Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных кислот

Классы МПК:C07K19/00 Гибридные пептиды
C12N9/00 Ферменты, например лигазы (6); проферменты; композиции их; способы получения, активирования, ингибирования, разделения или очистки ферментов
C12P7/64 жиры; жирные масла; воски эфирного типа; высшие жирные кислоты, те содержащие не менее семи атомов углерода в непрерывной цепи, связанной с карбоксильной группой; окисленные масла или жиры
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):Е.И.ДЮПОН ДЕ НЕМУР ЭНД КОМПАНИ (US)
Приоритеты:
подача заявки:
2008-04-03
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве и пищевой промышленности. Сконструированы рекомбинантные нуклеотидные последовательности (НП), кодирующие полипептиды (ДГЛК-синтазы), которые состоят из дельта-9-элонгазы и дельта-8-десатуразы, независимо и раздельно проявляющих присущие им ферментативные активности. Предложены содержащие эти НП генетические конструкции и трансформированные указанными конструкциями клетки-хозяева, предпочтительно клетки масличных растений и дрожжей, которые экспрессируют активный фермент ДГЛК-синтазу и могут быть использованы для получения в указанных клетках длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, в частности промышленно значимых дигомо-гамма-линоленовой и эйкозатетраеновой. 10 н. и 8 з.п. ф-лы, 119 ил., 36 табл., 62 пр.

Данная заявка провозглашает приоритет предварительной заявки США № 60/909790 от 3 апреля 2007 года и предварительной заявки США № 61/027898 от 12 февраля 2008 года, на которые в данном тексте сделаны полные ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к области биотехнологии. Более конкретно, данное изобретение касается полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют мультизимы, и их использования в синтезе длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Важность ПНЖК неоспорима. Например, некоторые ПНЖК являются важными биологическими компонентами здоровых клеток и признаны как: «незаменимые» жирные кислоты, которые не могут быть синтезированы de novo в млекопитающих, и вместо этого должны получаться или через пищу или путем дополнительного удлинения и десатурации линолевой кислоты (ЛК; 18:2 омега-6) или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -линоленовой кислоты (АЛК; 18:3 омега-3); составляющие плазматических клеточных мембран, где они могут быть найдены в таких формах как фосфолипиды или триацилглицерины; необходимые для соответствующего развития (особенно в развитии мозга младенца) и для формирования и восстановления ткани; и, предшественники нескольких биологически активных эйкозаноидов, важных для млекопитающих (например, простациклинов, эйкозаноидов, лейкотриенов, простагландинов). Кроме того, значительное потребление длинноцепочечных омега-3 ПНЖК продуцирует кардиоваскулярные защитные эффекты (Dyerberg et al., Amer. J. Clin. Nutr. 28:958-966 (1975); Dyerberg et al., Lancet. 2(8081):117-119 (1978); Shimokawa, H., World Rev. Nutr. Diet 88:100-108 (2001); von Schacky et al., World Rev. Nutr. Diet 88:90-99 (2001)). Многочисленые другие исследования свидетельствуют о значительной пользе для здоровья, которую приносит использование омега-3 и/или омега-6 ПНЖК против разнобразных симптомов и болезней (например, астмы, псориаза, экземы, диабета, рака).

В настоящее время исследуется множество различных хозяев, включая растения, водоросли, грибы и дрожжи, как средств для промышленного производства ПНЖК путем использования многочисленных разнообразных попыток. Хотя производительные способности организмов-хозяев в отношении природных ПНЖК иногда существенны для данной методологии, генная инженерия также показала, что природные способности некоторых хозяев (даже тех, которым присуща природная ограниченная способность к производству ЛК и АЛК жирных кислот) могут быть значительно изменены в плане повышения уровня производства различных длинноцепочечных омега-3/омега-6 ПНЖК. Независимо от того, является ли этот эффект результатом природных способностей или рекомбинантной технологии, арахидоновая кислота (АРК; 20:4 омега-6), эйкозапентаеновая кислота (ЭПК; 20:5 омега-3), и докозагексаеновая кислота (ДГК; 22:6 омега-3) требуют экспрессии либо дельта-9-элонгаза/дельта-8-десатуразного пути (который действует в некоторых организмах, таких как вид эвгленоидных, и который характеризуется выработкой эйкозадиеновой кислоты (ЭДК; 20:2 омега-6) и/или эйкозатриеновой кислоты (ЭТрК; 20:3 омега-3)) или дельта-6-десатураза/дельта-6-элонгазного пути (который находят, преимущественно, в водорослях, мхах, грибах, нематодах и человеческом организме, и который характеризуется выработкой гамма-линоленовой кислоты (ГЛК; 18:3 омега-6) и/или стеаридоновой кислоты (СТК; 18:4 омега-3)) (ФИГ.1). Дельта-6-элонгаза известна также как C18/20-элонгаза.

Идентифицированные до сих пор дельта-8-десатуразные ферменты обладают способностью к превращению как ЭДК в дигомо гамма-линоленовую кислоту (ДГЛК (известную также как ГГЛК); 20:3, n-6) так и ЭТрК в эйкозатетраеновую кислоту (ЭТК; 20:4, n-3). АРК и ЭПК потом синтезируются из ДГЛК и ЭТК, соответственно, по реакции с дельта-5-десатуразой. Однако синтез ДГК требует последующей экспрессии дополнительной C20/22-элонгазы и дельта-4-десатуразы. Большинство идентифицированных до сих пор C20/22-элонгаз обладают главной способностью к превращению ЭПК в ДПК, и вторичной активностью в отношении превращения арахидоновой кислоты (АРК; 20:4 омега-6) в докозатетраеновую кислоту (ДТК; 22:4 омега-6), тогда как большинство идентифицированных до сих пор дельта-4-десатуразных ферментов обладают главной способностью к превращению ДПК в ДГК, и вторичной активностью в отношении превращения докозатетраеновой кислоты (ДТК; 22:4 омега-6) в мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -6 докозапентаеновую кислоту (ДПКn-6; 22:5 омега-6).

Исходя из той роли, которую играют C20/22 -элонгазный и дельта-4-десатуразный ферменты в синтезе ДГК, были предприняты значительные усилия для идентификации и анализа этих ферментов из различных источников. Как таковые, многочисленные C20/22-элонгазы были раскрыты как в открытой так и патентной литературе (например, Pavlova sp. CCMP459 (номер доступа GenBank AAV33630), Ostreococcus tauri (номер доступа GenBank AAV67798) и Thalassiosira pseudonana (номер доступа GenBank AAV67800)). Подобно этому, были раскрыты следующие дельта-4-десатуразы: Euglena gracilis (SEQ ID NO:13; номер доступа GenBank AAQ19605; Meyer et al., Biochemistry, 42(32):9779-9788 (2003)); Thalassiosira pseudonana (SEQ ID NO:29; номер доступа GenBank AAX14506; Tonon et al., FEBS J., 272(13):3401-3412 (2005)); Thraustochytrium aureum (SEQ ID NO:27; номер доступа GenBank AAN75707); Thraustochytrium sp. (номер доступа GenBank CAD42496; патент США № 7087432); Schizochytrium aggregatum (SEQ ID NO:28; PCT публикация № WO 2002/090493); Pavlova lutheri (номер доступа GenBank AAQ98793); and Isochrysis galbana (SEQ ID NO:30; номер доступа GenBank AAV33631; Pereira et al., Biochem. J., 384(2):357-366 (2004); PCT публикация № WO 2002/090493)].

Правопреемник заявителя имеет ряд патентных заявок, которые касаются производства ПНЖК в жировых дрожжах (т.е. Yarrowia lipolytica), включая, например: патенты США № № 7238482 и 7125672; заявка США № 11/265761 (от 2 ноября 2005 года); заявка США № 11/264784 (от 1 ноября 2005 года); заявка США № 11/264737 (от 1 ноября 2005 года).

Подобным образом, PCT публикация № WO 2004/071467 (опубликована 26 августа 2004 года) касается производства ПНЖК в растениях, тогда как РСТ публикация № WO 2004/071178 (опубликована 26 августа 2004 года) касается аннексиновых промоторов и их использования в экспрессии трансгенов в растениях. Обе являются совместными заявками правопреемника заявителя, которые находятся на рассмотрении.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение касается мультизима, который включает отдельный полипептид, обладающий по меньшей мере двумя независимыми и раздельными ферментативными активностями.

Во втором варианте ферментативные активности данного мультизима могут выбираться из группы, которая состоит из элонгазы жирных кислот, десатуразы жирных кислот, ацилтрансфераз, ацил CoA синтаз и тиоэстераз. Более конкретно, ферментативные активности могут включать по меньшей мере одну элонгазу жирных кислот, связанную с по меньшей мере одной десатуразой жирных кислот.

В третьем варианте данный мультизим может включать первую ферментативную активность, связанную со второй ферментативной активностью, и указанная связь выбирается из группы, которая состоит из полипептидной связи, SEQ ID NO:198 (линкер EgDHAsyn1), SEQ ID NO:200 (линкер EgDHAsyn2), SEQ ID NO:235 (1 линкер EaDHAsyn), SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:472, и SEQ ID NO:504.

В четвертом варианте изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего ДГК синтазу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как это изложено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, или SEQ ID NO:97;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410; или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового количества нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

В пятом варианте данное изобретение касается полинуклеотида, кодирующего полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где нуклеотидная последовательность включает SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410.

В шестом варианте данное изобретение касается полипетида данного изобретения, обладающего ДГК синтазной активностью, где аминокислотная последовательность данного полиппетида включает SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, или SEQ ID NO:97.

В седьмом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего C20-элонгазу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью C20-элонгазы, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:202 (EgDHAsyn1 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:204 (EgDHAsyn2 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:231 (EaDHAsyn1 домен C 20-элонгазы), SEQ ID NO:232 (EaDHAsyn2 домен C20 -элонгазы) или SEQ ID NO:233 (EaDHAsyn3 домен C20-элонгазы);

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью C20-элонгазы, где данная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201 (EgDHAsyn1 домен C20 -элонгазы), SEQ ID NO:206 (EgDHAsyn1* домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:203 (EgDHAsyn2 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:227 (EaDHAsyn1 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:228 (EaDHAsyn2 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:229 (EaDHAsyn3 домен C20-элонгазы) или SEQ ID NO:230 (EaDHAsyn4 домен C20-элонгазы);

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью C20 -элонгазы, где данный нуклеотид гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201 (EgDHAsyn1 домен C20 -элонгазы), SEQ ID NO:206 (EgDHAsyn1* домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:203 (EgDHAsyn2 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:227 (EaDHAsyn1 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:228 (EaDHAsyn2 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:229 (EaDHAsyn3 домен C20-элонгазы) или SEQ ID NO:230 (EaDHAsyn4 домен C20-элонгазы); или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового количества нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

В восьмом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего дельта-4-десатуразу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает дельта-4-десатуразной активностью, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406, или SEQ ID NO:408;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью дельта-4-десатуразы, где данная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:214, SEQ ID No:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405, или SEQ ID NO:407;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью дельта-4-десатуразы, где данная нуклеотидная последовательность гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405, или SEQ ID NO:407; или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового количества нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

В девятом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, который кодирует ДГК синтазу, указанный полинуклеотид включает последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410.

В десятом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего C20-элонгазу, указанный фермент полинуклеотид кодирует C20-элонгазу, указанный полинуклеотид включает последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201 (EgDHAsyn1 домен C20-элонгазы, SEQ ID NO:206 (EgDHAsyn1* домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:203 (EgDHAsyn2 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:227 (EaDHAsyn1 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:228 (EaDHAsyn2 домен C20-элонгазы), SEQ ID NO:229 (EaDHAsyn3 домен C20-элонгазы) или SEQ ID NO:230 (EaDHAsyn4 домен C 20-элонгазы).

В одиннадцатом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего дельта-4-десатуразу, указанный полинуклеотид включает последовательность, представленную в SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID No:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405, или SEQ ID NO:407.

В двенадцатом варианте данное изобретение касается рекомбинантного конструкционного элемента, который включает любой из выделенных полинуклеотидов данного изобретения, связанный оперативно с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью.

В тринадцатом варианте данное изобретение касается клетки-хозяина, которая содержит в своем геноме рекомбинантный конструкционный элемент данного изобретения. Более конкретно, клетка-хозяин представляет собой рекомбинантную микробную клетку-хозяина, включающую мультизим изобретения, где первой ферментативной активностью является дельта-9-элонгаза, и второй ферментативной активностью является дельта-8-десатураза. В другом аспекте первая ферментативная активность представляет собой С20-элонгазу, и вторая ферментативная активность представляет собой дельта-4-десатуразу.

В четырнадцатом варианте данное изобретение касается трансформированного вида Yarrowia, включающего рекомбинантный конструкционный элемент изобретения.

В пятнадцатом варианте данное изобретение касается способа трансформирования клетки, который включает трансформацию клетки рекомбинантным конструкционным элементом данного изобретения и селекцию этих клеток, трансформированных посредством указанного рекомбинантного конструкционного элемента.

В шестнадцатом варианте данное изобретение касается способа получения трансформированного растения, который включает трансформацию растительной клетки любым из полинуклеотидов данного изобретения и восстановление растения из трансформированной растительной клетки.

В семнадцатом варианте данное изобретение касается способа получения дрожжей, который включает трансформацию дрожжевой клетки любым из полинуклеотидов данного изобретения и выращивание дрожжей из трансформированной дрожжевой клетки.

В восемнадцатом варианте данное изобретение касается растения, которое содержит в своем геноме рекомбинантный конструкционный элемент изобретения. Также представляют интерес семена, полученные от таких растений, масло, полученное из таких семян, пища или корм, которые содержат такое масло, и напиток, который содержит масло данного изобретения.

В девятнадцатом варианте данное изобретение касается изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует C20-элонгазу, как представлено в SEQ ID NO:183, где по меньшей мере 147 кодонов кодон-оптимизировано для экспрессии в Yarrowia.

В двадцатом варианте данное изобретение касается изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует C20-элонгазу, как представлено в SEQ ID NO:188, где по меньшей мере 134 кодона кодон-оптимизированы для экспрессии в Yarrowia.

В двадцать первом варианте данное изобретение касается изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует дельта-4-десатуразный фермент, как представлено в SEQ ID NO:192, где по меньшей мере 285 кодонов кодон-оптимизированы для экспрессии в Yarrowia.

В двадцать втором варианте данное изобретение касается способа получения мультизима, который включает:

(a) связывание первого полипетида с по меньшей мере вторым полипептидом, где каждый полиппетид обладает независимой и раздельной ферментативной активностью; и

(b) оценку продукта стадии (a) в отношении независимой и раздельной ферментативных активностей.

В двадцать третьем варианте данное изобретение касается способа изменения жирнокислотного профиля масличного растения, который включает:

a) трансформацию клетки масличного растения посредством рекомбинантного конструкционного элемента данного изобретения;

b) восстановление растения из трансформированной клетки масличного растения стадии (a), где данное растение имеет измененный жирнокислотный профиль.

В двадцать четвертом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего ДГЛК синтазу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГЛК синтазной активностью, где данный полипептид представлен в SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:454, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:515, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:518, или SEQ ID NO:519;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГЛК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:495, или SEQ ID NO:496;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полиппетид, котрый обладает ДГЛК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:495, или SEQ ID NO:496; или

комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового количества нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

В двадцать пятом варианте данное изобретение касается способа превращения линолевой кислоты в дигомо гамма-линоленовую кислоту, которая включает:

a) предоставление рекомбинантной микробной клетки-хозяина, которая включает:

i) ДГЛК синтазу, включая:

1) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-9-элонгазу;

2) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-8-десатуразу; и

3) полипептидный линкер;

где данный линкер помещен между дельта-9-элонгазой и дельта-8-десатуразой; и

ii) источник линолевой кислоты; и

b) выращивание клетки-хозяина (a) при условиях, в которых образуется дигомо гамма-линоленовая кислота.

В двадцать шестом варианте данное изобретение касается способа превращения мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -линоленовой кислоты в эйкозатриеновую кислоту, который включает:

a) предоставление рекомбинантной микробной клетки-хозяина, которая включает:

i) ДГЛК синтазу, включая:

1) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-9-элонгазу;

2) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-8-десатуразу; и

3) полипептидный линкер;

где данный линкер помещен между дельта-9-элонгазой и дельта-8-десатуразой; и

ii) источник мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -линоленовой кислоты; и

b) выращивание клетки-хозяина (a) при условиях, в которых образуется эйкозатриеновая кислота.

В двадцать седьмом варианте данное изобретение касается способа превращения эйкозапентаеновой кислоты в докозагексаеновую кислоту, котрый включает:

a) предоставление рекомбинантной микробной клетки-хозяина, которая включает:

i) ДГК синтазу, включая:

1) по меньшей мере один полипептид, кодирующий C20-элонгазу;

2) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-4-десатуразу; и

3) полипептидный линкер;

где данный линкер помещен между C20-элонгазой и дельта-4-десатуразой; и

ii) источник ейкозапентаеновой кислоты; и

b) выращивание клетки-хозяина (a) при условиях, в которых образуется докозагексаеновая кислота.

В двадцать восьмом варианте данное изобретение касается способа превращения арахидоновой кислоты в докозапентаеновую кислоту, который включает:

a) предоставление рекомбинантной микробной клетки-хозяина, которая включает:

i) ДГК синтазу, включая:

1) по меньшей мере один полипептид, кодирующий C20-элонгазу;

2) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-4-десатуразу; и

3) полипептидный линкер;

где данный линкер помещен между C20-элонгазой и дельта-4-десатуразой; и

ii) источник арахидоновой кислоты; и

b) выращивание клетки-хозяина (a) при условиях, в которых образуется докозапентаеновая кислота.

В двадцать девятом варианте данное изобретение касается способа идентификации полипептида, обладающего улучшенной активностью дельта-4-десатуразы, который включает:

a) предоставление дельта-4-десатуразного полипептида дикого типа, выделенного из Euglena anabena, обладающего базисной активностью дельта-4-десатуразы;

b) усечение полипептида (a) дикого типа на приблизительно от 1 до приблизительно 200 аминокислот для создания усеченного мутантного полипептида, обладающего активностью дельта-4-десатуразы, которая повышена по сравнению с базисной активностью дельта-4-десатуразы.

В тридцатом варианте данное изобретение касается микробной клетки-хозяина, которая продуцирует полиненасыщенную жирную кислоту и экспрессирует полипептиды, кодирующие ферменты, на следующем последовательном пути:

1) дельта-9-десатураза,

2) дельта-12-десатураза,

3) дельта-9-элонгаза,

4) дельта-8-десатураза,

5) дельта-5-десатураза,

6) дельта-17-десатураза,

7) C 20/22-элонгаза, и

8) дельта-4-десатураза;

где данные полипептиды включают по меньшей мере один мультизим, слияние, включая слияние между по меньшей мере одной смежной ферментной парой.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ДЕПОЗИТЫ

Следующие биологические материалы сохраняются в Американском собрании типовых культур (АСТК), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, и имеют следующие обозначения, номера доступа и даты вложения (Таблица 1).

ТАБЛИЦА 1

АСТК депозиты
ОписаниеНомер доступаДата вложения
Плазмида pKR72АСТК PTA-6019 28 мая 2004 г.
Yarrowia lipolytica Y4128ACTK PTA-8614 23 августа 2007 г.
Yarrowia lipolytica Y4127АСТК РТА-8802 29 ноября 2007 г.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ И ЛИСТИНГОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данное изобретение может быть лучше понято из последующего подробного описания и сопроводительных рисунков, и листинга последовательностей, которые образуют часть данной заявки.

ФИГ.1 представляет собой репрезентативный омега-3 и омега-6 жирнокислотный путь, представленный для превращения миристиновой кислоты через разные интермедиаты в ДГК.

ФИГ.2 изображает группировку Clustal W между участком кодирующей последовательности EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:21), кДНК последовательностью Euglena gracilis дельта-40-десатуразы (SEQ ID NO:23) (номер доступа НЦБИ AY278558 (GI 33466345), локус AY278558, Meyer et al., Biochemistry 42(32):9779-9788 (2003)), и кодирующей последовательностью Euglena gracilis дельта-4-десатуразы (SEQ ID NO:24) (Meyer et al., supra).

ФИГ.3A и 3B изображают группировку Clustal W между аминокислотной последовательностью EgDHAsyn1 (SEQ ID NO:12), EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22), и EgC 20elo1 (SEQ ID NO:6).

ФИГ.4A и 4B изображают группировку Clustal W N-конца EgDHAsyn1 (SEQ ID NO:12) и N-конца EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) ch EgC20elo1 (SEQ ID NO:6), Pavlova sp. CCMP459 C20-PUFA Elo (SEQ ID NO:2), Ostreococcus tauri ПНЖК элонгаза 2 (SEQ ID NO:25) (номер доступа НЦБИ AAV67798 (GI 55852396), локус AAV67798, CDS AY591336; Meyer et al., J. Lipid Res. 45(10):1899-1909 (2004)), и Thalassiosira pseudonana ПНЖК элонгаза 2 (SEQ ID NO:26) (номер доступа НЦБИ AAV67800 (GI 55852441), локус AAV67800, CDS AY591338; Meyer et al., J. Lipid Res. 45(10):1899-1909 (2004)).

ФИГ.5A , 5B, 5C и 5D изображают группировку Clustal W C-конца EgDHAsyn1 (EgDHAsyn1_CT; аминокислоты 253-793 SEQ ID NO:12; N-конец EgDHAsyn1 не показан и обозначен мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) и C-конца EgDHAsyn2 (EgDHAsyn2_CT; аминокислоты 253-793 SEQ ID NO:22, N-конец EgDHAsyn2 не показан и обозначен мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) с Euglena gracilis дельта-4-десатуразы жирных кислот (SEQ ID NO:13), Thraustochytrium aureum дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:27) (номер доступа НЦБИ AAN75707(GI 25956288), локус AAN75707, CDS AF391543), Schizochytrium aggregatum дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:28) (PCT публикация № WO 2002/090493), Thalassiosira pseudonana дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:29) (номер доступа НЦБИ AAX14506 (GI 60173017), локус AAX14506, CDS AY817156; Tonon et al., FEBS J. 272 (13):3401-3412 (2005)), и Isochrysis galbana дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:30) (номер доступа НЦБИ AAV33631 (GI 54307110), локус AAV33631, CDS AY630574; Pereira et al., Biochem. J., 384(2):357-366 (2004) и PCT публикация № WO 2002/090493).

ФИГ.6 изображает группировку внутренних фрагментов EgDHAsyn1 (EgDHAsyn1_ NCT; аминокислот 253-365 SEQ ID NO:12) и EgDHAsyn2 (EgDHAsyn2_NCT; аминокислот 253-365 SEQ ID NO:22), связывающую как участок C20 -элонгазы, так и дельта-4-десатуразный домен (основываясь на гомологии), с C-концами C20-элонгаз (EgC20 elo1_CT, аминокислот 246-298 SEQ ID NO:6; PavC20elo_CT, аминокислот 240-277 SEQ ID NO:2; OtPUFAelo2_CT, аминокислот 256-300 SEQ ID NO:25; TpPUFAelo2_CT, аминокислот 279-358 SEQ ID NO:26) и N-концы дельта-4-десатураз (EgD4_NT, аминокислот 1-116 SEQ ID NO:13; TaD4_NT, аминокислот 1-47 SEQ ID NO:27; SaD4_NT, аминокислот 1-47 SEQ ID NO:28; TpD4_NT, аминокислот 1-82 SEQ ID NO:29; IgD4_NT, аминокислот 1-43 SEQ ID NO:30).

ФИГ.7 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY115 (см. также SEQ ID NO:33); (B) Yarrowia lipolytica Gateway® дестинационный вектор pBY1 (см. также SEQ ID NO:34); (C) Yarrowia lipolytica Gateway® дестинационный вектор pY159 (см. также SEQ ID NO:38); и (D) pBY-EgC20elo1 (см. также SEQ ID NO:39).

ФИГ.8 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY132 (см. также SEQ ID NO:40); (B) pY161 (см. также SEQ ID NO:41); (C) pY164 (см.также SEQ ID NO:42); и (D) pY141 (см. также SEQ ID NO:49).

ФИГ.9 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY143 (см. также SEQ ID NO:52); (B) pY149 (см. также SEQ ID NO:55); (C) pY150 (см. также SEQ ID NO:62); и (D) pY156 (см. также SEQ ID NO:64).

