентичности между аминокислотной последовательностью настоящего изобретения и другой аминокислотной последовательностью ("чужеродной последовательностью") вычисляется как число точных совпадений в выравнивании указанных двух последовательностей, деленное на длину "последовательности изобретения" или длину "чужеродной последовательности", в зависимости от того, которая является наиболее короткой. Результат выражают как процент идентичности.

Получение сусла

В соответствии с первым аспектом, изобретение обеспечивает способ получения пивного сусла, включающий формирование затора из крупки и контактирование указанного затора с пуллуланазой (E.C. 3.2.1.41), имеющей аминокислотную последовательность, которая: a) по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80% или, по меньшей мере, на 85%, или на 90%, или, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, или даже, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4, или b) кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях низкой жесткости, средней жесткости, средней/высокой жесткости, высокой жесткости, или даже очень высокой жесткости с i) комплементарной цепью нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, приведенной в SEQ ID NO: 4, или ii) подпоследовательностью (i) длиной, по меньшей мере, 100 нуклеотидов, по меньшей мере, 200 нуклеотидов, по меньшей мере, 300 нуклеотидов, по меньшей мере, 500 нуклеотидов, по меньшей мере, 1000 нуклеотидов, или даже, по меньшей мере, 1500 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления пуллуланаза имеет аминокислотную последовательность, которая отличается не более чем на 100 аминокислот, предпочтительно не более чем на 80 аминокислот, более предпочтительно не более чем на 50 аминокислот, более предпочтительно более чем на 30 аминокислот, еще более предпочтительно не более чем на 20 аминокислот, и наиболее предпочтительно не более чем на 10 аминокислот, от аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

Крупка согласно первому аспекту включает крахмалосодержащую соложеную крупку и/или добавку. Крупка предпочтительно может включать от 0% до 100%, предпочтительно от 20% до 100%, предпочтительно от 30% до 100%, более предпочтительно от 40% до 100%, даже более предпочтительно от 50% до 100%, еще более предпочтительно от 60% до 100%, например, от 80% до 100% или даже, наиболее предпочтительно, от 90% до 100% добавки, несоложенного зерна и/или несоложенного ячменя. В конкретном варианте осуществления добавка состоит из 100% несоложенного ячменя. Кроме того, крупка предпочтительно включает от 0% до 100%, предпочтительно от 20% до 100%, предпочтительно от 30% до 100%, более предпочтительно от 40% до 100%, еще более предпочтительно от 50% до 100%, более предпочтительно от 60% до 100% или, наиболее предпочтительно, от 70% до 100%, или даже более предпочтительно от 90% до 100% соложенного зерна и/или соложенного ячменя. В конкретном варианте осуществления крупка включает приблизительно 50% соложенного зерна, например, соложенного ячменя, и приблизительно 50% добавки, например, несоложенного зерна, такого как несоложенный ячмень.

Соложенное зерно, применяемое в способе согласно первому аспекту, может включать любое соложенное зерно, и предпочтительно соложенное зерно, выбранное из соложенного ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса, зерна и риса, и наиболее предпочтительно, соложенного ячменя.

Добавка, применяемая в способе согласно первому аспекту, может быть получена из клубней, корней, стеблей, листьев, бобов, зерновых злаков и/или цельного зерна. Добавка может включать неочищенный и/или очищенный материал, содержащий крахмал и/или сахар, полученный из таких растений, как пшеница, рожь, овес, кукуруза, рис, просо, сорго, картофель, батат, маниока, тапиока, саго, банан, сахарная свекла и/или сахарный тростник. Предпочтительно, добавка включает несоложенное зерно, например несоложенное зерно, выбранное из списка, состоящего из ячменя, пшеницы, ржи, сорго, просо, кукурузы и риса, и наиболее предпочтительно несоложенного ячменя. Добавка, включающая легко сбраживаемые углеводы, такие как сахара или сиропы, может быть добавлена к ячменному солоду перед, в течение или после процесса затирания согласно способу изобретения, но предпочтительно добавляется после процесса затирания. Согласно изобретению, активность фермента пуллуланазы (E.C. 3.2.1.41) экзогенно вводится и присутствует в заторе. Пуллуланаза может быть добавлена к компонентам затора, например, воде и/или крупке перед, в течение или после формирования затора. В наиболее предпочтительном варианте осуществления альфа-амилаза (E.C. 3.2.1.1) и/или глюкоамилаза (E.C. 3.2.1.3) добавляются и присутствуют в заторе вместе с пуллуланазой.