ФИГ.10 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY152 (см. также SEQ ID NO:67); (B) pY157 (см. также SEQ ID NO:69); (C) pY153 (см. также SEQ ID NO:72); и (D) pY151 (см. также SEQ ID NO:76).

ФИГ.11 представляет собой карту pY160 (см. также SEQ ID NO:77).

ФИГ.12 представляет хроматограмму липидного профиля Euglena anabaena клеточного экстракта, как описано в Примерах.

ФИГ.13A, 13B и 13C изображают группировку Clustal W аминокислотных последовательностей для EaDHAsyn1 (SEQ ID NO:95), EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:96), EaDHAsyn3 (SEQ ID NO:97), и EaDHAsyn4 (SEQ ID NO:98).

ФИГ.14 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY165 (см. также SEQ ID NO:99); (B) pY166 (см. также SEQ ID NO:100); (C) pY167 (см. также SEQ ID NO:101); и (D) pY168 (см. также SEQ ID NO:102).

ФИГ.15 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pKR1061 (см. также SEQ ID NO:111); (B) pKR973 (см. также SEQ ID NO:128); (C) pKR1064 (см. также SEQ ID NO:132); и (D) pKR1133 (см. также SEQ ID NO:145).

ФИГ.16 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pKR1105 (см. также SEQ ID NO:156); (B) pKR1134 (см. также SEQ ID NO:161); (C) pKR1095 (см. также SEQ ID NO:167); и (D) pKR1132 (см. также SEQ ID NO:170.

ФИГ.17 представляет собой карту KS373 (см. также SEQ ID NO:179).

ФИГ.18 изображает жирнокислотные профили, вычисленные % элонгации, и вычисленные % десатурации для клонов (кроме pBY-EgC20elo1), показанных в Таблице 24ФИГ.19 изображает жирнокислотные профили, вычисленные % элонгации, и вычисленные % десатурации для подачи ЭПК только к контрольному вектору, pY141, pY143, pY149, pY156, pY157, и pY160.

ФИГ.20 изображает жирнокислотные профили, вычисленные % элонгации и вычисленные % десатурации для подачи ДПК только к контрольному вектору, pY141, pY150, pY151, pY152, pY153, pY156, pY157, и pY160.

ФИГ.21 представляет схему относительной доменной структуры для каждого конструкционного элемента, описанного в Таблице 25.

ФИГ.22 изображает жирнокислотные профили, вычисленные % элонгации и вычисленные % десатурации для подачи ЭПК, АРК и ДПК к клеткам Yarrowia, трансформированным pY141 (EgDHAsyn1; SEQ ID NO:49), и только к контрольному вектору.

ФИГ.23 изображает жирнокислотные профили для индивидуальных зародышей из репрезентативного события в соматических соевых зародышах, трансформированных соевыми экспрессирующими векторами pKR973 и pKR1064 (см. Таблицу 26).

ФИГ.24 изображает жирнокислотные профили из пяти наилучших элонгационных событий в соевых зародышах, трансформированных соевым экспрессирующим вектором KS373.

ФИГ.25 резюмирует данные BLASTP и значения процентов идентичности для EgC20elo1 (Пример 3), EgDHAsyn1 (Пример 4), и EgDHAsyn2 (Пример 5).

ФИГ.26 изображает жирнокислотные профили от питания соевых зародышей ЭПК. Данные соевые зародыши были выбраны из наилучших C20 /дельта-5-элонгазной и дельта-4-десатуразной активностей в соевых зародышах, трансформированных соевым экспрессирующим вектором pKR1105.

ФИГ.27 изображает хроматограмму липидного профиля Euglena gracilis клеточного экстракта, как описано в данных Примерах.

ФИГ.28 представляет собой карту pKR1183 (см. также SEQ ID NO:266).

ФИГ.29 резюмирует Euglena anabaena ДГК синтазные доменные последовательности.

ФИГ.30 представляет собой карту pKR1253 (см. также SEQ ID NO:270).

ФИГ.31 представляет собой карту pKR1255 (см. также SEQ ID NO:275).

ФИГ.32 представляет собой карту pKR1189 (см. также SEQ ID NO:285).

ФИГ.33 представляет собой карту pKR1229 (см. также SEQ ID NO:296).

ФИГ.34 представляет собой карту pKR1249 (см. также SEQ ID NO:297).

ФИГ.35 представляет собой карту pKR1322 (см. также SEQ ID NO:314).

ФИГ.36 показывает жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1189, которые имеют самое низкое среднее содержание АЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей), совместно с событием (2148-3-8-1), которое имеет жирнокислотный профиль, типичный для зародышей дикого типа для этого эксперимента. Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК и АЛК. Составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот.

ФИГ.37 показывает жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1183, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей). Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, ЭРК, ДГЛК и ЭТК. Составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот.

ФИГ.38 показывает усредненные жирнокислотные профили (среднее из 10 соевых соматических зародышей) для 20 событий, трансформированных pKR1249 и pKR1253, которые имеют наивысшее АРК. Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, СКК, ДГЛК, АРК, ЭРК, ЮН, ЭТК и ЭПК. Составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот. Жирные кислоты, перечисленные как "другие", включают: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), СТК, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) или 20:2 (8,11), и ДПК.

ФИГ.39 показывает фактические жирнокислотные профили для каждого соевого соматического зародыша из одного события (AFS 5416-8-1-1), со средним содержанием АРК 17,0% и средним содержанием ЭПК 1,5%. Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, СКК, ДГЛК, АРК, ЭРК, ЮН, ЭТК и ЭПК. Составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот. Жирные кислоты, перечисленные как "другиемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , включают: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), СТК, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) или 20:2 (8,11), и ДПК.

ФИГ.40 показывает усредненные жирнокислотные профили (среднее из 9 или 10 соевых соматических зародышей) для 20 событий, тансформированных pKR1249 и pKR1255, которые имеют наивысшее АРК. Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, СКК, ДГЛК, АРК, ЭРК, ЮН, ЭТК и ЭПК; составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот. Жирные кислоты, перечисленные как "другие", включают: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), СТК, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) или 20:2 (8,11), и ДПК.

ФИГ.41 показывает жирнокислотные профили при питании зародышей ЭПК. Соевые зародыши выбирались из событий с наилучшими активностями C20 -дельта-элонгазы и дельта-4-десатуразы в соевых зародышах, трансформированных соевым экспрессирующим вектором pKR1134. Жирные кислоты на ФИГ.41 идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭПК, 22:0 (докозановая кислота), ДПК, 24:0 (тетракозановая кислота), ДГК и 24:1 (невоновая кислота). Составы жирных кислот, перечисленных на ФИГ.41, выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот.

ФИГ.42 показывает жирнокислотные профили при питании соевых зародышей ЭПК. Соевые зародыши выбирались из событий с наилучшими активностями C20-дельта-5-элонгазы и дельта-4-десатуразы из 20 новых событий, проанализированных для сои, трансформированной pKR1105. Жирные кислоты на ФИГ.42 идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭПК, 22:0 (докозановая кислота), ДПК, 24:0 (тетракозановая кислота), ДГК и 24:1 (невоновая кислота). Составы жирных кислот, перечисленных на ФИГ.42, выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот.

ФИГ.43 представляет собой график, изображающий относительные активности событий, трансформированных или pKR1105 (C20-элонгаза и дельта-4-десатуразы экспрессированы отдельно) или pKR1134 (C20-элонгаза и дельта-4-десатураза экспрессированы как гибрид), когда соевые зародыши питались ЭПК.

ФИГ.44 представляет схему создания штамма Y4305U3 Yarrowia lipolytica.

ФИГ.45 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZKLeuN-29E3 и (B) pY116.

ФИГ.46 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pKO2UF8289 и (B) pZKSL-555R.

ФИГ.47 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZP3-Pa777U и (B) pY117.

ФИГ.48 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZP2-2988 и (B) pZKUE3S.

ФИГ.49 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZKL2-5U89GC и (B) pZKL1-2SP98C.

ФИГ.50 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZKUM и (B) pZKD2-5U89A2.

ФИГ.51A представляет схему создания штамма Y4184U Yarrowia lipolytica. ФИГ.51B представляет плазмидную карту для pEgC20ES.

ФИГ.52 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZUFmEgC20ES и (B) pZKL4-220EA4. ФИГ.52C представляет схему, показывающую перекрывание участка 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaC20E домена (SEQ ID NO:231) участком 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD4 домена (SEQ ID NO:246) внутри EaDHAsyn1 (SEQ ID NO:95).

ФИГ.53A показывает группировку N-концов EaD4S (SEQ ID NO:193), EaD4S-1 (SEQ ID NO:382), EaD4S-2 (SEQ ID NO:384), и EaD4S-3 (SEQ ID NO:386). ФИГ.53B показывает группировку N-концов EgD4S (SEQ ID NO:388), EgD4S-1 (SEQ ID NO:404), EgD4S-2 (SEQ ID NO:406), и EgD4S-3 (SEQ ID NO:408).

ФИГ.54 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZKLY-G204, (B) pEgC20ES-K, (C) pYNTGUS1-CNP, и (D) pZKLY.

ФИГ.55 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZUFmG9G8fu и (B) pZUFmG9A8.

ФИГ.56 представляет собой карту pKR1014.

ФИГ.57 представляет собой карту pKR1152.

ФИГ.58 представляет собой карту pKR1151.

ФИГ.59 представляет собой карту pKR1150.

ФИГ.60 представляет собой карту pKR1199.

ФИГ.61 представляет собой карту pKR1200.

ФИГ.62 представляет собой карту pKR1184.

ФИГ.63 представляет собой карту pKR1321.

ФИГ.64 представляет собой карту pKR1326.

Для ФИГ.65-71, жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, ЭРК, ДГЛК и ЭТК, и составы жирных кислот выражены как весовой процент (вес. %) от общего количества жирных кислот. Кроме того, элонгационная активность выражена как % дельта-9-элонгации C18 жирных кислот (C18% дельта-9-элонг), вычисленный в соответствии со следующей формулой: ([продукт]/[субстрат+продукт])*100. Более конкретно, комбинированный процент элонгации для ЛК и АЛК определяется как: ([ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК]/[ЛК+АЛК+ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК])*100. Комбинированный процент десатурации для ЕДК и ЭРК, представленный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 C20 % дельта-8-десатмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , определяется как: ([ДГЛК+ЭТК]/[ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК])*100, и на него также ссылаются как на полный % десатурацииФИГ.65 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1014, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей).

ФИГ.66 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1152, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей).

ФИГ.67 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1151, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей).

ФИГ.68 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1150, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей).

ФИГ.69 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1199, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей).

ФИГ.70 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1200, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей).

ФИГ.71 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1184, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей).

ФИГ.72 представляет сравнение индивидуально экспрессированных дельта-9-элонгаз и дельта-8-десатураз относительно эквивалентного дельта-9-элонгаза-дельта-8-десатуразного гибрида. Каждая точка данных представляет средний % ДГЛК или % ЭДК для 5-6 зародышей (как % от общего количества жирных кислот) для всех проанализированных событий, и построен график зависимости Средн. % ДГЛК от Средн. % ЭДК. На (A), EgTpom представляет EgD9e, коэкспрессированный с TpomD8 (pKR1014), и EgTpomfus представляет EgD9e/TpomD8 гибрид (pKR1199). На (B), EgEa представляет EgD9e, коэкспрессированный с EaD8 (pKR1152), и EgEafus представляет EgD9e/EaD8 гибрид (pKR1200). На (C), EaTpom представляет EaD9e, коэкспрессированный с TpomD8 (pKR1151), и EaTpomfus представляет EaD9e/TpomD8 гибрид (pKR1183). На ФИГ.(D), EaEa представляет EaD9e, коэкспрессированный с EaD8 (pKR1150), и EaEafus представляет EaD9e/EaD8 гибрид (pKR1200).

ФИГ.73 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1322 (Эксперимент MSE2274), которые имеют самое высокое среднее содержание АРК и ЭПК (среднее из 5 проанализированных зародышей). Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), 18:2 (5,9), ЛК, АЛК, ЭДК, ЭРК, СКК, ДГЛК, ЮН (называемая также ЮП), ЭТК, АРК и ЭПК. Составы жирных кислот выражены как весовой процент (вес. %) от общего количества жирных кислот. Элонгационная активность выражена как % дельта-9-элонгации C 18 жирных кислот (% Эло), вычисленный в соответствии со следующей формулой: ([продукт]/[субстрат+продукт])*100. Более конкретно, комбинированный процент элонгации для ЛК и АЛК определяется как: ([ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК+ЭПА+АРК]/[ЛК+АЛК+ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК+ЭПК+

АРК])*100. Комбинированный процент дельта-8-десатурации для ЭДК и ЭРК, представленный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 % D8мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , определяется как: ([ДГЛК+ЭТК+ЭПК+АРК]/[ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК+ЭПК+АРК])*100. На него ссылаются также как на полный % дельта-8-десатурации. Комбинированный процент дельта-5-десатурации для ДГЛК и ЭТК, представленный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 % D5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , определяется как: ([ЭПК+АРК]/[ДГЛК+ЭТК+ЭПК+АРК])*100. На него также ссылаются как на полный % дельта-5-десатурации.

ФИГ.74 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, тансформированных pKR1326 (Эксперимент MSE2275), которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК и ЭТК (среднее из 5 проанализированных зародышей). Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, ЭРК, ДГЛК и ЭТК. Составы жирных кислот выражены как весовой процент (вес. %) от общего количества жирных кислот. Элонгационная активность выражена как % дельта-9-элонгации C18 жирных кислот (C18 % дельта-9 элонг), вычисленный в соответствии со следующей формулой: ([продукт]/[субстрат+продукт])*100. Более конкретно, комбинированный процент элонгации для ЛК и АЛК определяется как: ([ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК]/[ЛК+АЛК+ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК])*100. Комбинированный процент десатурации для ЭДК и ЭРК, представленный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 C20 % дельта-8-десатмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , определяется как: ([ДГЛК+ЭТК]/[ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК])*100. На него также ссылаются как на полный % десатурации.

Описания последовательностей резюмируют Листинг последовательностей, который прилагается. Листинг последовательностей содержит однобуквенные коды для символов нуклеотидных последовательностей и одно- и трибуквенные коды для аминокислот, как определено в стандартах IUPAC-IUB, которые описаны в Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) и в Biochemical Journal 219(2):345-373 (1984).

SEQ ID NOs:1-519 являются праймерами, ОРС кодируют гены, протеины (или их участки), или плазмиды, как показано в Таблице 2.

ТАБЛИЦА 2

Сводка номеров SEQ ID нуклеиновых кислот и протеинов
Описание и сокращенияНуклеиновая кислота

SEQ ID NO.
Протеин

SEQ ID NO.
M13F универсальный праймер 1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Pavlova sp. CCMP459 полиненасыщенная C20-элонгаза жирных кислот (номер доступа GenBank AAV33630)--2 (277 AA)
Euglena gracilis клон eeg1c.pk005.p14.f 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 последовательность3 (608 bp) --
Euglena gracilis клон eeg1c.pk005.p14.f полно-инсертная последовательность 4 (1327 bp)--
Euglena gracilis клон eeg1c.pk005.p14.f кодирующая последовательность (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgC20elo1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )5 (897 bp) 6 (298 AA)
Праймер SeqE 7--
Праймер SeqW8--
Euglena gracilis клон eeg1c.pk016.e6.f 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 последовательность9 (742 bp) --
Euglena gracilis клон eeg1c.pk016.e6.f полно-инсертная последовательность 10 (2630 bp)--
Euglena gracilis клон eeg1c.pk016.e6.f кодирующая последоват. (ДГК синтаза 1 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )11 (2382 bp) 12 (793 AA)

Euglena gracilis дельта-4-десатуразы жирных кислот (номер доступа GenBank AAQ19605) --13 (541 AA)
M13rev праймер14--
EUGel4-1 праймер 15--
EgEloD4Mut-5 праймер16--
oEUGel4-2 праймер17 --
EgDHAsyn5' праймер18--
EgDHAsyn3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 праймер19--
Euglena gracilis клон eeg1c-1 полно-инсертная последовательность20 (2630 bp) --
Euglena gracilis клон eeg1c-1 кодирующая последовательность (ДГК синтаза 2 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn2мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )21 (2382 bp) 22 (793 AA)
Euglena gracilis дельта-4-десатураза кДНК последоват. (номер доступа GenBank AY278558) 23 (2569 bp)--
Euglena gracilis дельта-4-десатураза кодирующая последоват. (номер доступа GenBank AY278558)24 (1626 bp) --
Ostreococcus tauri ПНЖК элонгаза 2 (номер доступа GenBank AAV67798) --25 (300 AA)
Thalassiosira pseudonana ПНЖК элонгаза 2 (номер доступа GenBank AAV67800)--26 (358 AA)
Thraustochytrium aureum дельта-4-десатураза (номер доступа GenBank. AAN75707)-- 27 (515 AA)
Schizochytrium aggregatum дельта-4-десатураза (PCT публикация No. WO 2002/090493) --28 (509 AA)
Thalassiosira pseuduonana дельта-4-десатуразы жирных кислот (номер доступа GenBank AAX14506) --29 (550 AA)
Isochrysis galbana дельта-4-десатураза (номер доступа GenBank AAV33631) --30 (433 AA)
Плазмида pDMW263 31 (9472 bp)--
Плазмида pDMW23732 (7879 bp) --
Плазмида pY115 33 (7783 bp)--
Плазмида pBY134 (8704 bp) --
oYFBA1 праймер 35--
oYFBA1-6 праймер36--
Плазмида pY15837 (6992 bp)--
Плазмида pY15938 (8707 bp) --
Плазмида pBY-C20elo1 39 (8425 bp)--
Плазмида pY13240 (9677 bp) --
Плазмида pY161 41 (9680 bp)--
Плазмида pY16442 (9701 bp) --
EgEPAEloDom-5 праймер 43--
oEUG el4-3 праймер44--
Плазмида pKR1062 45 (5914 bp)--
EgEloD4Mut-5 праймер46 --
EgEloD4Mut-3 праймер 47--
Плазмида pLF115-748 (5914 bp) --
Плазмида pY141 49 (9373 bp)--

EgDPAEloDom-3 праймер50 --
Плазмида pHD16 51 (4443 bp)--
Плазмида pY14352 (7903 bp)--
oEUGsyn6-2 праймер53--
Плазмида pKR107154 (4497 bp)--
Плазмида pY14955 (8005 bp) --
oEUGsyn6-3 праймер 56--
Плазмида pKR109157 (4498 bp) --
Плазмида pY155 58 (8006 bp)--
oRIG6-1 праймер59 --
oRIG6-2 праймер 60--
Плазмида pKR106761 (4827 bp) --
Плазмида pY150 62 (8293 bp)--
Плазмида pKR109763 (5795 bp) --
Плазмида pY156 64 (9253 bp)--
oEGslne6-1 праймер65 --
Плазмида pKR1069 66 (4947 bp)--
Плазмида pY15267 (8413 bp) --
Плазмида pKR1099 68 (5915 bp)--
Плазмида pY15769 (9373 bp) --
oEUGel4-4 праймер 70--
Плазмида pKR107371 (5151 bp) --
Плазмида pY153 72 (8617 bp)--
oRSA1-1 праймер73 --
oRSA1-2 праймер 74--
Плазмида pKR106875 (5058 bp) --
Плазмида pY151 76 (8524 bp)--
Плазмида pY16077 (9484 bp) --
EaDHAsyn5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 праймер78--
EaDHAsyn5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 2 праймер79 --
EaDHAsyn5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3 праймер80 --
EaDHAsyn5'4 праймер 81--
EaDHAsyn3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 праймер82--
EaDHAsyn3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 2 праймер83 --
EaDHAsyn3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3 праймер84 --
EaDHAsyn3'4 праймер 85--
EaDHAsyn3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 5 праймер86 --
Плазмида pLF117-1 87 (5582 bp)--
Плазмида pLF117-288 (5607 bp) --
Плазмида pLF117-3 89 (5608 bp)--
Плазмида pLF117-490 (5557 bp) --
Euglena anabaena кодирующая последовальность (ДГК синтаза 1 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaDHAsyn1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )91 (2523 bp) 95 (841 AA)
Euglena anabaena кодирующая последовательность (ДГК синтаза 2 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaDHAsyn2мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )92 (2523 bp) 96 (841 AA)
Euglena anabaena кодирующая последовательность (ДГК синтаза 3 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaDHAsyn3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )93 (2523 bp) 97 (841 AA)
Euglena anabaena кодирующая последовательность (ДГК синтаза 4 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaDHAsyn4мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )94 (2442 bp) 98 (814 AA)
Плазмида pY165 99 (10,133 bp)--
Плазмида pY166100 (10,158 bp)--

Плазмида pY167101 (10,159 bp)--
Плазмида pY168102 (10,108 bp) --
oEGel2-1 праймер 103--
Плазмида pKR1055104 (5916 bp) --
Плазмида pKR72 105 (7085 bp)--
oCon-1 праймер106 --
oCon-2 праймер 107--
Плазмида pKR179108 (4480 bp) --
Плазмида pKR1057 109 (6873 bp)--
Плазмида pKR328110 (8671 bp) --
Плазмида pKR1061 111 (12,844 bp)--
Euglena gracilis дельта-9-элонгаза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9eloмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9eмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или EgD9Eмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )112 (777 bp) 513 (258 AA)
oEugEL1-1 праймер 113--
oEugEL1-2 праймер114 --
Плазмида pKR906 115 (4311 bp)--
Плазмида pKR132116 (3983 bp) --
Плазмида pKR953 117 (4771 bp)--
Плазмида pKR287118 (5492 bp) --
Mortierella alpina дельта-5-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 MaD5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )119 (1338 bp) --
Плазмида pKR277 120 (2577 bp)--
Плазмида pKR952121 (5364 bp) --
Плазмида pKR457 122 (5252 bp)--
Модифицированная Kti/NotI/Kti3'Salb3' кассета 123 (2635 bp)--
Pavlova lutheri плазмида дельта-8-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 PavD8мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )124 (1269 bp) --
PvDES5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Not-1 праймер125 --
PvDES3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Not-1 праймер126 --
Плазмида pKR970 127 (9276 bp)--
Плазмида pKR973128 (11,366 bp) --
Плазмида pKR271 129 (6021 bp)--
Плазмида pKR226130 (6524 bp) --
Плазмида pKR886r 131 (9892 bp)--
Плазмида pKR1064132 (14,066 bp) --
Плазмида pZBL119 133 (8503 bp)--
oSGly-2 праймер134 --
oSGly-3 праймер 135--
Плазмида pPSgly32136 (3673 bp) --
Плазмида pKR142 137 (4509 bp)--
Плазмида pKR264138 (4171 bp) --
Плазмида pKR1128 139 (6564 bp)--
Плазмида pKS129140 (5671 bp) --
Плазмида pKR606 141 (6601 bp)--
Плазмида pKR804142 (6494 bp) --
Плазмида pKR1130 143 (10,349 bp)--
Плазмида pKR1131144 (4771 bp) --
Плазмида pKR1133 145 (12,430 bp)--
Плазмида pKS123146 (7048 bp) --
oKti5 праймер 147--
oKti6 праймер148--
Плазмида pKR124 149 (4990 bp)--
Плазмида pKR193150 (4474 bp) --
Плазмида pKR1103 151 (5397 bp)--
Плазмида pKR1104152 (9226 bp) --