В другом предпочтительном варианте осуществления к затору добавляют другой фермент, выбираемый из группы, состоящей из изоамилазы, протеазы, лакказы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, фитазы, фитина и эстеразы.

В течение процесса затирания крахмал, экстрагированный из крупки, постепенно гидролизуется в сбраживаемый сахар и в меньшей степени декстрины. Предпочтительно, перед экстракцией затора затор дает отрицательный результат в йодном тесте на крахмал.

В процессе затирания обычно применяют контролируемое ступенчатое повышение температуры, при котором каждый уровень благоприятствует протеканию определенной ферментативной реакции по сравнению с другими, что, в конечном счете, приводит к деградации белков, клеточных стенок и крахмала. Профили температур в процессе затирания широко известны в уровне техники. В настоящем изобретении стадию осахаривания (расщепления крахмала) в процессе затирания предпочтительно проводят при температуре 60-66°C, более предпочтительно 61-65°C, еще более предпочтительно 62-64°C и наиболее предпочтительно 63-64°C. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения температура при осахаривании составляет 64°C.

Получение сусла из затора обычно включает фильтрование сусла с отделением дробины, то есть нерастворимого зернового материала и шелухи, составляющих часть крупки. Горячую воду можно пропускать через дробину для вымывания, или промывки с целью извлечения экстракта, остающегося в крупке. Применение термостабильной целлюлазы в способе настоящего изобретения приводит к эффективному снижению уровня бета-глюкана, способствуя фильтрации сусла, что обеспечивает, таким образом, сокращение продолжительности цикла и повышает выход экстракта. Предпочтительно, выход экстракта составляет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 81%, более предпочтительно, по меньшей мере, 82%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 83%, например, по меньшей мере, 84%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 86%, по меньшей мере, 87%, по меньшей мере, 88%, по меньшей мере, 89%, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 91%.

После отделения сусла от дробины крупки согласно любому из вышеуказанных вариантов осуществления первого аспекта, сусло может использоваться в неизменном виде, или оно может быть высушено с целью получения концентрированного и/или высушенного сусла. Концентрированное и/или высушенное сусло может применяться в качестве экстракта для производства пива, в качестве ароматизатора с ароматом солодового экстракта, для производства безалкогольных солодовых напитков, солодового уксуса, готовых завтраков, кондитерских изделий и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления сусло сбраживают с получением алкогольного напитка, предпочтительно пива, например эля, крепкого эля, горького эля, стаута, портера, лагера, экспортного пива, солодового ликера, ячменного вина, хаппошу, крепкого пива, слабоалкогольного пива, низкокалорийного пива или светлого пива. Брожение сусла может включать введение в сусло суспензии дрожжей, включающей свежие дрожжи, то есть дрожжи, не используемые ранее в изобретении, или же дрожжи могут являться переработанными дрожжами. Применяемые дрожжи могут являться любыми дрожжами, подходящими для производства пива, в особенности дрожжами, выбранными из Saccharomyces spp., такими S. cerevissae и S. uvarum, включая природные или искусственно полученные варианты данных организмов. Способы сбраживания сусла для производства пива известны специалисту, квалифицированному в данной области.

Способ изобретения может включать добавление в сбраживаемое сусло силикагеля с целью повышения коллоидной стабильности пива. Способы могут дополнительно включать добавление в сбраживаемое сусло кизельгура и фильтрование с целью получения осветленного пива.

Согласно одному из аспектов изобретения обеспечивается пиво, полученное из сусла согласно второму или третьему аспекту, такое как пиво, полученное путем сбраживания сусла с получением пива. Пиво может являться пивом любого типа, например элями, крепкими элям, стаутами, портерами, лагерами, горькими элями, экспортным пивом, солодовыми ликерами, хаппошу, крепким пивом, слабоалкогольным пивом, низкокалорийным пивом или светлым пивом.

Ферменты

Ферменты, применяемые в настоящем изобретении, выбирают по их способности сохранять достаточную активность при рабочей температуре способов изобретения, а также при pH в заторе, и добавляют в эффективных количествах. Ферменты могут быть получены из любого источника, предпочтительно из растения или водорослей, и более предпочтительно из микроорганизма, такого как бактерия или гриб.