Плазмида pKR300153 (8649 bp)--
Schizochytrium aggregatum дельта-4-десатураза* (внутренний AscI сайт удален) 154 (1607 bp) --
Плазмида pKR1102 155 (6851 bp)--
Плазмида pKR1105156 (13,424 bp) --
oEUGsyn6-4 праймер 157--
Плазмида pKR1107158 (4498 bp) --
Плазмида pKR1112 159 (4461 bp)--
Плазмида pKR1115160 (5989 bp) --
Плазмида pKR1134 161 (10,807 bp)--
Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491 дельта-8-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 TpomD8мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )162 (1260 bp) 514 (420 AA)
TpomNot-5 праймер 163--
TpomNot-3 праймер164 --
Плазмида pLF114-10 165 (4300 bp)--
Плазмида pKR1002166 (5754 bp) --
Плазмида pKR1095 167 (11,725 bp)--
Плазмида pKR1127168 (5445 bp) --
Плазмида pKR1129 169 (9230 bp)--
Плазмида pKR1132170 (11,311 bp) --
Euglena gracilis ДГК синтаза 1 линкер171 (54 bp) --
MWG507 праймер 172--
MWG509 праймер173--
MWG510 праймер 174--
MWG511 праймер175--
EgD9elo-EgДГКсин1линк 176 (839 bp)--
Плазмида KS366177 (5213 bp) --
KS366-EgD9эло-EgДГКсин1линк 178 (5559 bp)--
Плазмида KS373 179 (6842 bp)--
Законсервированный мотив в C-конце для C20-элонгазных доменов--180 (11 AA)
SMART IV праймер 181--
Адаптерный праймер из набора Invitrogen 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -RACE182--
Синтетическая C20-элонгаза из Euglena gracilis, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgC20ESмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )183 (912 bp) 184 (303 AA)
Плазмида pEgC 20ES185 (3632 bp) --
NG мотив, размещенный на C-конце каждого из C20-элонгазных доменов EgDHAsyn1, EgDHAsyn2 и EgC20elo1-- 186
PENGA мотив, размещенный на C-конце каждого из C20-элонгазных доменов EgDHAsyn1, EgDHAsyn2 и EgC20elo1-- 187
Синтетическая C20-элонгаза из Euglena anabaena, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaC20ESмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )188 (900 bp) 189 (299 AA)
Плазмида pEaC 20ES190 (3620 bp) --
PCENGTV мотив, размещенный на C-конце каждого из С20-элонгазных доменов EgDHAsyn1, EgDHAsyn2 и EgC20elo1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 191

Синтетическая дельта-4-десатураза из Euglena anabaena, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD4Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )192 (1752 bp) 193 (583 AA)
Дельта-4-десатураза генный домен EaDHAsyn2 (т.е. соответствующий аминокислотам 259-841 SEQ ID NO:96)194 (1749 bp) 195 (583 AA)
Плазмида pEaD4S 196 (4472 bp)--
Euglena gracilis EgDHAsyn1 обогащенный пролином линкер197 (54 bp) 198 (18 AA)
Euglena gracilis EgDHAsyn2 обогащенный пролином линкер199 (54 bp) 200 (18 AA)
Euglena gracilis EgDHAsyn1 домен C20-элонгазы 201 (909 bp)202 (303 AA)
Euglena gracilis EgDHAsyn2 домен C20-элонгазы 203 (909 bp)204 (303 AA)
Euglena gracilis EgDHAsyn1* (внутренний NcoI сайт удален)205 (2379 bp) --
Euglena gracilis EgDHAsyn1* домен C20-элонгазы (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn1C20EloDom1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )206 (909 bp) --
Euglena gracilis EgDHAsyn1* C20-элонгаза домен обогащенный пролином линкерный слитый ген (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn1C20EloDom2Linkerмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )207 (975 bp) 208 (325 AA)
Isochrysis galbana дельта-4-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 IgD4мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )209 (1299 bp) --
Isochrysis galbana дельта-4-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 IgD4*мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) (введен внутренний SbfI сайт)210 (1299 bp)211 (433 AA)
Внутрикаркасное слияние EgDHAsyn1C20EloDom3Linker и IgD4*, разделенных участком обогащенного пролином линкера (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn1C20EloDom3-IgD4*мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )212 (2259 bp) 213 (753 AA)
Euglena gracilis EgDHAsyn1D4Dom1 214 (1416 bp)215 (472 AA)
Euglena gracilis EgDHAsyn1D4Dom1* 216 (1419 bp)217 (473 AA)
Euglena gracilis EgDHAsyn1C 20EloDom3-EgD4Dom1218 (2379 bp) 219 (793 AA)
Euglena gracilis EgDHAsyn1D4Dom2220 (1623 bp) 221 (541 AA)
Schizochytrium aggregatumмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-4-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 SaD4мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )222 (1530 bp) --
Schizochytrium aggregatum дельта-4-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 SaD4*мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) (введен внутренний sbfI сайт)223 (1530 bp)224 (510 AA)
Внутрикаркасное слияние EgDHAsyn1C20EloDom3 и SaD4*, разделенных участком обогащенного пролином линкера (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn1C20EloDom3-SaD4*мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )225 (2490 bp) 226 (830 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn1 домен C20-элонгазы227 (897 bp) 231 (299 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn2 домен C20-элонгазы 228 (897 bp)232 (299 AA)

Euglena anabaena EaDHAsyn3 домен C20 -элонгазы229 (897 bp) 233 (299 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn4 домен C20-элонгазы230 (897 bp) --
Euglena anabaena EaDHAsyn1 обогащенный пролином линкер234 (99 bp)235 (33 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn1 дельта-4-десатуразный домен 1 236 (1527 bp)239 (509 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn2 дельта-4-десатуразный домен 1237 (1527 bp)240 (509 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn4 дельта-4-десатуразный домен 1 238 (1446 bp)241 (482 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn1 дельта-4-десатуразный домен 2 (включающий обогащенный пролином линкер и часть 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конца C20-элонгазного домена) 242 (1749 bp)246 (583 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn2 дельта-4-десатуразный домен 2 (включающий обогащенный пролином линкер и часть 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конца C20-элонгазного домена) 243 (1749 bp)247 (583 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn3 дельта-4-десатуразный домен 2 (включающий обогащенный пролином линкер и часть 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конца C20-элонгазного домена) 244 (1749 bp)248 (583 AA)
Euglena anabaena EaDHAsyn4 дельта-4-десатуразный домен 2 (включающий обогащенный пролином линкер и часть 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конца C20-элонгазного домена) 245 (1668 bp)249 (556 AA)
Плазмида pLF121-1250 (3668 bp)--
Плазмида pLF121-2251 (3684 bp) --
Euglena anabaena дельта-9-элонгаза 1 (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD9Elo1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ); на которую здесь также ссылаются как на мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD9Eмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD9eмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 252 (774 bp) 254 (258 AA)
Euglena anabaena дельта-9-элонгаза 2 (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD9Elo2мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )253 (774 bp) 255 (258 AA)
Плазмида pLF119 256 (4276 bp)--
Euglena anabaena дельта-5-десатураза 1 (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD5Des1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )257 (1362 bp) 258 (454 AA)
EaD9-5Bbs праймер 259--
EaD9-3fusion праймер260 --
EgDHAsyn1Link-5fusion прайм 261--
EaD9Elo1-EgDHAsyn1Link 262 (852 bp) --
Плазмида pLF124 263 (5559 bp)--
Плазмида pKR1177264 (5559 bp)--
Плазмида pKR1179265 (7916 bp) --
Плазмида pKR1183 266 (9190 bp)--
Euglena gracilis дельта-5-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )267 (1350 bp) --
Плазмида pKR1237 268 (6615 bp)--
Плазмида pKR1252269 (6464 bp) --
Плазмида pKR1253 270 (10,387 bp)--
oEAd5-1-1 праймер271 --
oEAd5-1-2 праймер 272--
Плазмида pKR1136273 (4899 bp) --
Плазмида pKR1139 274 (5592 bp)--

Плазмида pKR1255275 (13,293 bp)--
Плазмида pKR561276 (7497 bp) --
Соевая дельта-15-десатураза (fad3) (номер доступа GenBank L22964; также называемая GmFAD3B) 277 (1143 bp)--
HPfad3-1 праймер278 --
HPfad3-2 праймер 279--
HPfad3AB ампликон280 (709 bp) --
HPfad3-3 праймер 281--
HPfad3Aмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -2 ампликон282 (709 bp) --
HPfad3ABAмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -2 ампликон283 (1014 bp) --
Плазмида pLF129 284 (4526 bp)--
Плазмида pKR1189285 (8503 bp) --
Плазмида pKR1209 286 (4112 bp)--
GmFad3C (номер доступа GenBank AY204712) 287 (1143 bp)288 (380 AA)
fad3c-5 праймер289 --
fad3c-3 праймер 290--
Плазмида pKR1213291 (3764 bp) --
Плазмида pKR1218 292 (4353 bp)--
Плазмида pKR1210293 (3742 bp) --
Плазмида pKR1219 294 (3983 bp)--
Плазмида pKR1225295 (4894 bp) --
Плазмида pKR1229 296 (8979 bp)--
Плазмида pKR1249297 (10,221 bp) --
oEAd9el1-1 праймер 298--
oLINK-1 праймер299--
Плазмида pKR1298 300 (4362 bp)--
oTPd8-1 праймер301 --
oTPd8fus-1 праймер 302--
oLINK-2 праймер303--
oLINK-1 праймер 304--
TpomD8-EgDHAsyn1Link 305 (1335 bp)--
Плазмида pKR1291 306 (4848 bp)--
Плазмида pKR1301307 (4284 bp) --
Плазмида pKR1301R 308 (4284 bp)--
Плазмида pKR1311309 (4228 bp) --
Плазмида pKR1304 310 (3201 bp)--
Плазмида pKR1309311 (4041 bp) --
Плазмида pKR1313 312 (5604 bp)--
Плазмида pKR1315313 (6474 bp) --
Плазмида pKR1322 314 (10,627 bp)--
Плазмида pZKLeuN-29E3315 (14,688 bp) --
Fusarium moniliforme дельта-12-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 FmD12мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )316 (1434 bp) 317 (477 AA)
Синтетическая дельта-9-элонгаза из Euglena gracilis, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9eSмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )318 (777 bp) 319 (258 AA)
Escherichia coli LoxP рекомбинационный сайт, распознаваемый Cre рекомбиназным ферментом 320 (34 bp)--
Синтетическая C16/18-элонгаза из Mortierella alpina ELO3, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ME3Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )321 (828 bp) 322 (275 AA)

Плазмида pY116323 (8739 bp)--
Плазмида pKO2UF8289324 (15,337 bp) --
Yarrowia lipolytica дельта-12-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YlD12мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )325 (1936 bp) 326 (419 AA)
Синтетическая мутантная дельта-8-десатураза ("EgD8M"; патентная заявка США № 11/635258), из Euglena gracilis (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD8Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; PCT публикация № WO 2006/012326) 327 (1272 bp) 328 (422 AA)
Euglena gracilis дельта-9-элонгаза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9eмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )329 (777 bp) 330 (258 AA)
Плазмида pZKSL-555R 331 (13,707 bp) --
Синтетическая дельта-5-десатураза из Euglena gracilis (патентная заявка США № 11/748629), кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD5Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )332 (1350 bp) 333 (449 AA)
Синтетическая дельта-5-десатураза из Peridinium sp. CCMP626 (патентная заявка США № 11/748637), кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 RD5Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )334 (1392 bp) 335 (463 AA)
Euglena gracilis дельта-5-десатураза (патентная заявка США № 11/748629) (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )336 (1350 bp) 337 (449 AA)
Плазмида pZP3-Pa777U 338 (13,066 bp)--
Синтетическая дельта-17-десатураза из Pythium aphanidermatum, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (патентная заявка США № 11/779915) (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 PaD17Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) 339 (1080 bp) 340 (359 AA)
Pythium aphanidermatum дельта-17-десатураза (патентная заявка США № 11/779915) (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 PaD17мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )341 (1080 bp) 342 (359 AA)
Плазмида pY117 343 (9570 bp)--
Yarrowia lipolytica мутантный ацетогидроксикислотный синтазный (AHAS) ген, включающий W497L мутацию 344 (2987 bp)--
Плазмида pZP2-2988345 (15,743 bp) --
Синтетическая дельта-12-десатураза из Fusarium moniliforme, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 FmD12Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )346 (1434 bp) 347 (477 AA)
Плазмида pZKL2-5U89GC 348 (15,812 bp)--
Yarrowia lipolytica диацилглицерол холинфосфотрансферазный ген (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YlCPT1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )349 (1185 bp) 350 (394 AA)
Плазмида pZKUE3S 351 (6303 bp)--
Плазмида pZKL1-2SP98C 352 (15,877 bp)--
Плазмида pZKUM353 (4313 bp) --

Синтетический мутантный Ura3 ген, который содержит 33 bp делецию от +21 до +53, 1 bp делецию в +376 и 3 bp делецию от +400 до +403 Yarrowia Ura3 кодирующего участка (номер доступа GenBank AJ306421)354 (1459 bp)--
Плазмида pZKD2-5U89A2355 (15,966 bp) --
Yarrowia lipolytica диацилглицерол ацилтрансфераза (DGAT2) (PCT публикация № WO 2005/003322; патент США № 7267976)356 (2119 bp) 357 (514 AA)

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Синтетическая дельта-9-элонгаза из Eutreptiella sp. CCMP389, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 E389D9eSмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )358 (792 bp) 359 (263 AA)
Плазмида pZuFmEgC20ES 360 (7904 bp)--
Плазмида pZuFmEaC20ES 361 (7892 bp)--
Плазмида pZKL4-220EA4362 (13,412 bp) --
Yarrowia lipolytica липаза 4-подобный локус (номер доступа GenBank XM_503825) 363 (1221 bp)--
Плазмида pZuFmEaD4S 364 (8744 bp)--
Плазмида pZuFmIgD9ES365 (7783 bp) --
Праймер YL921 366--
Праймер YL922367--
Праймер YL923368 --
Праймер YL924 369--
Праймер YL925370--
Праймер YL926 371--
Плазмида pZuFmEaD4S-M1372 (8746 bp) --
Плазмида pZuFmEaD4S-M2 373 (8747 bp)--
Плазмида pZuFmEaD4S-M3374 (8744 bp) --
Плазмида pZuFmEaD4S-1 375 (8636 bp)--
Плазмида pZuFmEaD4S-2 376 (8576 bp)--
Плазмида pZuFmEaD4S-3377 (8531 bp) --
Плазмида pZKL4-220EA4-1 378 (13,304 bp)--
Плазмида pZKL4-220EA4-2 379 (13,244 bp)--
Плазмида pZKL4-220EA4-3380 (13,199 bp) --
Усеченная синтетическая дельта-4-десатураза из Euglena anabaena, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD4S-1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )381 (1644 bp) 382 (547 AA)
Усеченная синтетическая дельта-4-десатураза из Euglena anabaena, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD4S-2мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )383 (1584 bp) 384 (527 AA)
Усеченная синтетическая дельта-4-десатураза из Euglena anabaena, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD4S-3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )385 (1539 bp) 386 (512 AA)
Синтетическая дельта-4-десатураза из Euglena gracilis, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD4Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )387 (1623 bp) 388 (540 AA)

Плазмида pEgD4S 389 (4343 bp)--
Плазмида pZKL4-220Eg4390 (13,283 bp) --
Праймер YL935 391--
Праймер YL936392--
Праймер YL937 393--
Праймер YL938394--
Праймер YL939395 --
Праймер YL940 396--
Плазмида pEgD4S-M1397 (4344 bp) --
Плазмида pEgD4S-M2 398 (4346 bp)--
Плазмида pEgD4S-M3399 (4346 bp) --
Плазмида pZKL4-220Eg4-1 400 (13,202 bp)--
Плазмида pZKL4-220Eg4-2 401 (13,133 bp)--
Плазмида pZKL4-220Eg4-3402 (13,085 bp) --
Усеченная синтетическая дельта-4-десатураза из Euglena gracilis, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD4S-1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )403 (1542 bp) 404 (513 AA)
Усеченная синтетическая дельта-4-десатураза из Euglena gracilis, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD4S-2мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )405 (1473 bp) 406 (490 AA)
Усеченная синтетическая дельта-4-десатураза из Euglena gracilis, кодон-оптимизмрованная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD4S-3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )407 (1425 bp) 408 (474 AA)
Плазмида pZKLY-G204 409 (10,417 bp)--
Синтетическая ДГК синтаза из Euglena gracilis, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn1Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )410 (2382 bp) 411 (793 AA)
Плазмида pEgC20ES-K 412 (3632 bp)--
Праймер YL973413 --
Праймер YL974 414--
Плазмида pYNTGUS1-CNP415 (6652 bp) --
Плазмида pZKLY 416 (9045 bp)--
Yarrowia lipolytica липазный 7 локус (номер доступа GenBank AJ549519) 417 (2173 bp) 418 (366 AA)
Eutreptiella sp. CCMP389 дельта-9-элонгаза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 E389D9eмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )419 (792 bp) 420 (263 AA)
Синтетическая дельта-9-элонгаза из Euglena anabaena UTEX 373, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD9eSмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )421 (774 bp) 422 (258 AA)
Euglena gracilis дельта-8-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Eg5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD8мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )423 (1271 bp) 424 (421 AA)

Синтетическая дельта-8-десатураза из Euglena gracilis, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 D8SF" или "EgD8S") 425 (1272 bp)426 (422 AA)
Euglena anabaena UTEX 373 дельта-8-десатураза (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD8Des3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ); на которую здесь ссылаются также как на мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD8мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 427 (1260 bp) 428 (420 AA)
Синтетическая дельта-8-десатураза из Euglena anabaena UTEX 373, кодон-оптимизированная для экспрессии в Yarrowia lipolytica (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaD8Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 )429 (1260 bp) 430 (420 AA)
Плазмида pZuFmEgD9ES 431 (7769 bp)--
Плазмида pZuFmEgD9ES-Na 432 (7778 bp)--
Праймер YL989433--
Праймер YL990 434--
Праймер YL991435--
Праймер YL992436 --
Плазмида pKO2UFm8A 437 (8428 bp)--
Модифицированный Yarrowia линкер GPARPAGLPPATYYDSLAV --438 (19 AA)
Плазмида pZUFmG9G8fu 439 (9098 bp)--
EgD9ES/EgD8M генное слияние440 (2106 bp) 441 (701 AA)
Плазмида pZUFmG9G8fu-B442 (9104 bp) --
Праймер YL1043 443--
Праймер YL1044444--
Модифицированный Yarrowia линкер GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS --445 (24 AA)
EgD9ES/EgD8M генное слияние 446 (2112 bp)447 (703 AA)
Плазмида pEaD8S448 (3988 bp)--
Праймер YL1059449--
Праймер YL1060450 --
Плазмида pEaD8S-B 451 (3990 bp)--
Плазмида pZUFmG9A8 452 (9101 bp)--
EgD9ES/EaD8S генное слияние453 (2109 bp) 454 (702 AA)
Плазмида pZUFmEaD9ES455 (7769 bp) --
Плазмида pZUFmEaD9ES-Na 456 (7775 bp)--
Праймер YL1049457 --
Праймер YL1050 458--
Плазмида pZUFmA9G8459 (9104 bp) --
EaD9ES/EgD8M генное слияние 460 (2112 bp)461 (703 AA)
Плазмида pZUFmA9A8 462 (9101 bp)--
EaD9ES/EaD8S генное слияние 463 (2109 bp)464 (702 AA)
Плазмида pE389S465 (3523 bp)--
Плазмида pE389S-Na466 (3529 bp) --
Праймер YL1051 467--
Праймер YL1052468--
Плазмида pZUFmR9G8 469 (9119 bp)--
E389D9eS/EgD8M генное слияние470 (2127 bp)471 (708 AA)

Обогащенный пролином линкер EgDHAsyn1 плюс 4 аминокислотымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 472 (22 AA)
Плазмида pKR1007473 (6267 bp) мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1014 474 (11459 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Праймер EaD8-5 475 (34 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Праймер EaD8-3 476 (30 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pLF120-3 477 (4794 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1138 478 (6526 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1152 479 (11707 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Праймер oEAd9el1-2 480 (26 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1137 481 (4310 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1140 482 (7872 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1145 483 (6526 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1151 484 (11706 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1150 485 (11706 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1190 486 (5559 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1195 487 (6833 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1199 488 (9190 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1196 489 (6833 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1200 490 (9190 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1184 491 (9190 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
EgD9e/TpomD8 слияние 492 (2103 bp)515 (700 AA)
EgD9e/EaD8 слияние 493 (2103 bp)516 (700 AA)
EaD9e/TpomD8 слияние494 (2103 bp)517 (700 AA)
EaD9e/EaD8 сдияние495 (2103 bp) 518 (700 AA)
EgD9e/PavD8 слияние 496 (2112 bp)519 (703 AA)
Плазмида pKR1303 497 (3967 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1308 498 (4754 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR393 499 (5250 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR407 500 (4140 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1018 501 (5414 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1312 502 (5731 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1321 503 (9198 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Обогащенный пролином линкер EaDHAsyn1 плюс 3 аминокислотымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 504 (36 AA)
Праймер EaLink1505 (35 bp) мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Праймер EaLink2 506 (35 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Праймер EaLink3 507 (19 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
EaD9e-EaDHAsyn1Link 508 (894 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1305 509 (4405 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1317 510 (3201 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1320 511 (5816 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
Плазмида pKR1326 512 (9241 bp)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

На каждую из приведеннях в данном тексте работ и других материалов сделана полная ссылка.

Данное изобретение касается мультизимов, таких как ДГК синтаза. Они полезны, помимо всего прочего, для управления биохимическими путями в производстве целебных ПНЖК и, более конкретно, для производства докозагексаеновой кислоты (ДГК). Таким образом, представленное изобретение находит много применений. ПНЖК или их производные, полученные по раскрытой здесь методологии, могут быть использованы как пищевые заменители или добавки, в частности, как питательные смеси для младенцев, для пациентов, подвергающихся внутривенному кормлению, для предупреждения или лечения нарушений питания.

Как альтернатива, очищенные ПНЖК (или их производные) могут быть введены в кулинарные масла, жиры или маргарины, составленные таким образом, что при нормальном применении реципиент получает необходимое количество диетической добавки. ПНЖК могут также водиться в детские смеси, пищевые добавки или другие пищевые продукты и могут найти применение как противовоспалительные или снижающие холестерин агенты. При необходимости, данные композиции могут использоваться для фармацевтических целей (для человека или в ветеринарии). В этом случае ПНЖК применяются, в общем, перорально, но могут использоваться в соответствии с любой схемой, по которой они могут успешно абсорбироваться, например, парэнтерально (например, подкожно, внутримышечно или внутривенно), ректально, вагинально или местным образом (например, как мазь или лосьон для кожи).

Пополнение рационов человека или животного ПНЖК, произведенными рекомбинантными способами, может обеспечить повышенные уровни добавленных ПНЖК, так и их метаболитов. Например, лечение ЭПК может не только повысить уровни ЭПК, но также и уровни более низких продуктов ЭПК, таких как эйкозаноиды (то есть простагландины, лейкотриены, тромбоксаны). Сложные регуляторные механизмы могут сделать желательным комбинирование разных ПНЖК или использование различных конъюгатов ПНЖК с целью предупреждения, контроля или преодоления таких механизмов для достижения необходимых уровней специфических ПНЖК у данного субъекта.

Определения

Как используется в данном тексте и в прилагаемой формуле изобретения, сингулярные формы "a", "an", и "the" включают, если в контексте четко не указано иное, множественные ссылки. Так, например, ссылка на "a plant" включает множество таких растений, ссылка на "a cell" включает одну или несколько клеток и их эквивалентов, которые известны специалистам в данной области, и т.д.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 изобретениемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 данное изобретениемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , как используется в данном тексте, не предполагает ограничения каким-либо одним специфическим вариантом данного изобретения, а применяется, в общем, к любому и ко всем вариантам данного изобретения, как описано в пунктах формулы изобретения и спецификации.

В контексте данной заявки использован ряд терминов и сокращений. Введены следующие определения.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Открытая рамка считываниямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 имеет сокращение ОРС.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Полимеразная цепная реакциямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 имеет сокращение ПЦР.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Американское собрание типовых культурмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 имеет сокращение АСТК.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Полиненасыщенная жирная кислота(ы)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 имеет сокращение ПНЖК.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Триацилглицеринымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 имеют сокращение ТАГ.

Термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 снижать уровень регуляции или снижение уровня регуляциимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , как тут используется, касаются снижения или ослабления уровня экспрессии гена или полинуклеотида.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизиммультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается отдельного полипептида, который обладает по меньшей мере двумя независимыми и раздельными ферментативными активностями. Лучше, когда мультизим включает первую ферментативную активность, связанную со второй ферментативной активностью.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 слитый протеинмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 употребляется взаимозаменяемо с термином мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизиммультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 . Так, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 слитый протеинмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается отдельного полипептида, который обладает по меньшей двумя независимыми и раздельными ферментативними активностями.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 слитый генмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается полинуклеотида или гена, который кодирует мультизим. Слитый ген может быть сконструирован путем связывания по меньшей мере двух ДНК фрагментов, где каждый ДНК фрагмент кодирует независимую и раздельную ферментативную активность. Пример слитого гена описан здесь ниже в Примере 38, где Hybrid1-ГГЛК синтазный слитый ген был сформирован путем связывания Euglena anabaena дельта-9-элонгазы (EaD9Elo1; SEQ ID NO:252) и Tetruetreptia pomquetensis CCMP1491 дельта-8-десатуразы (TpomD8; SEQ ID NO:162) с использованием Euglena gracilis ДГК синтаза 1 обогащенного пролином линкера, (EgDHAsyn1Link; SEQ ID NO:197).