Пуллуланаза (E.C. 3.2.1.41)

Предпочтительно фермент пуллуланаза, применяемая в способах и/или композициях изобретения, является пуллуланазой, имеющей аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 50%, например, по меньшей мере, на 55%, например, на 60%, например, по меньшей мере, на 65%, например, по меньшей мере, на 66%, например, по меньшей мере, на 70%, например, по меньшей мере, на 75%, например, по меньшей мере, на 80%, например, по меньшей мере, на 85%, например, по меньшей мере, на 86%, например, по меньшей мере, на 87%, например, по меньшей мере, на 88%, например, по меньшей мере, на 89%, например, по меньшей мере, на 90%, например, по меньшей мере, на 95%, например, по меньшей мере, на 98% или даже на 100%, идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4; ion в особенности при выравнивании посредством Program Needle с использованием Matrix: BLOSUM62; Gap initiation penalty: 10.0; Gap extension penalty: 0.5; Gapiess Identity Matrix.

Наиболее предпочтительно пуллуланаза получена из Bacillus acidopullulyticus. Пуллуланаза может иметь аминокислотную последовательность, раскрытую Kelly с сотр., 1994 (FEMS Microbiol. Letters 115: 97-106) (SEQ ID NO: 8), или гомологичную последовательность.

Изоамилаза (E.C. 3.2.1.68)

Другим ферментом, применяемым в способах и/или композициях изобретения, может являться альтернативный деветвящий фермент, такой как изоамилаза (E.C. 3.2.1.68). Изоамилаза гидролизует альфа-1,6-D-глюкозидные боковые связи в амилопектине и предельных бета-декстринах, при этом изоамилазу можно отличить от пуллуланаз по ее неспособности расщеплять пуллулан и по ограниченной активности в отношении предельных альфа-декстринов. Изоамилаза может быть добавлена в эффективных количествах, известных специалисту, квалифицированному в данной области. Изоамилаза может быть добавлена отдельно или вместе с пуллуланазой.

Альфа-амилаза (EC 3.2.1.1)

Конкретный фермент альфа-амилаза, применяемая в способах и/или композициях изобретения, может являться альфа-амилазой Bacillus. Широко известные бациллярные альфа-амилазы включают альфа-амилазу, полученную из штамма B. licheniformis, B.amyloliquefaciens и B. stearothermophilus. В рамках настоящего изобретения рассматриваемая бациллярная альфа-амилаза является альфа-амилазой, как определено в WO 99/19467 со страницы 3, строки 18 до страницы 6, строки 27. Предпочтительно альфа-амилаза имеет аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 90% идентичности к SEQ ID NO: 4 в WO 99/19467 (в настоящей заявке раскрыта как SEQ ID NO: 7), например, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, или, в особенности, по меньшей мере, 99%. Наиболее предпочтительная мальтогенная альфа-амилаза соответствует SEQ ID NO: 9 или включает варианты, раскрытые в WO 99/43794. Рассматриваемые варианты и гибриды описаны в WO 96/23874, WO 97/41213 и WO 99/19487. В особенности рассматривается альфа-амилаза (E.C. 3.2.1.1) из B. Stearothermophilus , имеющая аминокислотную последовательность, раскрытую в SEQ ID NO: 3 в WO 99/19467 (в настоящей заявке раскрыта как SEQ ID NO: 10), с мутациями: I181* + G182* + N193F.

Альфа-амилазы Bacillus могут быть добавлены в количествах 1,0-1000 NU/кг DS(сухого веса), предпочтительно от 2,0-500 NU/кг DS, предпочтительно 10-200 NU/кг DS.

Другой конкретной альфа-амилазой, применяемой в способах изобретения, может являться любая грибковая альфа-амилаза, например альфа-амилаза из видов Aspergillus , и предпочтительно из штамма Aspergillus niger. В особенности рассматриваются грибковые альфа-амилазы, которые обладают высокой идентичностью, а именно, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85% или даже, по меньшей мере, 90% идентичности с аминокислотными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1 в WO 2002/038787 (в настоящей заявке раскрыты как SEQ ID NO: 11). Грибковые альфа-амилазы могут быть добавлены в количестве 1-1000 AFAU/кг DS, предпочтительно от 2-500 AFAU/кг DS, предпочтительно 20-100 AFAU/кг DS.