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Доменмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 функциональный доменмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 представляет собой обособленную, непрерывную часть или последовательность полипептида, которая может быть ассоциирована с функцией (например, ферментативной активностью). Как тут применяется, термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 доменмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 включает, но не ограничивается этим, жирнокислотные биосинтетические ферменты и участки жирнокислотных биосинтетических ферментов, котрые сохраняют ферментативную активность.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ДГК синтазамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 служит примером мультизима. Конкретно, ДГК синтаза включает C20-элонгазу, связанную с дельта-4-десатуразой с использованием любого из описанных здесь линкеров. Другим примером мультизима является отдельный полипептид, котрый содержит дельта-9-элонгазу, связанную с дельта-8-десатуразой как описано ниже.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 связьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается соединения или связывания по меньшей мере двух полипептидов, которые обладают независимыми и раздельными ферментативными активностями.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 линкермультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается связи или сцепления между двумя или больше полипептидами, каждый из которых обладает независимыми и раздельными ферментативными активностями.

Связь, используемая для формирования мультизима, включает, как минимум, отдельную полипептидную связь. В другом аспекте, связь может включать один аминокислотный остаток, такой как пролин, или полипептид. Если данная связь является полипептидом, может быть желательно для данной связи иметь по меньшей мере один пролиновый аминокислотный остаток.

Пример линкера показан в SEQ ID NO:198 (EgDHAsyn1 обогащенный пролином линкер).

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 жирные кислотымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается длинноцепочечных алифатических кислот (алкановых кислот) с варьирующими длинами цепи, от приблизительно C12 до C22 (хотя известны кислоты как с более длинными, так и более короткими длинами цепей). Преобладающие длины цепей лежат в области от C16 до C22. Дополнительные детали, которые касаются различий между мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 насыщенными жирными кислотамимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ненасыщенными жирными кислотамимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мононенасыщенными жирными кислотамимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 полиненасыщенными жирными кислотами мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 (или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ПНЖКмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ), и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 омега-6 жирными кислотамимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -6 или n-6) и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 омега-3 жирными кислотамимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -3 або n-3), приведены в патенте США № 7238482.

Жирные кислоты описаны в данном тексте с помощью простой системы обозначений мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 X:Yмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , где X представляет собой полное число углеродных атомов (C) в конкретной жирной кислоте, и Y - число двойных связей. Цифра после обозначения жирной кислоты указывает на положение двойной связи от карбоксильного конца жирной кислоты, с афиксом мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 cмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 для цис-конфигурации данной двойной связи (например, пальмитиновая кислота (16:0), стеариновая кислота (18:0), олеиновая кислота (18:1, 9c), петрозелиновая кислота (18:1, 6c), ЛК (18:2, 9c,12c), ГЛК (18:3, 6c,9c,12c) и АЛК (18:3, 9c,12c,15c)). Если не указано иное, 18:1, 18:2 и 18:3 касаются, соответственно, олеиновой, ЛК и АЛК жирных кислот. Если специально не указано иное, двойные связи имеют, как предполагается, цис-конфигурацию. Например, двойные связи в 18:2 (9,12), как предполагается, находятся в цис-конфигурации.

Номенклатура, которая используется для описания ПНЖК в данной заявке, приведена в Таблице 3 ниже. В колонке, обозначенной мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Стенографическое обозначениемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , используется система омега-ссылок для указания количества углеродных атомов, количества двойных связей и положения двойной связи, ближайшей к омега углеродному атому, считая от этого омега углеродного атома (который с этой целью обозначен номером 1). Остаток таблицы содержит общие названия омега-3 и омега-6 жирных кислот и их предшественников, сокращения, которые будут использованы далее в данной спецификации, и химическое название каждого соединения.

ТАБЛИЦА 3

Номенклатура полиненасыщенных жирных кислот и предшественников
Общее названиеСокращение Химическое название Стенографи-ческое обозначение
Миристиновая-- Тетрадекановая14:0
Пальмитиновая ПК или пальмитат Гексадекановая16:0
Пальмитолеиновая -- 9-гексадекановая16:1
Стеариновая-- Октадекановая18:0
Олеиновая-- цис-9-октадекановая18:1
ЛинолеваяЛК цис-9,12-октадекадиеновая 18:2 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 6
Гамма-линоленовая ГЛКцис-6,9,12-октадекатриеновая 18:3 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 6
Эйкозадие-новая ЭДКцис-11,14-эйкозадиеновая 20:2 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 6
Дигомогамма-линоленовая ДГЛА или ГГЛА цис-8,11,14-эйкозатриеновая 20:3 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 6
Скиадоновая СККцис-5,11,14-эйкозатриеновая 20:3b мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 6
Арахидоновая АРКцис-5,8,11,14-эйкозатетраеновая 20:4 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 6
Альфа-линоленовая АЛКцис-9,12,15-октадекатриеновая 18:3 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3
Стеаридоновая СТКцис-6,9,12,15-октадекатетраеновая 18:4 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3
Эйкозатрие-новая ЭТрК или ЭРКцис-11,14,17- эйкозатриеновая 20:3 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3
Эйкозатетра-еновая ЭТКцис-8,11,14,17-эйкозатетраеновая 20:4 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3
Юнипероновая ЮП или ЮНцис-5,11,14,17-эйкозатриеновая 20:4b мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3

Эйкозапента-еновая ЭПКЦис-5,8,11,14,17- ейкозапентаеновая 20:5 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3
Докозатрие-новая ДРНКЦис-10,13,16-докозатриеновая 22:3 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3
Докозатетра-еновая ДТКЦис-7,10,13,16-докозатетраеновая 22:4 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3
Докозапента-еновая ДПНКЦис-4,7,10,13,16-докозапентаеновая 22:5 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 6
Докозапента-еновая ДПКцис-7,10,13,16,19-докозапентаеновая 22:5 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3
Докозагекса-еновая ДГКцис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая 22:6 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3

Метаболический или биосинтетический путь, в биохимическом смысле, может рассматриваться как ряд химических реакций, которые происходят внутри клетки, которые катализируются ферментами, или для образования метаболического продукта, который используется или сохраняется клеткой, или для инициации другого метаболического пути (который был потом назван стадией генерации потока). Многие из этих путей детально разработаны и включают пошаговую модификацию первичного вещества для его формовання в продукт, которых имеет необходитмую точную химическую структуру.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ПНЖК биосинтетический путьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается метаболического процесса, котрый превращает олеиновую кислоту в ЛК, ЭДК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ДТК, ДПКn-6, АЛК, СТК, ЭТрК, ЭТК, ЭПК, ДПК и ДГК. Этот процесс хорошо описан в литературе (например, смотри РСТ публикацию № WO 2006/052870). Упрощенно говоря, этот процесс включает элонгацию углеродной цепи путем добавления углеродных атомов и десатурации молекулы путем добавления двойных связей через ряд специальных десатурационных и элонгационных ензимов (т.е. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ферментов ПНЖК биосинтетического путимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ), которые присутствуют в мембране эндоплазматичного ретикулума. Более конкретно, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ферменты ПНЖК биосинтетического путимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касаются любого из следующих ферментов (и генов, которые кодируют указанные ферменты), связанных с биосинтезом ПНЖК, включая: дельта-4-десатуразу, дельта-5-десатуразу, дельта-6-десатуразу, дельта-12-десатуразу, дельта-15-десатуразу, дельта-17-десатуразу, дельта-9-десатуразу, дельта-8-десатуразу, дельта-9-элонгазу, С14/16-элонгазу, С16/18-элонгазу, С 18/20-элонгазу, С20/22-элонгазу, ДГК синтазу и/или мультизим настоящего изобретения.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 омега-3/омега-6 жирнокислотный биосинтетический путьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается набора генов, которые, при экспрессии в соответствующих условиях, кодируют ферменты, которые катализируют образование каждой или обеих омега-3 и омега-6 жирных кислот. Типично, гены, которые включены в биосинтетический омега-3/омега-6 жирнокислотный путь, кодируют ПНЖК ферменты биосинтетического пути. Репрезентативный путь иллюстрируется ФИГ.1, представляя конверсию миристиновой кислоты через различные интермедиаты в ДГК, что демонстрирует, каким образом обе омега-3 и омега-6 жирные кислоты могут образовываться из совместного источника. Данный путь природно разделяется на две части, где в одной части будут генерироваться омега-3 жирные кислоты а в другой части омега-6 жирные кислоты.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 функциональныймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , как здесь используется в контексте с омега-3/омега-6 жирнокислотным биосинтетическим путем, означает, что некоторые (или все) гены на данном пути экспрессируют активные ферменты, обеспечивая in vivo катализ или конверсию субстрата. Следует понимать, что мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 омега-3/омега-6 жирнокислотный биосинтетический путьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 функциональный омега-3/омега-6 жирнокислотный биосинтетический путьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 не предусматривает, что необходимы все ПНЖК ферментные гены биосинтетического пути, поскольку ряд жирнокислотных продуктов будет требовать только экспрессии подмножества генов этого пути.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-6-десатураза/дельта-6-элонгазный путьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ПНЖК биосинтетического пути, котрый, как минимум, включает по меньшей мере одну дельта-6-десатуразу и по меньшей мере одну C18/20-элонгазу, обеспечивая тем самым биосинтез ДГЛК и/или ЭТК из ЛК и АЛК, соответственно, с ГЛК и/или СТК как промежуточными жирными кислотами. С экспрессией других десатураз и элонгаз могут быть также синтезированы АРК, ДТК, ДПКn-6, ЭПК, ДПК и ДГК.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-9-элонгаза/дельта-8-десатуразный путьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ПНЖК биосинтетического пути, который, как минимум, включает по меньшей мере одну дельта-9-элонгазу и по меньшей мере одну дельта-8-десатуразу, обеспечивая таким образом биосинтез ДГЛК и/или ЭТК из ЛК и АЛК, соответственно, с ЭДК и/или ЭТрК как промежуточными жирными кислотами. С экспрессией других десатураз и элонгаз могут быть также синтезированы АРК, ДТК, ДПКn-6, ЭПК, ДПК и ДГК. Этот путь может иметь преимущества в некоторых вариантах, поскольку биосинтез ГЛК и/или СТК исключен.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 промежуточная жирная кислотамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается любой жирной кислоты, которая получена на жирнокислотном метаболическом пути, которая может превращаться далее в необходимый жирнокислотный продукт этим путем под действием ферментов другого метаболического пути. Например, когда ЭПК производится с использованием дельта-9-элонгаза/дельта-8-десатуразного пути, могут образоваться ЭДК, ЭТрК, ДГЛК, ЭТК и АРК, и их считают мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 промежуточными жирными кислотамимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , поскольку эти жирные кислоты могут быть конвертированы далее в ЭПК под действием ферментов другого метаболического пути.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 побочная жирная кислотамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается любой жирной кислоты, которая получена на жирнокислотном метаболическом пути, которая не является ни продуктом назначения данного пути, ни мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 промежуточной жирной кислотоймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 данного пути. Например, когда ЭПК получается с использованием дельта-9-элонгаза/дельта-8 десатуразного пути, под действием дельта-5-десатуразы на ЭДК или ЭТрК, соответственно, могут также образоваться скиадоновая кислота (СКК) иа юнипероновая кислота (ЮП). Они считаются мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 побочными жирными кислотамимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , поскольку не могут быть превращены далее в ЭПК под действием ферментов другого метаболического пути.

Термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 триацилглицеринмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 масломультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ТАГмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касаются нейтральных липидов, которые состоят из трех жирных ацильных остатков, этерифицированных до молекулы глицерина (и такие термины будут употребляться взаимозаменяемо в данной заяке). Такие масла могут содержать длинноцепочечные ПНЖК, так же как и более короткие насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты и насыщенные жирные кислоты с более длинными цепями. Таким образом, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 масляный биосинтезмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается, в общем, синтеза ТАГ в клетке.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Процент (%) ПНЖК в совокупных липидных и масляных фракцияхмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается процента ПНЖК относительно общего количества жирных кислот в этих фракциях. Термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 совокупная липидная фракциямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 липидная фракциямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 оба касаются суммарного количества всех липидов (т.е. нейтральных и полярных) внутри маслянистого организма, включая, таким образом, те липиды, что локализованы в фосфатидилхолиновой (ФХ) фракции, фосфатидилэтаноламиновой (ФЕ) фракции и триацилглицериновой (ТАГ или масляной) фракции. Однако, термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 липидмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 масломультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 будут использоваться в настоящей спецификации взаимозаменяемо.

Термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 эффективность конверсиимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 процент конверсии субстратамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касаются эффективности, с которой конкретный фермент (например, десатураза) может превратить субстрат в продукт. Эффективность конверсии измеряется в соответствии со следующей формулой: ([продукт]/[субстрат+продукт])*100, где 'продуктмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 включает промежуточный продукт и все продукты, полученные на этом пути.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Десатуразамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 представляет собой полипептид, который может десатурировать, т.е. вводить двойную связь, в одну или несколько жирных кислот с образованием жирной кислоты или предшественника, которые представляют интерес. Несмотря на использование в данной спецификации системы омега-ссылок для ссылок на специфические жирные кислоты, удобнее определять активность десатуразы путем счета от карбоксильного конца субстрата с использованием дельта-системы. Особенный интерес представляют здесь дельта-8-десатуразы, которые десатурируют жирную кислоту между восьмым и девятым углеродным атомом, понумерованным от карбоксил-терминального конца молекулы, и которые могут, например, катализировать конверсию ЭДК в ДГЛК и/или ЭТрК в ЭТК. Другие полезные десатуразы жирных кислот включают, например, (1) дельта-5-десатуразы, которые катализируют конверсию ДГЛК в АРК и/или ЭТК в ЭПК; (2) дельта-6-десатуразы, которые катализируют конверсию ЛК в ГЛК и/или АЛК в СТК; (3) дельта-4-десатуразы, которые катализируют конверсию ДПК в ДГК и/или ДТК в ДПКn-6; (4) дельта-12-десатуразы, которые катализируют конверсию олеиновой кислоты в ЛК; (5) дельта-15-десатуразы, которые катализируют конверсию ЛК в АЛК и/или ГЛК в СТК; (6) дельта-17-десатуразы, которые катализируют конверсию АК в ЭПК и/или ДГЛК в ЭТК; и (7) дельта-9-десатуразы, которые катализируют конверсию пальмитата в пальмитолеиновую кислоту (16:1) и/или стеарата в олеиновую кислоту (18:1). В данной области на дельта-15 и дельта-17-десатуразы также иногда ссылаются как на мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 омега-3-десатуразымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 w-3-десатуразымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , и/или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 n-3-десатуразымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , исходя из их способности конвертировать омега-6 жирные кислоты в свои омега-3 аналоги (например, превращение ЛК в АЛК и АРК в ЭПК, соответственно). В некоторых вариантах наиболее предпочтительно эмпирически определять специфичность конкретной десатуразы жирных кислот путем превращения пригодного хозяина геном в десатуразе жирных кислот и определения ее влияния на жирнокислотный профиль данного хозяина.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-4-десатуразамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается фермента, который будет десатурировать жирную кислоту между четвертым и пятым углеродным атомами, считая от карбоксил-терминального конца данной молекулы, и это может, например, катализировать конверсию ДПК в ДГК и/или ДТК в ДПКn-6. Для целей данной заявки термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ДГК синтазного фермента (SEQ ID NO:12), выделенного из Euglena gracilis, кодируемого здесь SEQ ID NO:11. Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn2мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ДГК синтазного фермента (SEQ ID NO:22), выделенного из Euglena gracilis, кодируемого здесь SEQ ID NO:21. Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaDHAsyn1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ДГК синтазного фермента (SEQ ID NO:95), выделенного из Euglena anabaena, кодируемого здесь SEQ ID NO:91. Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaDHAsyn2мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ДГК синтазного фермента (SEQ ID NO:96), выделенного из Euglena anabaena, кодируемого здесь SEQ ID NO:92. Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaDHAsyn3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ДГК синтазного фермента (SEQ ID NO:97), выделенного из Euglena anabaena, кодируемого здесь SEQ ID NO:93. Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EaDHAsyn4мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается фермента (SEQ ID NO:98), выделенного из Euglena anabaena, кодируемого здесь SEQ ID NO:94.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 элонгазная системамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается набора из четырех ферментов, которые ответственны за элонгацию жирнокислотной углеродной цепи с образованием жирной кислоты, которая на два углеродных атома длиннее, чем жирнокислотный субстрат, на который действует данная элонгазная система. Более конкретно, процесс элонгации происходит в ассоциации с жирнокислотной синтазой, соответственно с чем СоА служит ацильным носителем (Lassner et al., Plant Cell 8:281-292 (1996)). На первой стадии, которая, как было установлено, является субстрат-специфической и лимитированной скоростью, малонил-СоА конденсируется с длинноцепочечным ацил-СоА с образованием диоксида углерода (СО2) и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -кетоацил-СоА (где ацильная составляющая удлинена на два углеродных атома). Следующие реакции включают восстановление до мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -гидроксиацил-СоА, дегидратацию до эноил-СоА и второе восстановление с образованием удлиненного ацил-СоА. Примерами реакций, которые катализируются элонгазными системами, являются конверсия ГЛК в ДГЛК, СТК в ЭТК, ЛК в ЭДК, АЛК в ЭТрК и ЭПК в ДПК.

Для целей данной заявки, на фермент, который катализирует первую реакцию конденсации (т.е. конверсию малонил-СоА и длинноцепочечную ацил-CvoA в мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -кетоацил-СоА), будем ссылаться, в общем, как на мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 элонгазумультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 . В общем, селективность элонгаз в отношении субстрата несколько широкая, но ограничивается как длиной цепи так и степенью ненасыщенности. Соответственно, элонгазы могут иметь разные специфичности. Например, С14/16-элонгаза будет утилизировать С 14 субстрат (например, миристиновую кислоту), С16/18 -элонгаза будет утилизировать С16 субстрат (например, пальмитат), С18/20-элонгаза будет утилизировать С 18 субстрат (например, ГЛК, СТК) и С20/22-элонгаза будет утилизировать С20 субстрат (например, АРК, ЭПК). Подобным образом, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-9-элонгазамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 способна катализировать конверсию ЛК в ЭДК и/или АЛК в ЭТрК.

Важно отметить, что некоторые элонгазы имеют широкую специфичность, и, следовательно, отдельный ензим может быть способным катализировать несколько элонгазных реакций. Так, например, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-9-элонгазамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 может также действовать как С16/18-элонгаза, С18/20 элонгаза и/или С20/22 элонгаза, и может иметь измененные, однако не наилучшие, специфичности относительно дельта-5 и дельта-6 жирных кислот, таких как ЭПК и/или ГЛК, соответственно.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 C20-элонгазамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , как здесь используется, касается фермента, который утилизирует C20 субстрат, такой как ЭПК или АРК, например. Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 C20/дельта-5-элонгазамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается фермента, который утилизирует C20 субстрат с дельта-5 двойной связью.

Подобно этому, термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9eloмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9eмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается дельта-9-элонгазы, выделенной из Euglena gracilis (см. SEQ ID NO:112; также см. патентную заявку США № 11/601563 (от 16 ноября 2006 г, которая опубликована как US-2007-0118929-A1 24 мая 2007 г.)).

Как здесь используется, термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 нуклеиновая кислотамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 означамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 т полинуклеотид и включает одно- или двухцепный полимер деоксирибонуклеотидного или рибонуклеотидного оснований. Нуклеиновые кислоты могут также включать фрагменты и модифицированные нуклеотиды. Таким образом, термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 полинуклеотидмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 нуклеиновокислотная последовательностьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 нуклеотидная последовностьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 нуклеиновокислотный фрагментмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 используются здесь взаимозаменяемо и представляют собой полимер РНК или ДНК, который является одно- или двухцепным, который содержит, при необходимости, синтетические, неприродные или измененные нуклеотидные основания. На нуклеотиды (которые обычно находятся в своей 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -монофосфатной форме) ссылаются однобуквенным обозначением следующим образом: мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Aмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается аденилата или деоксиаденилата (для РНК или ДНК, соответственно), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Cмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается цитидилата или деоксицитидилата, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Gмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается гуанилата или деоксигуанилата, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Uмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается уридата, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Tмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается деокситимидилата, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Rмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается пуринов (А або G), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Yмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается пиримидинов (С або Т), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Kмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается G или Т, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Hмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается А или С, или Т, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Iмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается инозина, и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Nмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается любого нуклеотида.

Термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 субфрагмент, который является функционально эквивалентныммультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 функционально эквивалентный субфрагментмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 используются здесь взаимозаменяемо. Эти термины касаются участка или субпоследовательности фрагмента изолированной нуклеиновой кислоты, в которой способность изменять экспрессию гена или создавать некий фенотип сохраняется, кодирует или не кодирует данный фрагмент или субфрагмент активный фермент. Например, данный фрагмент или субфрагмент может быть использован в конструировании химерных генов для создание желательного фенотипа в трансформированном растении. Химерные гены могут быть созданы для использования в супрессии путем связывания фрагмента нуклеиновой кислоты или ее субфрагмента, кодирует или не кодирует он активный фермент, в смысловой или антисмысловой ориентации относительно промоторной последовательности растения.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 сохраненный доменмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мотивмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 означает набор аминокислот, которые консервируются в специфических положениях вдоль выстроенной последовательности эволюционно родственных протеинов. Хотя аминокислоты в других положеннях могут варьировать между гомологичными протеинами, аминокислоты, которые сильно законсервированы в специфических положениях, отвечают аминокислотам, которые являются незаменимыми по структуре, стабильности или активности протеина. Термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 гомологиямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 гомологическиймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 подобный в значительной меремультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 такой, который отвечает в значительной меремультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 применяются здесь взаимозаменяемо. Они касаются фрагментов нуклеиновой кислоты, где изменения в одном или нескольких нуклеотидных основаниях не влияют на способность данного фрагмента нуклеиновой кислоты служить посредником в генной экспрессии или создавать определенный фенотип. Эти термины также касаются модификаций фрагментов нуклеиновой кислоты данного изобретения, таких как делеция или инсерция одного или нескольких нуклеотидов, которые значительно не изменяют функциональные свойства результирующего фрагмента нуклеиновой кислоты относительно первичного, немодифицированного фрагмента. Таким образом, специалистам в данной области понятно, что данное изобретение охватывает больше, чем специфические иллюстративные последовальности.

Кроме того, специалисту в данной области понятно, что в значительной мере схожие нуклеиновокислотные последовательности, которые охватываются данным изобретением, также определяются по их способности гибридизоваться (при умеренно жестких условиях, например, 0,5X SSC, 0,1% SDC, 60°C) с последовательностями, которые здесь приведены как пример, или с каким-либо участком раскрытых здесь нуклеотидных последовальностей, и которые функционально эквивалентны раскрытым здесь любым нуклеиновокислотным последовательностям. Условия жесткости могут быть отрегулированы для проведения скрининга умеренно сходных фрагментов, таких как гомологические последовательности от удаленно родственных организмов, сильно сходных фрагментов, таких как гены, которые дублируют функциональные ферменты из близко родственных организмов. Пост-гибридизационныемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 промывки определяют условия жесткости.

Термин "селективно гибридизует" включает ссылку на гибридизацию, при жестких условиях гибридизации, нуклеиновокислотной последовательности с определенной нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в заметно большей мере (например, по меньшей мере с двукратным превышением относительно фона), чем ее гибридизация с нуклеиновокислотными последовальностями, которые не являются мишенями, и существенное исключение нуклеиновых кислот, которые не являются мишенями. Селективно гибридизованные последовательности, типично, имеют приблизительно по меньшей мере 80% идентичность последовальности, или 90% идентичность последовательности, включая до 100% идентичность последовательности (т.е. полную комплементарность) между собой.

Термин "жесткие условия" или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 жесткие условия гибридизациимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 включает ссылки на условия, при которых зонд будет селективно гибридизован со своей последовательностью-мишенью. Условия жесткости зависят от последовательности и будут отличными при разных обстоятельствах. Путем контроля жесткости условий гибридизации и/или условий промывки могут быть идентифицированы последовательности-мишени, которые на 100% комплементарны с зондом (гомологичное зондирование). Как альтернатива, условия жесткости могут быть отрегулированы таким образом, что имеет место некоторое несоответствие в последовательностях, так что проявляются меньшие степени подобия (гетерологическое зондирование). В общем, зонд имеет длину меньше приблизительно 1000 нуклеотидов, при необходимости, менее 500 нуклеотидов.