Глюкоамилазы (E.C.3.2.1.3)

Другим конкретным ферментом, применяемым в способах и/или композициях изобретения, может являться глюкоамилаза (E.C.3.2.1.3), полученная из микроорганизма или растения. Предпочтительными являются глюкоамилазы грибков или бактерий, выбранные из группы, состоящей из Aspergillus gluucoamylases, в частности глюкоамилазы G1 или G2 из A.niger (Boel et al. 1984, EMBO J. 3(5). 1097-1102), или их варианты, такие как раскрытые в WO 92/00381 и WO 00/04136; глюкоамилаза из A. awamori (WO 84/02921), A. oryzae (Agric. Biol. Chem., 1991, 55 (4): 941-949), или их варианты или фрагменты.

Другие рассматриваемые глюкоамилазы включают глюкоамилазы Talaromyces, в особенности полученные из Talaromycesemersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (патент США Re. 32,153), Talaromyces duponti и Talaromyces thermophilus (патент США 4,587,215). Предпочтительные глюкоамилазы включают глюкоамилазы, полученные из Aspergillus oryzae, например глюкоамилазу, обладающую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, в особенности, по меньшей мере, 99%, или даже, по меньшей мере, 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2 в WO 00/04136. Другие предпочтительные глюкоамилазы включают глюкоамилазы, полученные из Talaromyces emersonii, например, глюкоамилазу, обладающую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, в особенности, по меньшей мере, 99%, или даже, по меньшей мере, 100% идентичности с аминокислотной последовательностью Talaromyces emersonii (WO 99/28448).

Рассматриваемые бактериальные глюкоамилазы включают глюкоамилазы из рода Clostridium, в частности C. thermoamylolyticum (EP 135,138) и C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831).

Также рассматриваются коммерческие продукты AMG 200L; AMG 300L; SAN SUPER и AMG E (Novozymes); OPTIDEX 300 (Genencor Int.); AMSGASE и AMIGASE PLUS (DSM); G-ZYME G900 (Enzyme Bio-Systems); G-ZYME ZR G990 (глюкоамилаза A. niger с низким содержанием протеаз). Глюкоамилазы могут быть добавлены в эффективных количествах, известных специалисту, квалифицированному в данной области техники.

Протеаза

Подходящие протеазы включают микробные протеазы, такие как грибковые и бактериальные протеазы. Предпочтительными протеазами являются кислые протеазы, то есть протеазы, характеризующиеся способностью гидролизовать белки в кислой среде при pH ниже 7.

Протеазы ответственны за расщепление высокомолекулярных белков с образованием низкомолекулярных белков в заторе. Низкомолекулярные белки необходимы для питания дрожжей, а высокомолекулярные белки обеспечивают стабильность пены. Таким образом, квалифицированному специалисту известно, что протеазу нужно добавлять в сбалансированном количестве, которое одновременно обеспечивает присутствие свободных аминокислот, необходимых дрожжам, а также оставляет достаточное количество высокомолекулярных белков, требуемое для стабилизации пены. Протеазы могут быть добавлены в количествах 0,1-1000 AU/кг DS, предпочтительно 1-100 AU/кг DS и наиболее предпочтительно 5-25 AU/кг DS.

Целлюлаза (E.C. 3.2.1.4)

Целлюлаза может иметь микробное происхождение, например может быть получена из штамма нитчатого гриба (например, Aspergillus, Trichoderma, Humicoia, Fusarium). Конкретные примеры целлюлаз включают эндоглюканазу (эндоглюканазу I), получаемую из H. insolens , дополнительно определяемую аминокислотной последовательностью Фиг.14 в WO 91/17244 (в настоящей заявке раскрыта как SEQ ID NO: 12), а также 43 кДа эндоглюканазу H. insolens, описанную в WO 91/17243.

Конкретной целлюлазой, применяемой в способах изобретения, может являться эндоглюканаза, такая как эндо-1,4-бета-глюканаза. В особенности рассматривается бета-глюканаза, приведенная в SEQ ID NO: 2 в WO 2003/062409 (в настоящей заявке раскрыта как SEQ ID NO: 14), а также гомологичные последовательности. Коммерчески доступные препараты целлюлазы, которые могут применяться, включают CELLUCLAST^®, CELLUZYME^® , CEREFLO^® и ULTRAFLO^® (поставляемые Novozymes A/S), LAMINEX и SPEZYME^® CP (поставляемые Genencor Int.), а также ROHAMENT^® 7069 W (поставляемый Röhm, Germany).

Бета-глюканазы могут быть добавлены в количествах 1,0-10000 BGU/кг DS, предпочтительно от 10-5000 BGU/кг DS, предпочтительно от 50-1000 BGU/кг DS и наиболее предпочтительно от 100-500 BGU/кг DS.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ферменты

Пуллуланаза 1 получена из Bacillus acidopullulyticus и имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. Пуллуланаза 1 поставляется фирмой Novozymes под маркой Promozyme 400L.