Типично, жесткими условиями будут такие, где концентрация соли составляет менше приблизительно 1,5 M Na ионов, типично, приблизительно от 0,01 до 1,0 M Na ионов (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3, и температура равняется по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°C для длинных зондов (например, больше 50 нуклеотидов). Жесткие условия могут также достигаться путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Иллюстративные условия низкой жесткости включают гибридизацию с буферным раствором от 30 до 35% формамида, 1 M NaCl, 1% НДС (натрий додецилсульфат) при 37°C, и промывку в 1X-2X SSC (20X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M тринатрийцитрата) при 50-55°C. Иллюстративные условия умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамида, 1 M NaCl, 1% НДС при 37°C, и промывку в 0,5X-1X SSC при 55-60°C. Иллюстративные условия высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамида, 1 M NaCl, 1% НДС при 37°C, и промывку в 0,1X SSC при 60-65°C.

Специфичность является, обычно, функцией пост-гибридизационных промывок, критическими факторами являются ионная сила и температура концевого промывочного раствора. Для ДНК-ДНК гибридов Tm можно аппроксимировать из уравнения Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138:267-284 (1984): Tm=81,5°C+16,6 (log M)+0,41 (%GC)-0,61 (% форма)-500/L; где M отвечает молярности моновалентных катионов, %GC является процентом гуанозинового и цитозинового нуклеотидов в данной ДНК, % форма представляет собой процент формамида в гибридизующем растворе, и L отвечает длине гибрида в базисных парах. Tm является температурой (при определенных ионной силе и pH), при которой 50% комплементарной последовальности-мишени гибридизуется с полностью согласованным зондом. Tm снижается на приблизительно 1°C на кажлдый 1% несоответствия; таким образом, Tm, условия гибридизации и/или промывки могут быть отрегулированы таким образом, чтобы гибридизация осуществлялась до необходимой идентичности последовательностей. Например, если проводится поиск последовательностей с >90% идентичности, Tm может быть снижена на 10°C. В целом, условия жесткости выбираются таким образом, чтобы быть на приблизительно 5°C ниже, чем точка теплового плавления (Tm) для специфической последовательности и ее комплемента при определенных ионной силе и pH. Однако, при сильно жестких условиях могут использоваться гибридизация и/или промывка при температурах на 1, 2, 3, или 4°C ниже, чем тепловая точка плавления (Tm); при умеренно жестких условиях могут использоваться гибридизация и/или промывка при температурах на 6, 7, 8, 9, или 10°C ниже, чем тепловая точка плавления (Tm); при условиях низкой жесткости могут использоваться гибридизация и/или промывка при температурах на 11, 12, 13, 14, 15, или 20°C ниже, чем тепловая точка плавления (Tm). С использованием указаного уравнения, гибридизационных и промывочных композиций и желательной Tm рядовым специалистам в данной области будет понятно, каким способом достичь вариаций жесткости условий гибридизации и/или нужных условий промывки. Если необходимая мера несоответствия приводит к Tm меньше 45°C (водный раствор) или 32°C (формамидный раствор), предпочтение отдается тому, чтобы повысить концентрацию SSC, так что может быть использована более высокая температура. Подробным пособием по гибридизации нуклеиновых кислот служит работа Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); и работа Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). Указанные условия гибридизации и/или промывки могут использоваться в течение по меньшей мере 10, 30, 60, 90, 120, или 240 минут.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Идентичность последовательностимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 идентичностьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 в контексте нуклеиновокислотных или полипептидных последовательностей касается нуклеиновокислотных оснований или аминокислотных остатков в двух последовательностях, которые одинаковы при их группировке на максимальное соответствие по определенной области сравнения.

Таким образом, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 процент идентичности последовательностимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается величины, которая определяется путем сравнения двух оптимально сгруппированных последовательностей по области сравнения, где участок полинуклеотидной или полипептидной последовательности в области сравнения может включать добавки или делеции (т.е., гэпы), в сравнении с эталонной последовательностью (которая не содержит дополнений или делеций), для оптимального группирования данных двух последовательностей. Процент вычисляется путем определения количества положений, в которых идентичное нуклеиновокислотное основание или аминокислотный остаток встречаются в обеих последовательностях, с получением количества положений, которые совпадают, деления количества положений, что совпадают, на общее число положений в области сравнения и умножением результатов на 100 с получением процента идентичности последовательности. Полезные примеры процента идентичности последовательности включают, однако не ограничиваясь этим, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% або 95%, или любой целый процент от 50% до 100%. Эти идентичности могут быть определены с использованием любых программ, которые здесь описаны.

Группирование последовательностей и процент идентичности или подобные расчеты могут быть проведены с использованием разнообразных методов сравнения, разработанных для выявления гомологических последовательностей, включая, однако не ограничиваясь этим, MegAlignмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 программу вычислительного биоинформативного пакета LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). В контексте данной заявки станет понятным, что когда для анализа используются программы секвенирования, результаты этого анализа будут базироваться на мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 значеннях по умолчаниюмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 использованной программы, если не указано иное. Как употребляется в данном тексте, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 значения по умолчаниюмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 представляют собой любой набор значений или параметров, которые загружаются с программой при первой инициализации.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Метод группировки Clustal Vмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает методу группировки, маркированному Clustal V (который описан Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8:189-191), который можно найти в программе MegAlignмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 вычислительного биоинформативного пакета LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Для множественных группировок значения по умолчанию отвечают GAP PENALTY=10 и GAP LENGTH PENALTY=10. Параметрами по умолчанию для парных группировок и вычисления процента идентичности протеиновых последовательностей с использованием метода Clustal V являются KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 и DIAGONALS SAVED=5. Для нуклеиновых кислот этими параметрами служат KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 и DIAGONALS SAVED=4. После группирования последовательностей с использованием программы Clustal V можно получить мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 процент идентичностимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 путем визуализации таблицы мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отклонений последовательностеймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 в той самой программе.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Метод группировки Clustal Wмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает методу группировки, маркированному Clustal W (который описан Higgins and Sharp, supra; Higgins, D.G. et al., supra), который можно найти в программе MegAlignмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 v6.1 вычислительного биоинформативного пакета LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Для множественных группировок парметры по умолчанию отвечают GAP PENALTY=10 и GAP LENGTH PENALTY=0,2. Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=0,5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB. После группирования последовательностей с использованием программы Clustal W можно получить мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 процент идентичностимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 путем визуализации таблицы мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отклонений последовательностеймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 в той самой программе.

Сравнительный анализ первичной структуры согласно программе BLASTNмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 представляет алгоритм, введенный Национальным центром биотехнологической информации (НЦБИ) для сравнения нуклеотидных последовательностей с использованием параметров по умолчанию.

Специалистам в данной области хорошо понятно, что полезными в идентификации полипептидов относительно других видов является множество уровней идентичности последовательности, где такие полипептиды имеют такую же или похожую функцию или активность. Полезные примеры процента идентичности включают, однако не ограничиваясь этим, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%, или любой целый процент от 50% до 100%. Действительно, любая целочисленная аминокислотная идентичность от 50 до 100% может быть полезной в описании данного изобретения, такая как 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Кроме того, представляет интерес любой полномасштабный или частичный комплемент этого изолированного нуклеотидного фрагмента.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Генмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается фрагмента нуклеиновой кислоты, который экспрессирует специфический протеин, и может включать или один кодирующий участок или кодирующий участок, добавленный к регуляторным последовательностям, которые предшествуют (5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 некодирующие последовательности) и следуют за (3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 некодирующие последовательности) кодирующей последовательностью. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Нативный генмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается гена, который существует в природе со своими собственными регуляторными последовательностями. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Химерный генмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается любого гена, который не является нативным геном, который содержит регуляторную и кодирующую последовательности, которые вместе в природе не существуют. Соответственно, химерный ген может включать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые получаются из разных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из одного источника, но расположены таким образом, что отличаются от существующего в природе. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Эндогенный генмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается нативного гена в своем природном расположении в геноме организма. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Посторонниймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ген касается гена, который обычно не существует в организме хозяина, но который вводится в организм хозяина путем переноса гена. Посторонние гены могут включать нативные гены, введенные в не-нативный организм, или химерные гены. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Трансгенмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 представляет собой ген, который введен в геном путем процедуры трансформации.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 геноммультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , как он применяется к растительным клеткам, охватывает не только хромосомную ДНК, найденную внутри ядра, но и органоидную ДНК, найденную внутри субклеточных компонентов (например, митохондриальных, пластидных) клеток.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Кодон-оптимизированный генмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 представляет собой ген, который имеет свою частоту использования кодона, созданный для имитации частоты предпочтительного использования кодона клетки хозяина.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Аллельмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 представляет собой одну из нескольких альтернативных форм гена, занимающую данниый локус на хромосоме. Когда все аллели, присутствующие в данном локусе на хромосоме, одинаковы, это растение является гомозиготным в данном локусе. Если аллели, присутствующие в данном локусе на хромосоме, отличны, это растение является гетерозиготным в данном локусе.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Кодирующая последовательностьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ДНК последовальности, которая кодирует специфическую аминокислотную последовательность. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Регуляторные последовательностимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касаются нуклеотидных последовательностей, расположенных вверху (5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 некодирующие последовательности), внутри или внизу (3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 некодирующие последовательности) от кодирующей последовательности, и которые влияют на транскрипцию, РНК процессинг или стабильность, или трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать, однако не ограничиваясь этим, промоторы, трансляционные сигнальные последовательности, интроны, полиаденилирующие распознающие последовательности, РНК процессинговые сайты, эффекторные связывающие сайты и структуры типа мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 стебель-петлямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 .

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Промотормультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ДНК последовальности, способной контролировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. Промоторная последовательность состоит из ближайших и более удаленных мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 верхнихмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 элементов, на последние элементы часто ссылаются как на энхансеры. Соответственно, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 энхансермультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 представляет собой ДНК последовательность, которая может стимулировать промоторную активность, и может быть природным элементом промотора или гетерологическим элементом, который введен для усиления уровня или тканевой специфичности промотора. Промоторы могут быть получены в своей полноте из нативного гена, или могут состоять из разных элементов, полученных от разных промоторов, что существуют в природе, или даже включать сегменты синтетической ДНК. Специалистам в данной области понятно, что разные промоторы могут направлять экспрессию гена в разных тканях или типах клеток, или на разных стадиях развития, или действовать как реакция на разные условия окружающей среды. Кроме того, признано, что поскольку в большинстве случаев точные пределы регуляторных последовательностей определены не полностью, ДНК фрагменты некоторых вариаций могут иметь идентичную промоторную активность. На промоторы, которые вызывают экспрессию гена в большинстве типов клеток в большинства случаев, обычно ссылаются как на мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конститутивные промоторымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 . Новые промоторы разных типов, полезные в растительных клетках, постоянно открывают; множество примеров можно найти в компиляции Okamuro, J.K., та Goldberg, R.B. Biochemistry of Plants 15:1-82 (1989).

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Трансляционная лидерная последовательностьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается полинуклеотидной последовательности, которая локализована между промоторной последовательностью гена и кодирующей последовательностью. Трансляционная лидерная последовательность присутствует в подверженной полному процессингу мРНК вверх от трансляционной инициирующей (старт) последовательности. Трансляционная лидерная последовательность может влиять на процессинг первичного транскрипта до мРНК, мРНК стабильность или трансляционную эффективность. Примеры трансляционных лидерных последовательностей описаны в литературе (Turner, R. и Foster, G.D., Mol. Biotechnol. 3:225-236 (1995)).

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 некодирующие последовательностимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 транскрипционный терминатормультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 терминирующие последовательностимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касаются ДНК последовательностей, расположенных вниз от кодирующей последовательности, и включают полиаденилирующие распознающие последовательности и другие последовательности, которые кодируют регуляторные сигналы, способные влиять на мРНК процессинг или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования обычно характеризуется влиянием на добавление трактов полиадениловой кислоты к 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 концу мРНК предшественника. Использование разных 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 некодирующих последовательностей иллюстрируется Ingelbrecht, I.L., et al. Plant Cell 1:671-680 (1989).

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 РНК транскриптмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается продукта, который является результатом катализированной РНК полимеразой транскрипции ДНК последовательности. Когда РНК транскрипт является совершенной комплементарной копией ДНК последовательности, на него ссылаются как на основной транскрипт. На РНК транскрипт ссылаются как на зрелую РНК, когда РНК последовательность получена в результате пост-транскрипционного процессинга основного транскрипта. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Матричная РНКмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мРНКмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается РНК, которая не имеет интронов и которая может быть транслирована в протеин данной клеткой. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 кДНКмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ДНК, которая комплементарна к и синтезирована из мРНК матрицы с использованием ферментной ревертазы. кДНК может быть одноцепочечной или может быть конвертирована в двухцепочечную форму с использованием Кlenow фрагмента ДНК полимеразы мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 . мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Смысловаямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 РНК касается РНК транскрипта, который включает мРНК и может быть транслирована в протеин внутри клетки или in vitro.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Антисмысловая РНКмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается РНК транскрипта, который комплементарен ко всему или части таргетного первичного транскрипта или мРНК, и который блокирует экспрессию таргетного гена (U.S. Patent No. 5107065). Комплементарность антисмысловой РНК может быть с любой частью специфического генного транскрипта, т.е. 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 некодирующей последовательностью, 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 некодирующей последовательностью, интронами или кодирующей последовательностью. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Функциональная РНКмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается антисмысловой РНК, рибозимной РНК или другой РНК, которая не может транслироваться, но все же имеет влияние на клеточные процессы. Термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 комплементмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 обратный комплементмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 используются здесь взаимозаменяемо относительно мРНК транскриптов, и определяют, как представляется, антисмысловую РНК данного месседжа.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 сцепленный действующим образоммультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается ассоциации нуклеиновокислотных последовательностей на отдельном нуклеиновокислотном фрагменте, так что функция одной регулируется другой. Например, промотор сцеплен действующим образом с кодирующей последовательностью, когда он способен регулировать экспрессию этой кодирующей последовательности (т.е. данная кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть сцеплены действующим образом с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации. В другом примере участки комплементарной РНК данного изобретения могут быть сцеплены действующим образом прямо или опосредствованно, 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 с таргетной мРНК, или 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 с таргетной мРНК, или внутри таргетной мРНК, или первый комплементарный участок 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и его комплемент 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 с таргетной мРНК.

Стандартная рекомбинантная ДНК и методы молекулярного клонирования, которые здесь использованы, хорошо изестны в данной области и более полно описаны в работе Sambrook, J., Fritsch, E.F. и Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989). Способы превращения хорошо известны специалистам в данной области и описаны ниже.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ПЦРмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 полимеразная цепная реакциямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 представляет собой метод синтеза больших количеств специфических ДНК сегментов и состоит из ряда повторных циклов (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Типично, двухцепочечная ДНК подвергается тепловой денатурации, два праймера, комплементарные к 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 границам данного таргетного сегмента, закаляются при низкой температуре и потом растягиваются при промежуточной температуре. Одна группа из таких трех последовательных шагов называется мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 цикломмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 .

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 рекомбинантмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается искусственной комбинации двух отделенных разным способом сегментов последовательности, например, путем химического синтеза или манипуляции изолированными сегментами нуклеиновых кислот методами генной инженерии.

Термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 плазмидамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 вектормультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касаются экстрахромосомного элемента, который часто несет гены, которые не являются частью центрального метаболизма данной клетки, и, обычно, в форме круговых двухцепочечных ДНК фрагментов. Такие элементы могут быть автономными репликационными последовательностями, геномными интегрирующими последовательностями, фаговыми или нуклеотидными последовательностями, линейными или круговыми, одно- или двухцепочечных ДНК или РНК, полученных из любого источника, где ряд нуклеотидных последовательностей был объединен или рекомбинирован в уникальную конструкцию, которая способна вводить экспрессирующую кассету(ты) в клетку. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Экспрессирующая кассетамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается фрагмента ДНК, который содержит посторонний ген и имеет элементы в дополнение к постороннему гену, которые позволяют осуществлять усиленную экспрессию этого гена в постороннего хозяина. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Трансформирующая кассетамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается фрагмента ДНК, который содержит посторонний ген и имеет элементы в дополнение к постороннему гену, которые облегчают трансформацию конкретной клетки-хозяина.

Термины мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 рекомбинантная конструкция мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 экспрессионный конструкциямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 химерный конструкциямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конструкциямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 рекомбинантная ДНК конструкциямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 используются здесь взаимозаменяемо. Рекомбинантная конструкция включает искусственную комбинацию фрагментов нуклеиновой кислоты, например, регуляторную и кодирующую последовательности, которые вместе в природе не встречаются. Например, химерный конструкция может включать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые получены из разных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, полученные из одного источника, но расположеные способом, отличающимся от существующего в природе. Такая конструкция может использоваться сам по себе или в сочетании с вектором. Если используется вектор, выбор вектора зависит от способа, который будет использован для трансформации клеток-хозяев, как это хорошо известно специалистам в данной области. Например, может быть использован плазмидный вектор. Опытный специалист хорошо осведомлен относительно генетических элементов, которые должны присутствовать на векторе для успешной трансформации, селекции и размножения клеток хозяина, которые включают какой-либо из изолированных фрагментов нуклеиновой кислоты данного изобретения. Опытный специалист также признает, что разные независимые трансформационные события дадут разные уровни и виды экспрессии (Jones et al., EMBO J. 4:2411-2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78-86 (1989)), и потому эти множественные события должны быть подвергнуты скринингу для получения линий, которые проявляют желательный уровень экспрессии и вид. Такой скрининг может проводиться, среди прочего, методом саузерн анализа ДНК, норзерн анализа мРНК экспрессии, иммуноблоттингового анализа экспрессии протеина или фенотипного анализа.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 экспрессиямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , как здесь применяется, касается выработки функционального конечного продукта (например, мРНК или протеина [как предшественника, так и зрелого]).

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 введенныймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 означает введение нуклеиновой кислоты (например, экспрессионная конструкция) или протеина в клетку. «Введенный» включает ссылку на встраивание нуклеиновой кислоты в эукариотную или прокариотную клетку, где данная нуклеиновая кислота может быть встроена в геном клетки, и включает ссылку на временное введение нуклеиновой кислоты или протеина в данную клетку. «Введенный» включает ссылку на стабильные или переходные методы трансформации, так же как и на половое скрещивание. Таким образом, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 введенныймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 в контексте введения фрагмента нуклеиновой кислоты (например, рекомбинантный ДНК конструкция/экспрессионная конструкция) в клетку означает мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 трансфекциюмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 трансформациюмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 трансдукциюмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , и включает ссылку на встраивание фрагмента нуклеиновой кислоты в эукариотную или прокариотную клетку, где данный фрагмент нуклеиновой кислоты может быть встроен в геном данной клетки (например, хромосомную, плазмидную, пластидную или митохондриальную ДНК), конвертирован в автономный репликон, или временно экспрессирован (например, трансфектированная мРНК).

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Зрелыймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 протеин касается полипептида, который подвергался пост-трансляционному процессингу (т.е. такого, из которого были удалены любые пре- или пропептиды, присутствующие в первичном трансляционном продукте). мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Предшествующиймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 протеин касается первичного продукта трансляции мРНК (т.е. с еще присутствующими пре- и пропептидами). Пре- и пропептиды могут быть, однако не ограничиваясь этим, сигналами внутриклеточной локализации.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Стабильная трансформациямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается переноса фрагмента нуклеиновой кислоты в геном организма хозяина, включая ядерный и органелпярный геномы, что дает генетически устойчивую наследственность. В отличие от этого, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 временная трансформациямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается переноса фрагмента нуклеиновой кислоты в ядро или органеллу, которая содержит ДНК, или организм хозяина, что дает экспрессию гена без интеграции или устойчивой наследственности. На организмы хозяина, которые содержат трансформированные фрагменты нуклеиновой кислоты, ссылаются как на мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 трансгенныемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 организмы.

Как здесь используется, "трансгенный" касается растения или клетки, которая содержит в своем геноме гетерологический полинуклеотид. Лучше, когда гетерологический полинуклеотид стабильно интегрирован в данном геноме, так что данный полинуклеотид передается последующим генерациям. Данный гетерологический полинуклеотид может быть интегрирован в геном отдельно или как часть экспрессирующей конструкции. «Трансгенный», как используется в данном тексте, включает любую клетку, клеточную линию, калюс, ткань, часть растения или растение, генотип которых изменен присутствием гетерологической нуклеиновой кислоты, включая как те трансгеники, которые изменены указанным способом, так и те, что были созданы путем половых скрещиваний или вегетативного размноження из первичного трансгеника. Термин "трансгенныймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , как здесь используется, не охватывает смену генома (хромосомную или экстра-хромосомную) с помощью обычных методов селекции растений или путем природных событий, таких как случайное перекрестное оплодотворение, нерекомбинантная вирусная инфекция, нерекомбинантная бактериальная трансформация, нерекомбинантная транспозиция или спонтанная мутация.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Антисмысловое ингибированиемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается создания антисмысловых РНК транскриптов, способных подвергать супрессии экспрессию таргетного протеина. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Косупрессиямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается продуцирования смысловых РНК трапнскриптов, способных подавлять экспрессию идентичных или в значительной мере схожих посторонних или эндогенных генов (патент США № 5231020). Косупрессионные конструкцияы в растениях были предварительно разработаны путем сосредоточения внимания на гиперэкспрессии нуклеиновокислотной последовательности, которая имеет гомологию с эндогенной мРНК, в смысловой ориентации, результатом чего явилась редукция всех РНК, которые гомологичны с гиперэкспрессированной последовательностью (Vaucheret et al., Plant J. 16:651-659 (1998); Gura, Nature 404:804-808 (2000)). Полная эффективность этого феномена низкая, и степень РНК редукции варьирует в широких пределах. В недавней работе описано использование мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 шпильковыхмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 структур, которые включают всю или часть мРНК кодирующей последовательности в комплементарной ориентации, что дает потенциальную структуру мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 стебель-петлямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 для экспрессированной РНК (РСТ публикация № WO 99/53050; РСТ публикация № WO 02/00904). Это повышает частоту косупрессии в восстановленных трансгенных растениях. Другая вариация описывает использование растительных вирусных последовательностей для направления супрессии или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 заглушиваниямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ближайших мРНК кодирующих последовательностей (РСТ публикация № WO 98/36083). Оба эти косупрессивные явления не были выяснены механистически, хотя генетические факты начали раскрывать эту сложную ситуацию (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757 (1998)).

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 маслянистыймультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается тех организмов, которые имеют тенденцию сохранять свой источник энергии в форме липида (Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2nd Ed., Plenum, 1980). На класс растений, которые идентифицируются как маслянистые, обычно ссылаются как на мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 маслянистыемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 растения. Примеры маслянистих растений включают, однако не ограничиваясь этим, сою (виды Glycine и Soja), лен (вид Linum), рапс (вид Brassica), маис, хлопок, сафлор (вид Carthamus) и подсолнечник (вид Helianthus).

В общем, содержание клеточного масла или ТАГ в этих микроорганизмах следует сигмоидной кривой, где концентрация липида возрастает до тех пор, пока не достигает максимума в поздней логарифмической или ранней стационарной фазе роста и потом постепенно снижается на протяжении поздней стационарной фазы и фазы отмирания (Yongmanitchai and Ward, Appl. Environ. Microbiol. 57:419-25 (1991)).

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 жировые дрожжимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается тех микроорганизмов, которые классифицируются как дрожжи, которые вырабатывают масло. Для маслянистых микроорганизмов вполне обычным является накопление более приблизительно 25% сухого клеточного веса в виде масла. Примеры маслянистых дрожжей включают, однако не ограничиваясь этим, следующие роды: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon и Lipomyces.

Применяемый здесь термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 биомассамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается конкретно использованного дрожжевого клеточного материала, образовавшегося в результате ферментации рекомбинантного хозяина-производителя, который вырабатывает ПНЖК в коммерчески значимых количествах, где предпочтительным хозяином-производителем является рекомбинантный штамм жировых дрожжей, Yarrowia lipolytica. Биомасса может быть в виде целых клеток, целоклеточных лизатов, гомогенизированных клеток, частично гидролизованного клеточного материала, и/или частично очищенного клеточного материала (например, выработанного микробами масла).