Пуллуланаза 2 получена из Bacillus deramificans (патент США 5736375) и имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2. Пуллуланаза 2 поставляется фирмой Novozymes под маркой Promozyme D2.

Пуллуланаза 3 получена из Bacillus acidopullulyticus и имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4.

Грибковая кислая альфа-амилаза получена из Aspergillus niger и имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11.

Глюкоамилаза G1 получена из Aspergillus niger (Boel et al., выше).

Методы

Альфа-амилазная активность (NU)

Активность альфа-амилазы может быть определена с применением картофельного крахмала в качестве субстрата. Данный метод основан на расщеплении модифицированного картофельного крахмала ферментом, а после реакции пробы с раствором крахмала/фермента смешивают с раствором йода. Первоначально, развивается черно-синее окрашивание, однако при расщеплении крахмала синий цвет становится более слабым и постепенно превращается в красновато-коричневый цвет, который сравнивают с цветным стеклом, используемым в качестве стандарта.

Одна единица Kilo Novo альфа-амилазы (KNU) равна 1000 NU. Одна KNU определяется как количество фермента, которое при нормальных условиях (то есть при 37°C +/- 0,05; 0,0003 М Ca²⁺ и pH 5,6) расщепляет 5,26 г сухого крахмала (Merck Amylum solubile).

Активность кислой альфа-амилазы (AFAU)

Активность кислой альфа-амилазы может быть измерена в единицах AFAU (единицы грибковой кислотной альфа-амилазы), которые определяют относительно стандартного фермента. 1 FAU определяется как количество фермента, которое расщепляет 5,260 мг сухого крахмала в час при стандартных условиях, указанных ниже.

Кислая альфа-амилаза, эндо-альфа-амилаза (1,4-альфа-D-глюкан-глюканогидролаза, E.C. 3.2.1.1), гидролизует внутренние альфа-1,4-глюкозидные связи в молекуле крахмала с образованием декстринов и олигосахаридов с цепями различной длины. Интенсивность окрашивания, возникающего при реакции с йодом, прямо пропорциональна концентрации крахмала. Активность амилазы определяют с помощью обратного колориметрического анализа как снижение концентрации крахмала при указанных аналитических условиях.

Стандартные условия/условия реакции

Субстрат: растворимый крахмал, прибл. 0,17 г/л

Буфер: цитрат, прибл. 0,03 М

Йод (I ₂): 0,03 г/л

CaCl₂: 1,85 мМ

pH: 2,50 ± 0,05

Температура инкубирования: 40°C

Время реакции: 23 секунды

Длина волны: 590 нм

Концентрация фермента: 0,025 AFAU/мл

Рабочий диапазон концентраций фермента: 0,01-0,04 AFAU/мл

Активность глюкоамилазы (AGU)

Единица Novo глюкоамилазы (AGU) определяется как количество фермента, которое гидролизует 1 микромоль мальтозы в минуту при 37°C и pH 4,3.

Активность определяется в единицах AGU/мл методом, измененным в соответствии с (AEL-SM-0131, доступный по запросу от Novozymes) использованием набора Glucose GOD-Perid (Boehringer Mannheim, 124036). Стандарт: AMG-стандарт, партия 7-1195, 195 AGU/мл. 375 мкл субстрата (1% мальтоза в 50 мМ ацетате натрия, pH 4,3) инкубируют 5 минут при 37°C. Добавляют 25 мкл фермента, растворенного в ацетате натрия. Реакцию останавливают через 10 минут, добавляя 100 мкл 0,25 М NaOH. 20 мкл переносят в 96-луночный титровальный микропланшет и добавляют 200 мкл раствора GOD-PERID (124036, Boehringer Mannheim). Через 30 минут инкубирования при комнатной температуре измеряют поглощение при 650 нм и вычисляют активность в AGU/мл на основе AMG-стандарта. Подробное описание аналитического метода (AEL-SM-0131) можно получить по запросу от Novozymes.

Пуллуланазная активность (PUN)

Одна единица активности пуллуланазы (PUN) определяется как количество фермента, которое способно вызывать образование 1 микромоля глюкозы из пуллулана (субстрат) в минуту при 50°C и pH 5 (цитратный буфер).