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 эвгленофиковыемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Euglenophyceaeмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) касается группы одноклеточных бесцветных или фотосинтетических флагеллатов (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 эвгленоидовмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ), которые найдены существующими в пресноводных, морских, почвенных и паразитных средах. Данный класс характеризуется отдельными одноклеточными организмами, где большинство является водоплавающим и имеет два жгутика (один из которых может быть невсплывающим), которые возникают из передней инвагинации, известной как резервуар. Фотосинтетические эвгленоиды содержат от одного до множества травянистозеленых хлоропластов, которые варьируют от крохотных дисков до расширенных пластинок или ленточек. Ассимиляция нутриента бесцветными эвгленоидами зависит от осмотрофии или фаготрофии. Приблизительно 1000 видов было описано и классифицировано на приблизительно 40 родов и 6 рядов. Примеры эвгленофиковых включают, однако не ограничиваясь этим, следующие роды: Eutreptiella и Tetruetreptia.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 растениемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается целых растений, растительных органов, растительных тканей, семян, растительных клеток, семечек и их потомства. Растительные клетки включают, без ограничений, клетки из семечек, суспензионных культур, зародышей, меристематических участков, калюсной ткани, листвы, корней, побегов, гаметофитов, спорофитов, пыльцы и микроспор.

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Потомствомультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 включает любую последующую генерацию растения.

Обзор: Микробный биосинтез жирных кислот и триацилглицеринов

В общем, аккумуляция липидов в маслянистых микроорганизмах запускается как реакция на имеющееся в ростовой среде общее соотношение углерода и азота. Этот процесс, ведущий к de novo синтезу свободного пальмитата (16:0) в маслянистых микроорганизмах, подробно описан в патенте США № 7238482. Пальмитат является предшественником производных более длинноцепочечных насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, которые образуются под действием элонгаз и десатураз (ФИГ.1).

ТАГи (основные единицы хранения для жирных кислот) образуются в результате ряда реакций, которые включают: (1) этерификацию одной молекулы ацил-CoA в глицерин-3-фосфат через ацилтрансферазу с образованием лизофосфатидной кислоты; (2) этерификацию второй молекулы ацил-CoA через ацилтрансферазу с образованием 1,2-диацилглицеринфосфата (идентифицируемого обычно как фосфатидная кислота); (3) удаление фосфата фосфатидкислотной фосфатазой с образованием 1,2-диацилглицерина (ДАГ); и (4) добавление третьей жирной кислоты действием ацилтрансферазы с образованием ТАГ. Широкий спектр жирных кислот может быть введен в ТАГи, включая насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, и короткоцепные и длинноцепочечные жирные кислоты.

Биосинтез омега жирных кислот

Метаболический процесс, где олеиновая кислота конвертируется в длинноцепочечные омега-3/омега-6 жирные кислоты, включает элонгацию углеродной цепи путем добавления углеродных атомов и десатурацию данной молекулы путем добавления двойных связей. Это требует ряда специальных десатурационных и элонгационных ферментов, присутствующих в эндоплазматичной сеточной мембране. Однако, как видно из ФИГ.1 и как описано ниже, для этого часто существуют множественные альтернативные пути производства специфических длинноцепочечных омега-3/омега-6 жирных кислот.

Конкретно, все пути требуют первичной конверсии олеиновой кислоты в ЛК, первую из омега-6 жирных кислот, с помощью дельта-12-десатуразы. Потом, с использованием мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-9-элонгаза/дельта-8-десатуразногомультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 пути и ЛК как субстрата длинноцепочечные омега-6 жирные кислоты получаются следующим образом: (1) ЛК конвертируется в ЭДК под действием дельта-9-элонгазы; (2) ЭДК конвертируется в ДГЛК под действием дельта-8-десатуразы; (3) ДГЛК конвертируется в АРК под действием дельта-5-десатуразы; (4) АРК конвертируется в ДТК под действием С20/22-элонгазы; и (5) ДТК конвертируется в ДПКn-6 под действием дельта-4-десатуразы. Как альтернатива, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-9-элонгаза/дельта-8-десатуразный путьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 может использовать АЛК как субстрат с образованием длинноцепочечных омега-3 жирных кислот следующим образом: (1) ЛК конвертируется в АЛК, первую из омега-3 жирных кислот, под действием дельта-15-десатуразы; (2) АЛК конвертируется в ЭТрК под действием дельта-9-элонгазы; (3) ЭТрК конвертируется в ЭТК под действием дельта-8-десатуразы; (4) ЭТК конвертируется в ЭПК под действием дельта-5-десатуразы; (5) ЭПК конвертируется в ДПК под действием С20/22-элонгазы; и (6) ДПК конвертируется в ДГК под действием дельта-4-десатуразы. При необходимости, омега-6 жирные кислоты могут быть конвертированы в омега-3 жирные кислоты; например, ЭТК и ЭПК образуются из ДГЛК и АРК, соответственно, под действием активности дельта-17-десатуразы.

Альтернативные пути для биосинтеза омега-3/омега-6 жирных кислот используют дельта-6-десатуразу и С18/20 -элонгазу (известную также как дельта-6-элонгаза, эти термины могут использоваться взаимозаменяемо) (т.е. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-6-десатураза/дельта-6-элонгазный путьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ). Более конкретно, ЛК и АЛК могут конвертироваться в ГЛК и СТК, соответственно, с помощью дельта-6-десатуразы; потом С 18/20-элонгаза превращает ГЛК в ДГЛК и/или СТК в ЭТК.

Предполагается, что конкретные функциональные группы, которые необходимо ввести в специфический организм-хозяин для выработки омега-3/омега-6 жирных кислот, будут зависеть от клетки-хозяина (и ее нативного ПНЖК профиля и/или десатураза/элонгазного профиля), наличия субстрата и желательного конечного продукта(ов). Например, экспрессия дельта-9-элонгаза/дельта-8-десатуразного пути может быть предпочтительной в некоторых вариантах, в противоположность экспрессии дельта-6-десатураза/дельта-6-элонгазного пути, поскольку ПНЖК, полученные с помощью первого пути, свободны от ГЛК.

Специалист в данной области сможет идентифицировать разные гены-кандидаты, которые кодируют каждый из ферментов, необходимых для омега-3/омега-6 жирнокислотного биосинтеза. Полезные десатуразные и элонгазные последовательности могут быть получены из любого источника, например, выделены из природного источника (из бактерий, водорослей, грибов, растений, животных и т.д.), получены по полусинтетической схеме или синтезированы de novo. Хотя конкретный источник десатуразных и элонгазных генов, введенных в хозяина, не является критичным, соображения по поводу выбора специфического полипептида, который обладает десатуразной или элонгазной активностью, включают: (1) специфичность субстрата данного полипептида; (2) является ли данный полипептид или его компонент ферментом, который лимитирует скорость; (3) является ли данная десатураза или элонгаза незаменимой для синтеза нужной ПНЖК; (4) кофакторы, необходимые для данного полипептида; и/или (5) является ли данный полипептид модифицированным после его получения (например, с помощью киназы или пренилтрнсферазы). Экспрессированный полипептид имеет, лучше, параметры, совместимые с биохимическим окружением его локации в клетке хозяина (в отношении дополнительных деталей см. патентСША № 7238482).

В дополнительных вариантах будет также полезным рассмотреть эффективность конверсии каждой конкретной десатуразы и/или элонгазы. Более конкретно, поскольку каждый фермент в редких случаях функционирует со 100% эффективностью в отношении конверсии субстрата в продукт, конечный липидный профиль неочищенных масел, образованных в клетке хозяина, будет, типично, представлять собой смесь разных ПНЖК, которая состоит из желательной омега-3/омега-6 жирной кислоты, так же как и разных верхних промежуточных ПНЖК. Таким образом, эффективность конверсии, которую обеспечивает каждый фермент, также представляет собой переменную при оптимизации биосинтеза необходимой жирной кислоты, которую следует принимать во внимание.

С учетом всех вышерассмотренных соображений могут быть идентифицированы гены-кандидаты, которые обладают соответствующими активностями десатуразы и элонгазы (например, дельта-6-десатуразы, C18/20 -элонгазы, дельта-5-десатуразы, дельта-17-десатуразы, дельта-15-десатуразы, дельта-9-десатуразы, дельта-12-десатуразы, C14/16-элонгазы, C16/18-элонгазы, дельта-9-элонгазы, дельта-8-десатуразы, дельта-4-десатуразы, C20/22-элонгазы и ДГК синтазы), в соответствии с имеющейся доступной для общественности литературой (например, GenBank), патентной литературой, и экспериментальным анализом организмов, которые способны производить ПНЖК. Эти гены будут пригодны для введения в организм конкретного хозяина для обеспечения или усиления синтеза ПНЖК этим организмом.

Мультизимы и линкеры

В одном варианте данное изобретение касается мультизима, который содержит отдельный полипептид, обладающий по меньшей мере двумя независимыми и раздельными ферментативными активностями.

Примеры пригодных ферментативных активностей включают элонгазы, десатуразы жирных кислот, трансферазы, ацил CoA синтазы и тиоэстеразы. Например, подходящие десатуразы жирных кислот включают, однако не ограничиваясь этим: дельта-4-десатуразу, дельта-5-десатуразу, дельта-6-десатуразу, дельта-8-десатуразу, дельта-9-десатуразу, дельта-12-десатуразу, дельта-15-десатуразу, и/или дельта-17-десатуразу. Примеры подходящих элонгаз включают, однако, не ограничиваясь этим: дельта-9-элонгазу, C14/16 -элонгазу, C16/18-элонгазу, C18/20-элонгазу и/или C20/22-элонгазу.

Примеры подходящих трансфераз включают, однако не ограничиваясь этим, ацил трансферазы, такие как глицерин-3-фосфат O-ацилтрансфераза (называемая также глицерин-фосфат ацил трансфераза или глицерин -3-фосфат ацил трансфераза; ГФАТ), 2-ацилглицерин O-ацилтрансфераза, 1-ацилглицерин-3-фосфат O-ацилтрансфераза (называемая также 1-ацилглицерин-фосфат ацилтрансфераза или лизо-фосфатидкислотная ацилтрансфераза; АГФАТ или ЛФКАТ идли ЛФАТ), 2-ацилглицерин-3-фосфат O-ацилтрансфераза, 1-ацилглицерофосфохолин O-ацилтрансфераза (называемая также лизо-лецитин ацилтрансфераза или лизо-фосфатидилхолин ацилтрансфераза; АГФХАТ или ЛЛАТ или ЛФХАТ), 2-ацилглицерофосфохолин O-ацилтрансфераза, диацилглицерин O-ацилтрансфераза (называемая также диглицерид ацил трансфераза; ДАГАТ или ДГАТ) и фосфолипид:диацилглицерин ацилтрансфераза (ФДАТ).

Пример подходящей ацил CoA синтазы включает, однако не ограничиваясь этим, длинноцепочечную-жирнокислотную-CoA лигазу (называемую также ацил-активирующий фермент или ацил-CoA синтаза).

Пример подходящей тиоэстеразы включает, однако не ограничиваясь этим, олеоил-[ацил-носитель-протеин] гидролаза (называемая такжек ацил-[ацил-носитель-протеин] гидролаза, ацил-АНП-гидролаза или ацил-АНП-тиоэстераза.

Лучше, когда мультизим данного изобретения обладает ферментативными активностями, которые включают по меньшей мере одну элонгазу жирных кислот, сцепленную с по меньшей мере одной десатуразой жирных кислот.

Связь, используемая для формирования мультизима, включает, как минимум, отдельную полипептидную связь. В другом аспекте, связь может включать один аминокислотный остаток, такой как пролин, или полипептид. Если данная связь является полипептидом, может быть желательным для данной связи иметь по меньшей мере один пролиновый аминокислотный остаток.

Лучше, когда мультизим настоящего изобретения обладает первой ферментативной активностью, связанной со второй ферментативной активностью, и данная связь выбирается из группы, которая состоит из полипептидной связи, SEQ ID NO:198 (линкер EgDHAsyn1), SEQ ID NO:200 (линкер EgDHAsyn2), SEQ ID NO:235 (линкер EaDHAsyn1), SEQ ID NO:472, SEQ ID NO:504, и модифицированных Yarrowia lipolytica линкеров (SEQ ID NOs:438 и 445).

Кроме того, в объем данного изобретения входит способ получения мультизима, который включает:

(a) связывание первого полипептида с по меньшей мере вторым полипептидом, где каждый полипептид обладает независимой и раздельной ферментативной активностью; и

(b) оценку продукта стадии (a) в отношении независимой и раздельной ферментативных активностей.

Как описывалось выше, ферментативные активности выбираются из группы, которая состоит из элонгазы жирных кислот, десатуразы жирных кислот, ацил трансфераз, ацил CoA синтаз и тиоэстераз. Лучше, когда ферментативные активности включают по меньшей мере одну элонгазу жирных кислот, связанную с по меньшей мере одной десатуразой жирных кислот.

Примеры подходящих десатураз, элонгаз и линкеров описаны выше.

Хотя выше описаны многочисленные примеры мультизимов, ДГК синтазы (включающие как активность C20-элонгазы, так и активность дельта-4-десатуразы) и ДГЛК синтазы (включающие как активности дельта-9-элонгазы, так и дельта-8-десатуразы) представляют особый интерес. Описанные выше данные подтверждают, что связывание двух доменов внутри каждой синтазы дает повышенную эффективность или поток, в сравнении с эффективностью или потоком, наблюдаемыми, когда ферментативные домены существуют как независимые сущности, т.е. не связанные вместе в мультизиме.

Например, когда мультизим, включающий Euglena gracilis C 20 домен элонгазы и Schizochytrium aggregatum дельта-4-десатуразу, был экспрессирован в Yarrowia lipolytica, активность дельта-4-десатуразы была приблизительно в 2-3 раза выше в слитой конструкции, в противоположность ее активности при отдельной экспрессии (Пример 28). Подобно этому, когда Euglena gracilis C20 домен элонгазы-Schizochytrium aggregatum дельта-4-десатуразный гибрид был экспрессирован как мультизим в сое, наблюдался повышенный поток ЭПК в ДГК, в отличие от ситуации, когда два указанных фермента были экспрессированы независимо (Пример 49).

Повышенная эффективность (или поток ЛК в ДГЛК) была также продемонстрирована в различных ДГЛК синтазах, которые были созданы. Ряд из шести дельта-9-элонгаза/дельта-8-десатуразных слитых конструкций был создан с использованием различных комбинаций дельта-9-элонгаз, полученных из E. gracillis, E. anabaena UTEX 373 и Eutreptiella sp. CCMP389, и дельта-8-десатураз, полученных из E. gracillis и E. anabaena UTEX 373; они были индивидуально экспрессированы в Yarrowia lipolytica (Примеры 55 и 56, соответственно). Во всех случаях слитый ген обладал более высокой активностью, чем один индивидуальный ген, экспрессированный в Yarrowia. Эти данные вновь предполагают, что продукт дельта-9-элонгазы может прямо каналироваться как субстрат дельта-8-десатуразы в слитый протеин. Специалист в данной области сможет употребить приведенные здесь рассуждения для создания разных других мультизимов, которые обладают повышенной эффективностью или потоком. Соответственно, данное изобретение касается любого мультизима, который создан с использованием линкера, полученного из последовательностей настоящего изобретения. Мультизимами, которым отдается предпочтение, являются те, которые объединяют различные гены ПНЖК биосинтетического пути.

Идентификация последовательностей новых ДГК синтаз

В настоящем изобретении нуклеотидные последовательности, кодирующие ДГК синтазы, были выделены из Euglena gracilis и Euglena anabaena, как резюмировано ниже в Таблице 4.

ТАБЛИЦА 4

Сводка Euglena ДГК синтаз
Обозначение ДГК синтаз ОрганизмНуклеотидная SEQ ID NOАминокислотная SEQ ID NO
EgDHAsyn1E. gracilis 1112
EgDHAsyn1*E. gracilis 20512
EgDHAsyn2E. gracilis 2122
EaDHAsyn1E. anabaena 9195
EaDHAsyn2E. anabaena 9296
EaDHAsyn3E. anabaena 9397
EgDHAsyn1S (кодон-оптимизирована для Yarrowia экспрессии)Получено из E. gracilis EgDHAsyn1

синтетическим путем
410 411 (идентична SEQ ID NO:12)

В некоторых вариантах текущие EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и EaDHAsyn3 DHA синтазные последовательности могут быть кодон-оптимизированы для экспрессии в конкретном организме хозяина. Как хорошо известно в данной области, это может послужить полезным средством для дополнительной оптимизации экспрессии данного фермента в измененном хозяине, поскольку использование предпочитаемых хозяином кодонов может значительно усилить экспрессию постороннего гена, кодирующего данный полипептид. EgDHAsyn1, например, был кодон-оптимизирован для экспрессии в Yarrowia lipolytica (Пример 54), с образованием EgDHAsyn1S (как указано в патенте США № 7238482 и патенте США № 7125672).

Специалист в данной области сможет использовать наработки данного изобретения для создания различных других кодон-оптимизированных ДГК синтазных протеинов, подходящих для оптимальной экспрессии в альтернативных хозяевах, основываясь на последовательностях дикого типа EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и/или EaDHAsyn3, описанных выше в Таблице 4. Соответственно, настоящее изобретение касается любого кодон-оптимизированного ДГК синтазного протеина, который получен из последовательности дикого типа данного изобретения. В некоторых вариантах, которым отдается предпочтение, может быть желательным модифицировать часть кодонов, кодирующих EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и/или, EaDHAsyn3, для усиления экспрессии данного гена в организме хозяина, включая, однако не ограничиваясь этим, растение или часть растения.

В другом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего ДГК синтазу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий ДГК синтазной активностью, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, или SEQ ID NO:97;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий ДГК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий ДГК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:205, или SEQ ID NO:410; или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового числа нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

Еще в другом аспекте, данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, или SEQ ID NO:411;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 или SEQ ID NO:410;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий ДГК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 или SEQ ID NO:410; или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового числа нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

Лучше, когда выделенный полинуклеотид, кодирующий ДГК синтазу, содержит последовательность, представленную в какой либо из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410.

Идентификация и выделение гомологов

Любая из текущих ДГК синтазных последовательностей (т.е. EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и EaDHAsyn3) или их частей может быть использована для поиска гомологов ДГК синтазы в тех же самых или других видах бактерий, водорослей, грибов, эвгленоидов или растений с использованием программы анализа последовательностей. В общем, такая компьютерная программа подбирает схожие последовательности, приписывая разные степени гомологии различным субституциям, делециям и другим модификациям.

Как альтернатива, любая из текущих ДГК синтазных последовательностей или ее частей могут также быть использованы как реагенты гибридизации для идентификации ДГК синтазных гомологов. Базовые компоненты нуклеиновокислотного гибридизационного теста включают зонд, образец, который, как предполагается, содержит нужный ген или генный фрагмент и специфический метод гибридизации. Зонды настоящего изобретения, типично, представляют собой одноцепочечные нуклеиновокислотные последовательности, комплементарные к нуклеиновокислотным последовательностям, которые предстоит обнаружить. Зонды мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 гибридизуемымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 с нуклеиновокислотными последовательностями, которые предстоит выявить. Хотя длина зонда может варьировать от 5 оснований до десятков тысяч оснований, обычно подходит длина зонда от приблизительно 15 оснований до приблизительно 30 оснований. Только часть молекулы зонда должна быть комплементарной к нуклеиновокислотной последовательности, которую предстоит обнаружить. Кроме того, комплементарность между зондом и таргетной последовательностью не обязательно должна быть совершенной. Гибридизация все же имеет место между несовершенно комплементарными молекулами с тем результатом, что некоторая доля оснований на участке гибридизации не спарена с соответствующим комплементарным основанием.

Методы гибридизации хорошо известны. Обычно зонд и образец должны быть смешаны при условиях, которые дают возможность осуществлять нуклеиновокислотную гибридизацию. Это включает контактирование зонда и образца в присутствии неорганической или органической соли при подходящих концентрации и температуре. Нуклеиновые кислоты зонда и образца должны находиться в контакте на протяжении достаточно длительного времени, чтобы между ними могла произойти любая возможная гибридизация. Концентрация зонда или мишени в смеси будет определять время, необходимое для протекания гибридизации. Чем выше концентрация зонда или мишени, тем меньше будет время инкубации гибридизации. При необходимости, может добавляться разобщающий агент (например, гуанидинхлорид, гуанидинтиоцианат, цианат натрия, тетрахлороацетат лития, перхлорат натрия, тетрахлороацетат рубидия, йодид калия, трифтороацетат цезия). При желании, к гибридизационной смеси может быть добавлен формамид, обычно 30-50% (объем/объем).

Могут применяться различные гибридизационные растворы. Обычно, они содержат от приблизительно 20 до 60% по объему, лучше, 30%, полярного органического растворителя. Обычный гибридизационный раствор содержит приблизительно 30-50% объем/объем формамида, приблизительно от 0,15 до 1 M хлорида натрия, приблизительно от 0,05 до 0,1 M буферов (например, цитрат натрия, Tris-HCl, PIPES или HEPES (область pH приблизительно 6-9)), приблизительно от 0,05 до 0,2% детергента (например, додецилсульфат натрия), или 0,5-20 мМ EDTA, FICOLL (объединение Фармация) (приблизительно 300-500 кДальтонов), поливинилпирролидон (приблизительно 250-500 кДальтонов), и сывороточный альбумин. Кроме того, в типичный раствор для гибридизации входят немеченые нуклеиновые кислоты-носители от приблизительно 0,1 до 5 мг/мл, фрагментированная нуклеиновая ДНК (например, ДНК из зобной железы теленка или ДНК из молок лососевых, или дрожжевая РНК), и при необходимости приблизительно от 0,5 до 2% вес/объем глицина. Могут включаться и другие добавки, такие как агенты, уменьшающие объем, которые включают ряд полярных водорастворимых или разбухающих агентов (например, полиэтиленгликоль), анионные полимеры (например, полиакрилат или полиметакрилат) и анионные сахаридные полимеры (например, декстрансульфат).

Нуклеиновокислотная гибридизация адаптируема к различным форматам образцов для анализа. Одним из наиболее подходящих является сэндвичевый формат. Сэндвичевая проба особенно приспособлена к гибридизации при неденатурирующих условиях. Основным компонентом пробы сэндвичевого типа является твердый носитель, к которому путем адсорбции или за счет ковалентных связей присоединен иммобилизированный нуклеиновокислотный зонд, котрый непомечен и комплементарен к одному участку данной последовательности.

В дополнительных вариантах любой из ДГК синтазных нуклеиновокислотных фрагментов, описанных здесь (или каких-либо их гомологов, идентифицированных здесь), может быть использован для выделения генов, которые кодируют гомологичные протеины, из тех же самых или других бактериальных, водорослевых, грибковых, эвгленоидных или растительных видов. Изоляция гомологичных генов с использованием зависимых от последовательности протоколов хорошо известна в данной оторасли. Примеры зависимых от последовательности протоколов включают, однако не ограничиваясь этим: (1) методы нуклеиновокислотной гибридизации; (2) методы ДНК и РНК амплификации, как иллюстрируется различными применениями нуклеиновокислотных технологий амплификации [например, полимеразная цепная реакция (ПЦР), Mullis et al., патент США № 4683202; лигазная цепная реакция (ЛЦР), Tabor et al., Proc. Acad. Sci. USA 82:1074 (1985); или амплификация со смещением цепочки (АСЦ), Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)]; и (3) методы построения библиотеки и скрининга путем комплементации.

Например, гены, кодирующие схожие протеины или полипептиды в мультизим или его индивидуальный домен (такие как ДГК синтазы), описанные в настоящей заявке, могли бы быть выделены непосредственно путем использования всех или части текущих нуклеиновокислотных фрагментов как ДНК гибридизационных зондов для скрининга библиотек из, например, любых необходимых дрожжей или грибков с использованием методологии, хорошо известной специалистам в данной области (где предпочтение отдается организмам, производящим ДТК, ДПКn-6, ДПК и/или ДГК). Специфические олигонуклеотидные зонды на основе текущих нуклеиновокислотных последовательностей могут быть сконструированы и синтезированы с использованием известных в данной области методов (Maniatis, supra). Кроме того, для синтеза ДНК зондов могут быть непосредственно использованы полные последовательности с применением методов, известных специалистам в данной области (например, ДНК мечение с использованием рассеянной затравки, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 никмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 трансляция или метод концевого мечения), или РНК зондов с использованием имеющихся in vitro транскрипционных систем. В дополнение, специфические праймеры могут быть созданы и использовагы для амплификации части (или всей длины) данных последовательностей. Результирующие продукты амплификации могут метиться непосредственно при реациях амплификации или метиться после реакций амплификации и использоваться как зонды для выделения фрагментов ДНК полной длины в условиях подходящей жесткости.