Образцы, содержащие пуллуланазу, инкубируют с субстратом (красный пуллулан). Эндо-пуллуланаза гидролизует альфа-1,6-гликозидные связи в красном пуллулане с образованием красных продуктов расщепления субстрата. Нерасщепленный субстрат осаждают этанолом. Величину образовавшегося окрашивания измеряют спектрофотометрически при 510 нм, при этом она пропорциональна активности эндо-пуллуланазы в образце. Развитие окрашивания в образцах сравнивают с окрашиванием в образцах с известной пуллуланазной активностью.

Пуллуланаза является пуллулан-6-глюкано-гидролазой и имеет индекс в классификации ферментов E.C. 3.2.1.41.

Условия реакции

Температура 50°C ± 2°C

pH 5,0

Концентрация субстрата 0,67% (красный пуллулан)

Концентрация фермента 0,04 - 0,13 PUN/мл

Время реакции 30 мин

Длина волны 510 нм

Реагенты/субстраты

Раствор хлорида калия 0,5 М

Красный пуллулан (субстрат) 2% (поставщик Megazyme, Австралия)

Цитратный буфер 0,05 М pH 5,0

Цитратный буфер 0,05 М pH 5,0 с 25 мМ цистеина

Этанол 99,8%

Стандартный препарат пуллуланазы 904 PUN/г, растворенный в 0,05 М цитратном буфере до стандартного разведения в ряду 0,05-0,20 PUN/мл.

Чистый цитратный буфер 0,05 М

Образцы фермента растворяли в 0,05 М цитратном буфере до активности в пределах 0,06-0,20 PUN/мл и сравнивали с рядом стандартных разведений.

Пример 1

В данном примере анализировали способность различных пуллуланаз к расщеплению несбраживаемых углеводов (декстрин/DP4/4+) в заторе.

100% хорошо растворенного солода затирали, используя профиль температуры затирания, включающий 46°C в течение 26 минут с последующим повышением температуры на 1°C/мин до 64°C, после чего температуру поддерживали на постоянном уровне. Пробы отбирали в 98, 128 и 158 минут.

Ферменты добавляли в 0 минут. Глюкоамилазу и альфа-амилазу добавляли ко всем образцам в количествах 1000 AGU/кг DS и 250 AFAU/кг DS, соответственно. Пуллуланазу добавляли согласно таблице 1.

Образцы кипятили 10 минут и фильтровали (размер пор 0,20 мкм). Образцы анализировали с помощью ВЭЖХ и вычисляли % несбраживаемого углевода (DP4/4+).

Таблица 1 % Несбраживаемого углевода после затирания в течение 98, 128 и 158 минут
Тип пуллуланазы	Количество в мг/кг DS	Продолжительность затирания
		98 минут	128 минут	158 минут
нет	0	28,87	25,16	22,94
Пуллуланаза 1	0,74	27,64	24,55	21,96
Пуллуланаза 1	3,65	23,96	21,35	18,92
Пуллуланаза 1	7,25	20,71	17,74	16,11
Пуллуланаза 1	14,39	16,36	14,47	13,22
Пуллуланаза 2	1,86	28,34	25,21	22,79
Пуллуланаза 2	9,26	26,81	23,28	21,36
Пуллуланаза 2	18,40	25,68	22,33	20,17
Пуллуланаза 2	36,59	23,56	20,58	18,35
Пуллуланаза 3	1,37	27,11	23,38	20,51
Пуллуланаза 3	2,74	24,46	20,93	18,18

Данные в Таблице 1 использовали для вычисления, с помощью регрессии, доз ферментов пуллуланазы 1 и пуллуланазы 2, требуемых для получения того же эффекта, что и при 2,74 мг фермента/кг пуллуланазы 3 (см. Таблицу 2).

Таблица 2 Количество фермента пуллуланазы (мг/кг DS), требуемое для достижения того же эффекта, что и с 2,74 мг пуллуланазы 3, в процессе затирания в течение 98, 128 и 158 минут
Продолжительность затирания	Пуллуланаза 1	Пуллуланаза 2
98 минут	3,38	27,33
128 минут	4,04	31,06
158 минут	4,56	40,37

Из приведенных результатов можно увидеть, что пуллуланаза 3 является самым эффективным ферментом. Следовательно, требуется меньшее количество фермента пуллуланазы 3, чтобы уменьшить количество несбраживаемых углеводов (декстрин/DP4/4+) и, таким образом, увеличить разжижение сусла.