Обычно, в технике амплификации типа ПЦР праймеры имеют отличные последовательности и некомплементарны один к другому. В зависимости от желательных условий теста последовательности праймеров должны быть сконструированы таким образом, чтобы обеспечить как эффективную, так и правильную репликацию нуклеиновой кислоты-мишени. Методы создания ПЦР праймеров носят общий характер и хорошо известны в данной области (Thein и Wallace, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disordersмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , in Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K. E. Davis Ed., (1986) pp 33-50, IRL: Herndon, VA; and Rychlik, W., In Methods in Molecular Biology, White, B. A. Ed., (1993) Vol. 15, pp 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humania: Totowa, NJ).

В общем, два коротких сегмента текущих последовательностей могут быть использованы в ПЦР протоколах для амплификации более длинных нуклеиновокислотных фрагментов, кодирующих гомологичные гены из ДНК или РНК. ПЦР может также осуществляться на библиотеке клонированных нуклеиновокислотных фрагментов, где последовательность одного праймера получается из текущих нуклеиновокислотных фрагментов, и последовательность другого праймера использует преимущество присутствия трактов полиадениловой кислоты в 3' конце мРНК предшественника, кодирующего эукариотные гены.

Как альтернатива, последовательность второго праймера может основываться на последовательностях, полученных из клонирующего вектора. Например, опытный специалист может следовать протоколу RACE (Frohman et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 85:8998 (1988)) для генерации кДНК путем использования ПЦР для амплификации копий участка между отдельной точкой в транскрипте и 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 концом. Праймеры, ориентированные в направлениях 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 концов, могут быть созданы из текущих последовательностей. С использованием имеющихся в продаже 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 RACE или 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 RACE систем (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), могут быть выделены специфические 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 кДНК фрагменты (Ohara et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989)).

В других вариантах любые из ферментов (например, мультизимы, ДГК синтазы или отдельные домены, описанные здеь) могут быть модифицированы. Как хорошо известно специалистам в данной области, для получения мутаций природных генов могут быть использованы in vitro мутагенез и селекция, химический мутагенез, методы мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 перетасовки геновмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 или другие меры. Как альтернатива, мультизимы могут быть синтезированы путем перестановки доменов, где функциональный домен из любого фермента может обмениваться на или добавляться к функциональному домену в альтернативном ферменте, что дает таким образом новый протеин.

Идентификация последовательностей новых C20-элонгаз

В настоящем изобретении нуклеотидные последовательности, кодирующие C20-элонгазы, были выделены из Euglena gracilis и Euglena anabaena, как показано ниже в Таблице 5.

ТАБЛИЦА 5

Сводка данных по Euglena C20-элонгазам
Обозначение C20-элонгазы ОрганизмНуклеотидная SEQ ID NOАминокислотная SEQ ID NO
EgDHAsyn1 домен C20-элонгазы E. gracilis201 202
EgDHAsyn1* домен C20-элонгазыE. gracilis 206 --
EgDHAsyn2 домен C20-элонгазыE. gracilis 203 204
EaDHAsyn1 домен C20-элонгазыE. anabaena 227 231
EaDHAsyn2 домен C20-элонгазыE. anabaena 228 232
EaDHAsyn3 домен C20-элонгазыE. anabaena 229 233
EaDHAsyn4 домен C20-элонгазыE. anabaena 230 --
EgC20ES домен C 20-элонгазы (кодон-оптимизирован для экспрессии в Yarrowia) Получен синтетически из E. gracilis EgDHAsyn1183 184 (идентична SEQ ID NO:202)
EaC 20ES домен C20-элонгазы (кодон-оптимизирован для экспрессии в Yarrowia)Получен синтетически из E. anabaena EaDHAsyn2 188189 (идентична SEQ ID NO:232)

Настоящее изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующегл C20 -элонгазу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью C20 -элонгазы, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97; SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, или SEQ ID NO:233;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью C20 -элонгазы, где данная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, или SEQ ID NO:230; (c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью C20 -элонгазы, где данная нуклеотидная последовательность гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:230; или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового числа нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

Лучше, когда фермент полинуклеотид, кодирующий C20 -элонгазу, включает последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, или SEQ ID NO:230.

Идентификация последовательностей новых дельта-4-десатураз

В настоящем изобретении нуклеотидные последовательности, кодирующие дельта-4-десатуразы, были выделены из Euglena gracilis и Euglena anabaena, как показано в Таблице 6.

ТАБЛИЦА 6

Сводка данных по Euglena дельта-4-десатуразам
Обозначение* дельта-4-десатуразыОрганизм Нуклеотидная SEQ ID NO Аминокислотная SEQ ID NO
EgDHAsyn1 дельта-4-десатураза домен 1E. gracilis 214215
EgDHAsyn1 дельта-4-десатураза домен 1* Получен синтетически из E. gracilis EgDHAsyn1 216217
EgDHAsyn1* дельта-4-десатураза домен 2 E. gracilis220 221
EaDHAsyn1 дельта-4-десатураза домен 1E. anabaena 236239
EaDHAsyn2 дельта-4-десатураза домен 1 E. anabaena237 240
EaDHAsyn4 дельта-4-десатураза домен 1E. anabaena 238241
EaDHAsyn1 дельта-4-десатураза домен 2 E. anabaena242 246
EaDHAsyn2 дельта-4-десатураза домен 2 E. anabaena 243247

EaDHAsyn3 дельта-4-десатураза домен 2 E. anabaena244 248
EaDHAsyn4 дельта-4-десатураза домен 2 E. anabaena 245249
EaD4S дельта-4-десатураза домен (кодон-оптимизирован для экспрессии в Yarrowia)Получен синтетически из E. anabaena EaDHAsyn2192 193
EgD4S дельта-4-десатураза домен (кодон-оптимизирован для экспрессии в Yarrowia) Получен синтетически из E. gracilis EgDHAsyn1 387388
* Примечание: Дельта-4-десатуразный домен 1 не включает обогащенный пролином линкер ДГК синтазы, из которой он был получен. В противоположность этому, дельта-4-десатуразный домен 2 все же включает обогащенный пролином линкер ДГК синтазы, из которой он был получен.

В альтернативных вариантах текущие дельта-4-десатуразные доменные последовательности могут быть кодон-оптимизировавны для экспрессии в конкретном организме хозяина. Нпример, Euglena anabaena дельта-4-десатуразный домен EaDHAsyn2 был кодон-оптимизирован для экспрессии в Yarrowia lipolytica. Например, Euglena gracilis дельта-4-десатуразный домен EgDHAsyn1 был также кодон-оптимизирован для экспрессии в Yarrowia lipolytica. Специалист в данной области сможет применить приведенный здесь поучительный материал для создания различных других кодон-оптимизированных дельта-4-десатуразных протеинов, подходящих для оптимальной экспрессии в альтернативных хозяевах, исходя из дельта-4-десатуразных доменных последовательностей дикого типа EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и/или EaDHAsyn3 как описано выше в Таблице 6. Соответственно, настоящее изобретение касается любого из кодон-оптимизированного дельта-4-десатуразного протеина, который получен из последовательности дикого типа данного изобретения. В некоторых вариантах, которым отдается предпочтение, может быть желательным модифицировать часть кодонов, кодирующих дельта-4-десатуразные доменные последовательности EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и/или EaDHAsyn3 для усиления экспрессии данного гена в организме хозяина, включая, однако не ограничиваясь этим, растение или часть растения.

Более того, основываясь на наблюдении того, что C-терминальный участок C20-элонгазного домена ДГК синтазы, как представляется, перекрывается с N-терминальным участком дельта-4-десатуразного домена, были проведены функциональные анализы для определения оптимального функционального дельта-4-десатуразного доимена. Как описано в Примерах 51 и 53 ниже, с использованием кодон-оптимизированных протеиновых последовательностей, EaD4S (SEQ ID NO:193) и EgD4S (SEQ ID NO:388), были проведены исследования по делеции мутагенеза. Были получены следующие варианты: EaD4S-3 (SEQ ID NO:386), EaD4S-2 (SEQ ID NO:384), EaD4S-1 (SEQ ID NO:382), EgD4S-3 (SEQ ID NO:408), EgD4S-2 (SEQ ID NO:406) и EgD4S-1 (SEQ ID NO:404).

Специалисту в данной области должно быть понятно, что поскольку точные границы этих конкретных дельта-4-десатуразных последовательностей из Euglena gracilis и Euglena anabaena полностью не определены, фрагменты протеинов или полипептиды увеличеной или уменьшенной длины могут обладать сравнимой активностью дельта-4-десатуразы. Подобно этому, легко могут быть сделаны сравнимые усечения на основе дельта-4-десатуразных доменных последовательностей дикого типа EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и/или EaDHAsyn3, как описано выше в Таблице 6, с образованием дельта-4-десатуразы, обладающей достаточной степенью активности дельта-4-десатуразы, где предпочтение отдается эквивалентной или повышенной активности дельта-4-десатуразы.

Таким образом, настоящее изобретение касается также выделенного полинуклеотида, кодирующего дельта-4-десатуразу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью дельта-4-десатуразы, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406, или SEQ ID NO:408;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью дельта-4-десатуразы, где данная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405 или SEQ ID NO:407;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью дельта-4-десатуразы, где данная нуклеотидная последовательностьа гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405 или SEQ ID NO:407; или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового числа нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

Лучше, когда фермент полинуклеотид, кодирующий дельта-4-десатуразу, включает последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405, или SEQ ID NO:407.

Эффект усечения Euglena anabaena дельта-4-десатуразы состоит в том, что ферментативная активность повышена, по сравнению с ферментативной активностью последовательности дикого типа. Этот результат неожиданный и непредвиденный, поскольку обычный специалист в данной области мог бы предполагать, что активность усеченной последовательности будет не лучше и возможно хуже, чем у последовательности дикого типа. Соответственно, данное изобретение также представляет новый способ получения дельта-4-десатуразы, обладающей более высокой активностью, чем последовательность дикого типа, данный способ включает: a) предоставление дельта-4-десатуразного полипептида дикого типа, выделенного из Euglena anabena, обладающего базисной активностью дельта-4-десатуразы; и б) усечение полипептида дикого типа (a) на приблизительно от 1 до приблизительно 200 аминокислот с образованием усеченного мутантного полипептида, обладающего активностью дельта-4-десатуразы, которая повышена по сравнению с базовой активностью дельта-4-десатуразы. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Базоваямультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 активность, как используется в этом контексте, определяется как активность фермента дикого типа, измеренная или in vivo или in vitro, в соответствии со стандартными ферментативными протоколами, как описано в данной заявке.

В других вариантах любой из ферментов (например, мультизимы, ДГК синтазы, C 20-элонгазы, дельта-4-десатуразы, и/или любой из гомологов), который здесь идентифицирован, может быть модифицирован для генерации новых и/или улучшенных ферментов ПНЖК биосинтетического пути. Как хорошо известно специалистам в данной области, для получения мутаций природных генов могут применяться методы in vitro мутагенеза и селекции, химического мутагенеза, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 перетасовкимультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 генов или другие меры. Как альтернатива, мультизимы могут быть синтезированы методом перестановки доменов, где функциональный домен из какого-либо фермента может обмениваться с или добавляться к функциональному домену в альтернативном ферменте с образованием, таким образом, нового протеина.

Способы получения различных омега-3 и/или омега-6 жирных кислот

Ожидается, что введение химерных генов, кодирующих ДГК синтазы, описанных в данном тексте (т.е. EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и EaDHAsyn3 или других мутантных ферментов, кодон-оптимизированных ферментов или их гомологов), под контролем подходящих промоторов обеспечит повышенное производство ДТК, ДПКn-6, ДПК и/или ДГК в трансформированном организме хозяина, соответственно. Как таковое, данное изобретение охватывает способ прямого производства ПНЖК, включающий экспонирование жирнокислотного субстрата (т.е. ЭПК или ДПК) относительно ДГК синтазных ферментов, описанных здесь (например, EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и EaDHAsyn3), такое, что данный субстрат конвертируется в необходимый жирнокислотный продукт (т.е. ДГК).

Более конкретно, настоящее изобретение касается способа трансформации клетки-хозяина, такого, что данная клетка-хозяин содержит в своем геноме рекомбинантная конструкция данного изобретения.

Примеры пригодных клеток-хозяев включают, однако не ограничиваясь этим, растения и дрожжи. Лучше, когда растительные клетки получаются из маслянистого растения, такого как соя и подобного, и дрожжевые клетки получаются из жировых дрожжей, таких как вид Yarrowia.

Кроме того, в объем данного изобретения входит способ получения трансформированного растения или дрожжей, включающий трансформацию растительной клетки или дрожжевой клетки с помощью любого из полинуклеотидов данного изобретения и восстановление растения из трансформированной растительной клетки или выращивание трансформированных дрожжевых клеток.

Более конкретно, предметом настоящего изобретения является представление способа выработки ДПКn-6 или ДГК в клетке-хозяине (например, растений, жировых дрожжей), где данная клетка-хозяин включает:

изолированную нуклеотидную молекулу, кодирующую полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, или SEQ ID NO:97; и,

(ii) источник АРК или ЭПК;

где клетка-хозяин выращивается при таких условиях, что полипептид, обладающий ДГК синтазной активностью, экспрессирован, и АРК конвертирована в ДПКn-6 и/или ЭПК конвертирована в ДГК, и где ДПКn-6 или ДГК, при необходимости, восстановлена.

В альтернативных вариантах настоящее изобретение касается способа выработки ДТК или ДПК в клетке-хозяине (например, растений, жировых дрожжей), где данная клетка-хозяин включает:

изолированную нуклеотидную молекулу, кодирующую полипептид, который обладает активностью С20-элонгазы, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, or SEQ ID NO:233; и,

(ii) источник АРК или ЭПК;

где клетка-хозяин выращивается при таких условиях, что полипептид, обладающий активностью С20-элонгазы, экспрессирован, и АРК конвертирована в ДТК и/или ЭПК конвертирована в ДПК, и где ДТК или ДПК, при необходимости, восстановлена.

Дополнительно, данное изобретение представляет способ выработки ДПКn-6 или ДГК, где клетка-хозяин включает:

изолированную нуклеотидную молекулу, кодирующую полипептид, который обладает активностью дельта-4-десатуразы, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406, или SEQ ID NO:408; и,

(ii) источник ДТК или ДПК;

где клетка-хозяин выращивается при таких условиях, что полипептид, обладающий активностью дельта-4-десатуразы, экспрессирован, и ДТК конвертирована в ДПКn-6 и/или ДПК конвертирована в ДГК, и где ДПКn-6 или ДГК, при необходимости, восстановлена.

Источник субстрата(ов) АРК, ДТК, ЭПК или ДПК, использованных в каком-либо из методов, рассмотренных выше, может быть получен хозяином или природным путем или трансгенно, или может быть введен экзогенно.

Связывыание индивидуальных доменов с образованием мультизима может привести к снижению количества промежуточных жирных кислот. Например, связывание C20 -элонгазы с дельта-4-десатуразой в мультизим, такой как ДГК синтаза, может привести к уменьшению количества промежуточной жирной кислоты ДПК при производстве ДГК. Подобно этому связывание дельта-9-элонгазы с дельта-8-десатуразой с использованием EgDHAsyn1 линкера с образованием мультизима, как здесь описано, может привести к выработке ДГЛК и ЭТК со снижением образования ЭДК и ЭРК интермедиатов.

Как альтернатива, каждый мультизимный ген, включающий ДГК синтазу и соответствующие ферментные продукты, описанные здесь, может быть использован косвенно для производства разных омега-6 и омега-3 ПНЖК, включая, например, ДТК, ДПКn-6, ДГЛК, ЭТК, АРК, ЭПК, ДПК и/или ДГК (ФИГ.1; см. патент США № 7238482). Косвенное образование омега-3/омега-6 ПНЖК имеет место, где жирнокислотный субстрат конвертируется косвенным образом в необходимый жирнокислотный продукт через промежуточную стадию(и) или интермедиат(ы) данного пути. Таким образом, предполагается, что ДГК синтазы, описанные здесь (т.е. EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и EaDHAsyn3, или другие мутантные ферменты, кодон-оптимизированные ферменты или их гомологи), могут быть экспрессированы в сочетании с дополнительными генами, кодирующими ферменты ПНЖК биосинтетического пути (например, дельта-6-десатуразы, C18/20-элонгазы, дельта-17-десатуразы, дельта-8-десатуразы,мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 дельта-15-десатуразы, дельта-9-десатуразы, дельта-12-десатуразы, C14/16-элонгазы, C16/18-элонгазы, дельта-9-элонгазы, дельта-5-десатуразы, дельта-4-десатуразы, C20/22-элонгазы, ДГК синтазы), с достижением более высоких уровней выработки более длинноцепочечных омега-3/омега-6 жирных кислот (например, АРК, ДТК, ДПКn-6, ЭПК, ДПК и/или ДГК).

Специфические гены, включенные в конкретную экспрессирующую кассету, будут зависеть от клетки-хозяина (и ее ПНЖК профиля, и/или десатураза/элонгазного профиля), наличия субстрата и желательного конечного продукта(ов).

В некоторых случаях может быть желательным минимизировать побочные жирные кислоты. Относительное содержание побочных жирных кислот может быть снижено путем связывания индивидуальных путевых ферментов вместе с линкером с образованием мультизима. Например, присутствие скиадоновой кислоты (СКК) и/или юнипероновой кислоты (ЮП) [которые обычно находят в семенных липидах голосеменных растений (Wolff et al., Lipids 35(1):1-22 (2000)), таких как растения из семейства Pinaceae (сосна], могут рассматриваться как побочные жирные кислоты дельта-6-десатураза/дельта-6-элонгазного пути или дельта-9-елонгаза/дельта-8-десатуразного пути. Хотя эти жирные кислоты, как считается, сами по себе обладают различными оздоровительными свойствами (Nakane et al., Biol. Pharm. Bull. 23: 758-761 (2000)), их присутствие как побочных жирных кислот на разработанном методами генной инженерии ПНЖК пути, таком как в маслянистой культуре, может быть нежелательным, в зависимости от применения. Связывание дельта-9-элонгазы вместе с дельта-8-десатуразой с использованием линкера с образованием мультизима (ДГЛК и/или ЭТК синтазы), например, может дать увеличенный поток через эти стадии, что приведет к уменьшенному количеству ЭДК/ЭРК промежуточных жирных кислот на пути к дельта-5-десатуразе и, таким образом, к сниженным концентрациям СКК и ЮП.

Случайно, дельта-6-элонгаза может удлинить жирные кислоты, другие, чем предусмотренную жирную кислоту. Например, дельта-6-элонгаза преобразует, в общем, ГЛК в ДГЛК, однако некоторые дельта-6-элонгазы могут также превращать непредусмотренные субстраты, такие как ЛК или АЛК в ЭДК или ЭТрК, соответственно. На дельта-6-десатураза/дельта-6-элонгазном пути ЭДК и ЭТрК могут рассматриваться как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 побочные жирные кислотымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 . Добавление дельта-8-десатуразы к дельта-6-десатураза/дельта-6-элонгазному пути может предоставить средства для превращения мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 побочных жирных кислотмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ЭДК и ЭТрК назад в мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 промежуточные жирные кислотымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , соответственно, ДГЛК и ЭТК.

В альтернативных вариантах может быть полезным разорвать нативную ДГК синтазу, С20-элонгазу или дельта-4-десатуразу организма хозяина, основываясь на полных последовательностях, описанных здесь, комплементе этих полных последовательностей, существенных участках этих последовательностей, кодон-оптимизированных десатуразах, полученных из них, и тех последовательностях, которые в значительной мере гомологичны к ним.

Растительные системы экспрессии, кассеты и векторы, и трансформация

В одном варианте данное изобретение касается рекомбинантного конструкционного элемента, который включает какой-либо из выделенных полинуклеотидов изобретения, связанный действующим образом с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью, пригодной для экспрессии в клетке-хозяине, таком как растение. Промотор представляет собой ДНК последовательность, которая направляет клеточный механизм растения на выработку РНК из соседней кодирующей последовательности вниз (3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) от промотора. Промоторный участок влияет на скорость, стадию развития и тип клетки, в которой РНК транскрипт данного гена выработан. РНК транскрипт подвергается процессингу с образованием мРНК, которая служит матрицей для трансляции РНК последовательности в аминокислотную последовательность кодированного полипептида. 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 нетранслированная лидерная последовательность представляет собой участок мРНК вверх от участка, который кодирует протеин, которая может играть роль в инициации и трансляции мРНК. 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 транскрипционно-терминационная/полиаденилирующая сигнальная последовательность представляет собой нетранслированный участок вниз от кодирующего протеин участка, который функционирует в растительной клетке, обуславливая терминацию РНК транскрипта и добавление полиаденилатных нуклеотидов к 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 концу РНК.

Происхождение промотора, выбранного для экспрессии кодирующей последовательности, не является важным, поскольку он обладает достаточной транскрипционной активностью для реализации данного изобретения путем экспрессии способной к трансляции мРНК для необходимых фрагментов нуклеиновой кислоты в необходимой ткани хозяина в корректный момент времени. Для практической реализации данного изобретения могут быть использованы как гетерологические, так и негетерологические (т.е. эндогенные) промоторы. Например, подходящие промоторы включают, однако не ограничиваясь этим, альфа первичную субъединицу бета конглицининового промотора, кунитц трипсин ингибиторный 3 промотор, аннексиновый промотор, глицининовый Gy1 промотор, бета субъединицу бета конглицининового промотора, P34/Gly Bd m 30K промотор, альбуминовый промотор, Leg A1 промотор и Leg А2 промотор.

Аннексиновый, или Р34 промотор описан в РСТ публикации под номером WO 2004/071178 (опубликована 26 августа 2004 года). Уровень активности аннексинового промотора сравним с уровнем многих известных сильных промоторов, таких как: (1) CaMV 35S промотор (Atanassova et al., Plant Mol. Biol. 37:275-285 (1998); Battraw и Hall, Plant Mol. Biol. 15:527-538 (1990); Holtorf et al., Plant Mol. Biol. 29:637-646 (1995); Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907 (1987); Wilmink et al., Plant Mol. Biol. 28:949-955 (1995)); (2) Arabidopsis олеозиновые промоторы (Plant et al., Plant Mol. Biol. 25:193-205 (1994); Li, Texas Кандидатская дисскертация университета A&M, стр. 107-128 (1997)); (3) Arabidopsis убиквитиновые экстензионные протеиновые промоторы (Callis et al., J. Biol. Chem. 265(21):12486-93 (1990)); (4) томатный убиквитиновый генный промотор (Rollfinke et al., Gene. 211(2):267-76 (1998)); (5) соевый теплошоковый протеиновый промотор (Schoffl et al., Mol. Gen. Genet. 217(2-3):246-53 (1989)); и (6) маисовый Н3 гистонный генный помотор (Atanassova et al., Plant Mol. Biol. 37(2):275-85 (1989)).

Другой полезной особенностью аннексинового промотора является его профиль экспрессии в семенах, которые развиваются. Аннексиновый промотор наиболее активен в семенах, которые развиваются на ранних стадиях (до 10 суток после опыления), и в значительной мере спокойный на поздних стадиях. Профиль экспрессии аннексинового промотора отличается от профиля многих специфических в отношении семян промоторов, например, протеиновых промоторов хранения семян, которые часто представляют самую высокую активность на поздних стадиях развития (Chen et al., Dev. Genet. 10:112-122 (1989); Ellerstrom et al., Plant Mol. Biol. 32:1019-1027 (1996); Keddie et al., Plant Mol. Biol. 24:327-340 (1994); Plant et al., (supra); Li, (supra)). Аннексиновый промотор имеет более обычный профиль экспрессии, но остается отличным от других известных специфических в отношении семян промоторов. Таким образом, аннексиновый промотор будет очень привлекательным кандидатом, когда на ранней стадии развития необходима гиперэкспрессия или супрессия гена в зародыше. Например, может возникнуть проблема в гиперэкспрессии гена, который регулирует раннее развитие зародыша, или гена, задействованного в метаболизме до вызревания семян.

После идентификации соответствующего промотора, пригодного для экспрессии кодирующей последовательности, данный промотор потом связывают действующим образом в смысловой ориентации с использованием обычных средств, которые хорошо известны специалистам в данной области.