Пример 2

В настоящем примере анализировали профиль pH и профиль температур различных пуллуланаз.

Исследования профилей pH и температуры были основаны на сравнительном анализе активности фермента с условиями, описанными ниже.

Основы аналитического метода

Альфа-1,8-гликозидные связи в пуллулане гидролизовали ферментом пуллуланазой, а повышение содержания редуцирующих сахаров детектировали с помощью измененного метода Шомоди-Нельсона.

В настоящем эксперименте активность оценивали как относительную активность, при этом наиболее активный образец принимали за 100%. Условия теста являлись следующими:

Буфер: цитратный 0,1 М + 0,2 М фосфата (профиль pH доведен до pH 5 в профиле температур)

Субстрат: 0,2% пуллулан Sigma (p-4516)

Температура: 60°C в профиле pH, доведенном в профиле температур

Время реакции: 30 минут

Редуцирующие сахара, образованные под действием пуллуланаз, детектировали согласно принципу, описанному Нельсоном (Nelson, 1944, J. Biol. Chem. 153: 375-380) и Шомоди (Somogyi, 1945, J, Biol. Chem. 160: 61-68). Вкратце, реакцию гидролиза останавливали, добавляя реактив Шомоди в объеме, соответствующем объему пробы (например, 2 мл к пробе объемом 2 мл). Пробы кипятили в течение 20 минут и охлаждали перед цветной реакцией. Данную реакцию выполняли, добавляя реактив Нельсона, соответствующий ½ объема пробы (например, 2 мл к 4 мл пробы+реактив Шомоди). Пробы смешивали в течение 2 минут с последующим добавлением воды в том же количестве, что и реактива Нельсона. Пробы инкубировали 30 минут в темноте и измеряли на спектрофотометре при 540 нм.

Реактивы могут быть приготовлены следующим образом.

Реактив Шомоди:

Для приготовления раствора растворяют 70,2 г Na ₂HPO₄×2H₂O и 80,0 г KNaC ₄H₄O₆×4H₂O (тартрата калия-натрия) в 1000 мл H₂O (слегка подогретой). Затем добавляют 60 г NaOH, 16,0 г CuSO₄×5H₂ O и 360,0 г Na₂SO₄ и доводят объем водой до 2000 мл. Уровень pH доводят до 10,8 с использованием NaOH.

Реактив Нельсона:

Для приготовления раствора растворяют 100,0 г (NH₄)₆Mo ₇O₂₄×7H₂O в 1200 мл H₂ O. Осторожно добавляют 84,0 мл H₂SO₄. Затем растворяют 12,00 г Na₂HAsO₄×7H ₂O (гидроарсената динатрия) в 100 мл H₂O, медленно добавляют полученный раствор к первому раствору и доводят объем водой до 2000 мл.

Профили pH и температуры для трех пуллуланаз приведены в Таблице 3 и 4 ниже.

Таблица 3 Профиль pH, данный для относительной активности (%) фермента при 60°C
pH	Пуллуланаза 1	Пуллуланаза 2	Пуллуланаза 3
2,4	2,2	1	0,2
2,8	6	2,4	30,7
3,7	10,8	68,5	90
4,2	23,1	100	100
5	94	77,4	92,4
5,8	92,8	31,7	74,2
6,3	43,1	4,4	45,3
6,7	3,7	0	1,8
7,3	0	0	0

Таблица 4 Профиль температур, данный для относительной активности (%) фермента при pH 5,0
Темп. °C	Пуллуланаза 1	Пуллуланаза 2	Пуллуланаза 3
30	22,8	36,7	19,7
45	64,4	72,5	47,3
55	100	100	76,8
60	99,6	85,2	92,6
62,5	87,1	70	101,2
65	42,1	54,4	100
70	9,4	12,7	75,6

Приведенные результаты показывают, что пуллуланаза 3 обладает широким профилем pH и активностью при высоких температурах при сравнении с другими двумя пуллуланазами. Указанные свойства делают пуллуланазу 3 очень стабильным ферментом в процессе производства пива (в условиях затирания), в частности, при температурах осахаривания 62-65°C.

Пример 3

Тест настойного затирания проводили с пуллуланазой 1 и 3 (SEQ ID NO: 1 и 4). Приготовили 8 образцов для затирания, содержащих 100% ячменя в качестве субстрата (крупка).

Ячмень (% содержание сухих веществ: 86,73) дробили и каждый образец массой 50,0 г (43,34 г сухих веществ) смешивали с 200 г водопроводной воды при температуре 50°C и 3,0 мл 1 М H₃PO₄.

Во все образцы добавляли идентичную смесь ферментов без пуллуланазы.

Затем к образцам 1-6 добавляли пуллуланазу согласно следующей таблице.

Активность дозы фермента/г
№ образца	Пуллуланаза 1 PUN/г	Пуллуланаза 3 PUN/г
1	0,1	-
2	0,2	-
3	0,5	-
4	-	0,1
5	-	0,2
6	-	0,5

Затем образцы анализировали на автоматизированном оборудовании для затирания, работающем по следующей программе.

Время в минутах	Темп. °C
0-30	50
30-44	повышение до 64
44-104	64
104-120	повышение до 80
120-140	80
140-155	охлаждение до 20

После затирания во все образцы добавляли водопроводную воду до 300 г и фильтровали. Затем фильтрованные образцы кипятили в течение 10 минут и разбавляли 1:1 деионизованной водой. Аликвоты 50 мл центрифугировали и подвергали стандартному анализу плотности для вычисления % RDF (реальной степени брожения). Результаты приведены в виде % RDF и содержания сахара в сусле (DP2 и DP4+) в %.

PUN/г	Пуллуланаза 1	Пуллуланаза 3
0	0	0
0,1	64	64,6
0,2	65	66,1
0,5	67,3	69,5

	Пуллуланаза 1		Пуллуланаза 3
PUN/г	DP2	DP4+	DP2	DP4+
0	48,5	31,5	48,5	31,5
0,1	48,5	30	49	29
0,2	49,5	29	50	27,5
0,5	50,5	36,5	н.д.	н.д.

Результаты показывают, что пуллуланаза 3 заметно превосходит пуллуланазу 1, обеспечивая высокий % RDF, при этом пуллуланаза 3 способна создавать уровни мальтозы (уровни DP2) даже лучше, чем пуллуланаза 1.

Пример 4

Тест настойного затирания проводили с пуллуланазой 3 (SEQ ID NO: 4) с целью оценки свойств пуллуланазы 3 при получении мальтозы. 6 Образцов для затирания приготовили со 100% ячменем в качестве субстрата (крупка).

Ячмень (% содержание сухих веществ: 86,73) дробили и каждый образец массой 50,0 г (43,34 г сухих веществ) смешивали с 200 г водопроводной воды при температуре 50°C и 5% Na₂SO₃ и 1 М H₃PO₄.

Во все образцы добавляли идентичную смесь ферментов без пуллуланазы.

Затем к образцам 1-6 добавляли пуллуланазу 3 согласно следующей таблице:

№ образца	Пуллуланаза 3PUN/г
1	-
2	0,1
3	0,3
4	0,5
5	1,0
6	2,0

Затем образцы анализировали на автоматизированном оборудовании для затирания, работающем по следующей программе.

Время в минутах	Темп. °C
0-30	50
30-44	повышение до 64
44-104	64
104-120	повышение до 80
120-140	80
140-155	охлаждение до 20

После затирания во все образцы добавляли водопроводную воду до 300 г и фильтровали. Затем фильтрованные образцы кипятили в течение 10 минут и разводили 1:1 деионизованной водой. Аликвоты 50 мл центрифугировали и подвергали анализу. Получили следующие результаты:

PUN/г	% глюкозы	% мальтозы	% декстрина	% RDF
0	3,8	47,5	34	61,2
0,1	3,8	48,2	32	63,2
0,3	3,8	49,8	28,8	65,7
0,5	3,7	51,2	26,4	68,6
1	3,7	52,6	23,9	71
2	3,6	55,6	20,1	74,3

Результаты показывают, что концентрация мальтозы увеличивается при увеличении дозировки пуллуланазы 3, причем увеличение % мальтозы сопровождается увеличением разжижения (% RDF). В то же время фракция декстрина (ВЭЖХ анализ DP4/4+) уменьшается.

Только бета-амилаза ячменя может вызывать образование мальтозы в данной реакции, при этом пуллуланаза 3 усиливает действие бета-амилазы ячменя.

Концентрация глюкозы является низкой, при этом на нее не влияет действие пуллуланазы 3, что является преимуществом при сбраживании полученного сусла. Пуллуланаза 3 способствует расщеплению декстрина, а также облегчает формирование мальтозы под действием бета-амилазы ячменя и, таким образом, повышает разжижение (% RDF) сусла.