Стандартные методы рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, которых здесь применены, хорошо известны в этой области и более полно описаны в работе Sambrook, J. Et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1989 (в дальнейшем, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Sambrook et al., 1989мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) или Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. и Struhl, K., Eds.; In Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley and Sons: New York, 1990 (в дальнейшем, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Ausubel et al., 1990мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ). Например, гибридный ген может буть сконструирован путем сцепления по меньшей мере двух ДНК фрагментов в каркасе таким образом, чтобы не вводить терминирующий кодон (слияние в каркасе). Результирующий гибридный ген будет таким, что каждый ДНК фрагмент кодирует по меньшей мере одну независимую и раздельную ферментативную активность.

Когда рекомбинантный конструкционный элемент создан, он может быть потом введен в нужную растительную клетку с использованием методов, которые хорошо известны обычным специалистам в данной области (например, трансфекция, трансформация и электропорация). Растительными клетками, которым отдается предпочтение, являются маслянистые растительные клетки. Затем трансформированная растительная клетка культивируется и регенерируется при приемлемых условиях, которые дают возможность осуществлять экспрессию длинноцепочечной ПНЖК, которая потом, при необходимости, восстанавливается и очищается.

Рекомбинантные конструкции данного изобретения могут быть введены в одну растительную клетку; или, как альтернатива, каждый конструкция может быть введен в отдельные растительные клетки.

Экспрессия в растительной клетке может проводиться по временной или стабильной схеме как описано выше.

Необходимая длинноцепочечная ПНЖК может быть экспрессирована в семенах. Кроме того, в объем данного изобретения входят семена или части растения, полученные из таких трансформированных растений.

Части растений включают дифференциированные и недифференциированные ткани, включая, однако не ограничиваясь этим, следующие: корни, стебли, ростки, листья, пыльцу, семена, опухлевую ткань и разные формы клеток и культур (например, отдельные клетки, протопласты, зародыши и калюсную ткань). Данная растительная ткань может быть в растении или в растительном органе, ткани или клеточной культуре.

Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 растительный органмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается растительной ткани или группы тканей, которые составляют морфологично и функционально отличную часть растения. Термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 геноммультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 касается следующего: (1) всего комплемента генетического материала (гены и некодирующие последовательности), присутствующего в каждой клетке организма или вируса, или органеллы; (2) полного набора хромосом, унаследованного как (гаплоидная) единица от одного предка.

Таким образом, данное изобретение также касается способа трансформации клеток, который включает трансформирование клетки рекомбинантным конструкционным элементом данного изобретения и селекцию этих клеток, трансформированных рекомбинантными конструкционными элементами, описанными в формуле изобретения.

Также представляет интерес способ продуцирования трансформированного растения, который включает трансформирование растительной клетки полинуклеотидами данного изобретения и регенерацию растения из трансформироованной растительной клетки.

Способы трансформирования двудольних растений (главным образом, путем использования Agrobacterium tumefaciens) и получения трансгенных растений опубликованы, среди прочих, для: хлопка (патент США № 5004863; патент США № 5159135); сои (патент США № 5569834; патент США № 5416011); Brassica (патент США № 5463174); арахиса (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996); McKently et al., Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)); папайи (Ling, K. Et al., Bio/technology 9:752-758 (1991)); и гороха (Grant et al., Plant Cell Rep. 15;254-258 (1995)). В отношении обзора других общих методов превращения растений см. работу Newell, C.A. (Mol. Biotechnol. 16:53-65 (2000)). В одном из этих методов трансформации используется Agrobacterium rhizogenes (Tepfler, M. и Casse-Delbart, F. Microbiol. Sci. 4:24-28 (1987)). Трансформация сои с использованием прямой доставки ДНК и PEG слияния опубликована в РСТ публикации под номером WO 92/17598, електропорации (Chowrira, G.M. et al., Mol. Biotechnol 3:17-23 (1995); Christou, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3962-3966 (1987)), микроинъекции и бомбардировки частичками (McCabe, D.E. et al., Bio/Technology 6:923 (1988); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988)).

Существует множество методов регенерации растений из растительной ткани. Конкретный метод регенерации будет зависеть от исходной растительной ткани и конкретного вида растения, которое должно регенерироваться. Регенерация, развитие и культивирование растений из отдельных растительных протопластных трансформантов или из разных трансформированных эксплантатов хорошо известны в данной области (Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic: San Diego, CA (1988)). Эта регенерация и процесс роста обычно включают стадии селекции трансформированных клеток и культивирование данных индивидуальных клеток через обычные стадии эмбрионального развития через корневую проростковую стадию. Трансгенные зародыши и семена регенерируются подобным способом. Результирующие трансгенные корневые побеги затем выращиваются в соответствующей среде растительного роста, такой как почва. Лучше, когда регенерированные растения самоопыляются, давая гомозиготные трансгенные растения. По-другому, пыльца, полученная от регенерированных растений, скрещивается с растениями, которые выращены из семян агрономически важных линий. Напротив, пыльца от растений этих важних линий используется для опыления регенерированных растений. Трансгенное растение данного изобретения, которое содержит необходимый полипептид, культивируется с использованием методов, которые хорошо известны специалистам в данной области.

В дополнение к описанным выше процедурам, специалистам в данной области знакомы стандартные ресурсные материалы, которые описывают специфические условия и процедуры для конструирования, манипуляции и выделения макромолекул (например, ДНК молекул, плазмид и т.д.), генерации фрагментов рекомбинантной ДНК и рекомбинантных экспрессирующих конструкций, и скрининга и выделения клонов. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: NY (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor: NY (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, Vol.1, Cold Spring Harbor: NY (1998); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, Vol.2, Cold Spring Harbor: NY (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer: NY (1997).

Примеры маслянистих растений включают, однако не ограничиваясь этим, сою, виды Brassica, подсолнечник, маис, хлопок, лен и сафлор красильный.

Примеры ПНЖК, которые имеют по меньшей мере двадцать углеродных атомов и четыре или более двойных связей углерод-углерод, включают, однако не ограничиваясь этим, омега-3 жирные кислоты, такие как ЭПК, ДПК и ДГК. Семена, полученные от таких растений, также подпадают под объем данного изобретения, так же как и масло, полученное из таких семян.

Таким образом, настоящее изобретение касается также способа изменения жирнокислотного профиля маслянистого растения, который включает:

a) трансформацию клетки маслянистого растения рекомбинантным конструкционныи элементом формулы данного изобретения; и

b) регенерацию растения из трансформированной клетки маслянистого растения (a), где данное растение имеет измененный жирнокислотный профиль.

Микробные системы экспрессии, кассеты и векторы

ДГК синтазные гены и генные продукты, описанные здесь (т.е. EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, EaDHAsyn1, EaDHAsyn2 и EaDHAsyn3, или другие мутантные ферменты, кодон-оптимизированные ферменты или их гомологи), могут также образовываться в гетерологических микробных клетках-хозяевах, в частности, в клетках жировых дрожжей (например, Yarrowia lipolytica).

Микробные системы экспрессии и экспрессирующие векторы, содержащие регуляторные последовательности, которые направляют высокоуровневую экспрессию посторонних протеинов, хорошо известны специалистам в данной области. Любые из них могут быть использованы для конструирования химерных генов для выработки любого из генных продуктов текущих последовательностей. Эти химерные гены могут затем вводиться в соответствующие микроорганизмы путем трансформации, обеспечивая высокоуровневую экспрессию кодированных ферментов.

Векторы, полезные для трансформации подходящих микробных клеток-хозяев, хорошо известны в данной области. Специфический выбор последовательностей, присутствующих в данном конструкцияе, зависит от желательных продуктов экспрессии (supra), природы клетки-хозяина и предлагаемых средств отделения трансформированных клеток от нетрансформированных клеток. Однако, обычно вектор содержит по меньшей мере одну экспрессирующую кассету, селектируемый маркер и последовательности, позволяющие осуществлять автономную репликацию или хромосомную интеграцию. Подходящие экспрессирующие кассеты включают участок 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 данного гена, который контролирует инициацию транскрипции (например, промотор), кодирующую ген последовательность, и участок 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ДНК фрагмента, который контролирует терминацию транскрипции (т.e. терминатор). Наиболее предпочтительно, когда оба контрольных участка получаются из генов от данной трансформированной микробной клетки-хозяина, хотя следует понимать, что нет потребности в том, чтобы такие контрольные участки получались из генов, нативных относительно специфических видов, выбранных в качестве хозяина-производителя.

Инициирующие контрольные участки промоторов, которые полезны для драйва экспрессии текущих мультизимов, таких как ДГК синтаза или отдельный домен ОРС, в желательную микробную клетку-хозяина, многочисленны и знакомы специалистам в данной области. В сущности, любой промотор, способный направлять экспрессию этих генов в выбранную клетку-хозяина, пригоден для настоящего изобретения. Экспрессия в микробную клетку-хозяина можут осуществляться по временной или постоянной схеме. Временная экспрессия может осуществляться путем индуцирования активности регулирующего промотора, связанного действующим образом с нужным геном. Постоянная экспрессия может достигаться путем использования конститутивного промотора, связанного действующим образом с нужным геном. Как пример, когда клетка-хозяин является дрожжевой, вводятся транскрипционные и трансляционные участки, функциональные в дрожжевых клетках, в частности, из хозяйских видов (например, см. патент США № 7238482 и PCT публикацию № WO 2006/052870 относительно предпочтительных транскрипционных инициирующих регуляторных участков для использования в Yarrowia lipolytica). Любая из ряда регуляторных последовательностей может быть использована, в зависимости от того, какая требуется транскрипция, конститутивная или индуцированная, эффективности данного промотора в экспрессии нужной ОРС, легкости конструирования и подобного.

Нуклеотидные последовательности, окружающие трансляционный инициирующий кодон мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ATGмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , как было найдено, влияют на экспрессию в дрожжевых клетках. Если необходимый полипептид плохо экспрессирован в дрожжах, нуклеотидные последовательности экзогенных генов могут быть модифицированы для включения эффективной дрожжевой трансляционной инициирующей последовательности с достижением оптимальной экспрессии генов. Для экспрессии в дрожжах это может быть сделано путем сайт-направленного мутагенеза неэффективно экспрессированного гена путем слияния его в каркасе с эндогенным дрожжевым геном, лучше, сильноэкспрессированным геном. В качестве альтернативы, можно определить консенсусную трансляционную инициирующую последовательность в хозяине и методами генной инженерии внедрить эту последовательность в гетерологичные гены для их оптитмальной экспрессии в нужном хозяине.

Терминирующий участок может быть получен из 3' участка гена, из которого был получен инициирующий участок, или из другого гена. Известен целый ряд терминирующих участков, которые удовлетворительно функционируют в разных хозяевах (когда оба используются или в тех же самых родах или разных родах и видах, из которых они были получены). Терминируюший участок обычно выбирается, скорее, из соображений удобства, а не из-за какого-либо конкретного свойства. Терминирующие контрольные участки могут также получаться из различных генов, нативных для хозяев, которым отдается предпочтение. В альтернативных вариантах 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -участок может также быть синтетическим, так как специалист в данной области может воспользоваться имеющейся информацией для конструирования и синтеза последовательности 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -участка, что функционирует как транскрипционный терминатор. Когда это необходимо, можно обойтись без терминирующего сайта, однако, наибольшее предпочтение отдается его включению.

Как известно специалисту в данной области, простая инсерция гена в клонирующий вектор не гарантирует, что он будет успешно экспрессирован на необходимом уровне. Как реакция на потребность в высокой степени экспрессии, было создано множество специализированных экспрессирующих векторов путем манипулирования рядом разных генетических элементов, которые контролируют аспекты транскрипции, трансляции, стабильности протеина, кислородного ограничения и секреции из микробной клетки-хозяина. Более конкретно, некоторые молекулярные свойства, которыми манипулируют с целью контроля генной экспрессии, включают: природу релевантной транскрипционной промоторной и терминирующей последователностей; число копий клонированного гена; ограничен ли данный ген плазмидой или он интегрирован в геном клетки-хозяина; конечную клеточною локацию данного синтезированного постороннего протеина; эффективность трансляции и корректной укладки данного протеина в организме хозяина; внутреннюю устойчивость мРНК и протеина клонированного гена в клетке-хозяине; и использование кодона в клонированном гене, так что его частота приближается к частоте предпочтительного использования кодона клетки-хозяина. Каждый тип модификации входит в объем данного изобретения как средство для дальнейшей оптимизации экспрессии ДГК синтаз, описанных в данной заявке.

Трансформация микробных клеток-хозяев

Когда кассета, которая подходит для экспрессии в соответствующей клетке-хозяине, получена (например, химерный ген, который включает промотор, ОРС и терминатор), она помещается в плазмидный вектор, способный к автономной репликации в клетке-хозяине, или прямо интегрируется в геном клетки-хозяина. Интеграция экспрессирующих кассет может происходить случайным образом в геноме хозяина или может направляться путем использования конструкций, которые содержат участки гомологии с геномом хозяина, достаточные для правильного нацеливания рекомбинации внутри хозяйского локуса. Там, где конструкцияы нацелены на эндогенный локус, все или некоторые из транскрипционных и трансляционных регуляторных участков могут быть снабжены эндогенным локусом.

Когда два или более гена экспрессированы из разных репликационных векторов, желательно, чтобы каждый вектор имел различные средства селекции, и он не должен обладать гомологией с другим конструкцияом(ами) для сохранения стабильной экспрессии и предотвращения пересортировки элементов среди конструкций. Разумный выбор регуляторных участков, средств селекции и способа пропагации введенной конструкции(ий) могут быть экспериментально определены, так что все введенные гены экспрессированы на необходимых уровнях, обеспечивая синтез желательных продуктов.

Конструкционные элементы, содержащие необходимый ген(ы), могут быть введены в микробную клетку-хозяина с помощью любых стандартных способов. Эти способы включают трансформацию (например, литий ацетатную трансформацию [Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)]), протопластное слияние, баллистический удар, электропорацию, микроинъекцию или любой другой способ, с помощью которого нужный ген(ы) вводится в клетку-хозяина.

Для удобства, на клетку-хозяина, с которой проводились манипуляции с применением любого метода для поглощения ДНК последовательности (например, экспрессирующая кассета), будем в данной заявке ссылаться как на "трансформированную" или "рекомбинантную". Трансформированный хозяин будет иметь по меньшей мере одну копию экспрессирующей конструкции и может иметь две или больше, в зависимости от того, интегрирована ли экспрессирующая кассета в геном или присутствует на экстрахромосомном элементе, имеющем множественное число копий.

Трансформированная клетка-хозяин может быть идентифицирована посредством различных методов селекции, как описано в патентах США № № 7238482 и 7259255, и PCT публикации № WO 2006/052870.

После трансформации субстраты, подходящие для данных ДНК синтаз (и, при необходимости, других ПНЖК ферментов, которые коэкспрессированы в клетке-хозяине), могут вырабатываться хозяином или природным путем или трансгенно, или могут вводиться экзогенным образом.

Предпочтительные микробные хозяева для рекомбинантной экспрессии

Клетки микробных хозяев для экспрессии текущих генов и фрагментов нуклеиновых кислот могут включать хозяев, которые растут на разном исходном сырье, включая простые или сложные углеводы, жирные кислоты, органические кислоты, масла и спирты, и/или углеводороды, в широкой области температур и значений pH. Исходя из потребностей правопреемника заявителя, гены, описанные в данном изобретении, будут экспрессироваться в жировых дрожжах (и, в частности, Yarrowia lipolytica); однако предполагается, что поскольку транскрипция, трансляция и аппарат для биосинтеза протеинов сильно законсервированы, любые бактерии, дрожжи, водоросли, эвгленоиды и/или грибки будут подходящими микробными хозяевами для экспрессии рассматриваеиых нуклеиновокислотных фрагментов.

Однако предпочтительными микробными хозяевами являются маслянистые организмы, такие как жировые дрожжи. Эти организмы способны природным путем синтезировать и накапливать масла, где данное масло может составлять более приблизительно 25% сухого веса клетки, лучше, больше приблизительно 30% сухого веса клетки, и еще лучше, больше приблизительно 40% сухого веса клетки. Роды, которые обычно идентифицируются как жировые дрожжи, включают, однако не ограничиваясь этим: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon и Lipomyces. Более конкретно, иллюстративные синтезирующие масло дрожжи включают: Rhodosporidium toruloides, Lipomyces starkeyii, L. lipoferus, Candida revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utilis, Trichosporon pullans, T. cutaneum, Rhodotorula glutinus, R. graminis, и Yarrowia lipolytica (ранее классифицированная как Candida lipolytica).

Наиболее предпочтительными являются жировые дрожжи Yarrowia lipolytica; и, в дальнейшем варианте наиболее предпочтительными являются штаммы Y. Lipolytica, обозначенные как ATCC #20362, ATCC #8862, ATCC #18944, ATCC #76982 и/или LGAM S(7)1 (Papanikolaou S., и Aggelis G., Bioresour. Technol. 82(1):43-9 (2002)).

В историческом плане, различные штаммы Y. lipolytica использовались для получения и производства: изоцитратлиазы; липаз; полигидроксиалканоатов; лимонной кислоты; эритритола; 2-оксоглутаровой кислоты; гамма-декалактона; гамма-додекалатона; и пировиноградной кислоты. Конкретные пособия, применимые для трансформации жировых дрожжей (т.е. Yarrowia lipolytica), включают патент США № 4880741 и патент США № 5071764 и Chen, D. C. et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 48(2):232-235 (1997)). Конкретными пособиями, подходящими для получения методами генной инженерии АРК, ЭПК и ДГК в Y. lipolytica,являются патентная заявка США № 11/264784 (PCT публикация No. WO 2006/055322), патентная заяска США № 11/265761 (PCT публикация No. WO 2006/052870) и патентная заявка США № 11/264737 (PCT публикация No. WO 2006/052871), соответственно.

Средства для синтеза и трансформации экспрессирующих векторов, содержащих C20-элонгазы и дельта-4-десатуразы, в жировых дрожжах (т.е. Yarrowia lipolytica), подробно рассмотрены в PCT публикации № WO 2006/052871. Предпочтительным методом экспрессии генов в Yarrowia lipolytica является интеграция линейной ДНК в геном хозяина. Интеграция в множественные локации внутри генома может быть особенно полезной, когда желательны высокие уровни экспрессии генов [например, в Ura3 локус (номер доступа GenBank AJ306421), Leu2 генный локус (номер доступа GenBank AF260230), Lys5 генный локус (номер доступа GenBank M34929), Aco2 генный локус (номер доступа GenBank AJ001300), Pox3 генный локус (Pox3: номер доступа GenBank XP_503244; или, Aco3: номер доступа GenBank AJ001301), дельта-12-десатуразный генный локус (патент США № 7214491), Lip1 генный локус (номер доступа GenBank Z50020), Lip2 генный локус (номер доступа GenBank AJ012632), и/или Pex10 генный локус (номер доступа GenBank CAG81606)].

Терминирующие участки, полезные в настоящей заявке для Yarrowia экспрессирующих векторов, включают, например: ~100 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участка Yarrowia lipolytica экстрацеллюларной протеазы (XPR; номер доступа GenBank M17741); ацил-CoA оксидазные (Aco3: номер доступа GenBank AJ001301 и No. CAA04661; Pox3: номер доступа GenBank XP_503244) терминаторы; Pex20 (номер доступа GenBank AF054613) терминатор; Pex16 (номер доступа GenBank U75433) терминатор; Lip1 (номер доступа GenBank Z50020) терминатор; Lip2 (номер доступа GenBank AJ012632) терминатор; и 3-оксацил-CoA тиолазный (OCT; номер доступа GenBank X69988) терминатор.

Предпочтительными методами селекции для использования в Yarrowia lipolytica являются резистентность к канамицину, гигромицину и аминогликозиду G418, так же как и способность расти на средах, лишенных урацила, лейцина, лизина, триптофана или гистидина. В альтернативных вариантах для селекции дрожжевых Ura- мутантов используется 5-фторооротовая кислота (5-фтороурацил-6-карбоновая кислота, моногидрат; мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 5-FOAмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ). Данное соединение является токсичным к дрожжевым клеткам, которые обладают функционирующим URA3 геном, кодирующим оротидин 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 -монофосфат декарбоксилазу (ОМД декарбоксилазу); таким образом, на основе этой токсичности 5-FOA особенно полезна для селекции и идентификации Ura- мутантных дрожжевых штаммов (Bartel, P.L. и Fields, S., Двухгибридная система дрожжей, Оксфордский университет: Нью-Йорк, т. 7, стр. 109-147, 1997; см. также PCT публикацию № WO 2006/052870 для использования 5-FOA в Yarrowia). Более конкретно, сначала необходимо выбить нативный Ura3 ген для получения штамма, имеющего Ura- фенотип, где происходит селекция, основанная на 5-FOA резистентности. Затем кластер из множества химерных генов и новый Ura3 ген могут быть интегрированы в другой локус генома Yarrowia с образованием нового штамма, имеющего Ura+ фенотип. Последующая интеграция продуцирует новый Ura3- штамм (вновь идентифицируемый с использованием 5-FOA селекции), когда введенный Ura3 ген выбит. Таким образом, Ura3 ген (в комбинации с селекцией 5-FOA) может быть использован в качестве селекционного маркера в множественных раундах трансформации, позволяя легко интегрировать генетические модификации в Yarrowia геном.

Другие предпочтительные микробные хозяева включают маслянистые бактерии, водоросли, эвгленоиды и другие грибки; и, внутри этой широкой группы микробных хозяев особый интерес представляют микроорганизмы, которые синтезируют омега-3/омега-6 жирные кислоты (или те, что могут с помощью генетических методов послужить этой цели [например, другие дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae]). Так, например, трансформация Mortierella alpina (которая используется в промышленности для производства АРК) с помощью любой из текущих ДГК синтазных генов под контролем индуцируемых или регулируемых промоторов может дать трансформантный организм, способный синтезировать повышенные количества ПНЖК. Способ трансформации M. alpina описан Mackenzie et al. (Appl. Environ. Microbiol., 66:4655 (2000)). Подобно этому, методы трансформации микроорганизмов Thraustochytriales раскрыты в патенте США № 7001772.

Может потребоваться подпитка субстрата.

Независимо от хозяина, выбранного для экспрессии мультизимов (например, ДГК синтаз), множественные трансформанты должны быть подвергнуты скринингу для получения штамма, проявляющего необходимый уровень экспрессии и структуру. Такой скрининг может быть проведен методом саузерн анализа ДНК блотов (Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975)), нозерн анализа мРНК экспрессии (Kroczek, J. Chromatogr. Biomed. Appl., 618(1-2):133-145 (1993)), вестерн и/или Elisa анализов протеиновой экспрессии, фенотипического анализа или ГХ анализа ПНЖК продуктов.

Конечно, поскольку вырабатываемые природным путем ПНЖК в жировых дрожжах ограничиваются 18:2 жирными кислотами (т.е. ЛК), и не так часто 18:3 жирными кислотами (т.е. АЛК), в более предпочтительных вариантах настоящего изобретения жировые дрожжи будут подвергаться генетической обработке для экспрессии множества ферментов, необходимых для биосинтеза длинноцепочечных ПНЖК (обеспечивая тем самым производство, например, АРК, ЭПК, ДПК и ДГК, в дополнение к описанным здесь мультизимам.

В особо предпочтительных вариантах по меньшей мере один дополнительный рекомбинантный ДНК конструкция кодирует ДГЛК синтазу, так что данный мультизим обладает активностью дельта-9-элонгазы и активностью дельта-8-десатуразы. В некоторых вариантах дельта-9-элонгаза может быть изолирована или получена из Isochrysis galbana (номер доступа GenBank AF390174; IgD9e или IgD9eS), или же дельта-9-элонгаза может быть изолирована или получена из Euglena gracilis или Euglena anabaena. Например, см. ДГЛК синтазы, представленные как SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:454, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:464 и SEQ ID NO:471.

Метаболический инжениринг омега-3 и/или омега-6 жирнокислотного биосинтеза в микробах

Способы манипуляции биохимическими путями хорошо известны специалистам в данной области; и ожидается, что будет возможно проводить множественныемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 манипуляции для максимизации биосинтеза омега-3 и/или омега-6 жирных кислот в жировых дрожжах, и в частности, в Yarrowia lipolytica. Это может потребовать метаболического инжениринга непосредственно внутри ПНЖК биосинтетического пути или дополнительных манипуляций путями, которые вносят углерод в ПНЖК биосинтетический путь. Методы, полезные для повышения уровня регуляции желательных биохимических путей и понижения уровня регуляции нежелательных биохимических путей, хорошо известны специалистам в данной области.

Например, биохимические пути, конкурирующие с омега-3 и/или омега-6 жирнокислотными биосинтетическими путями в отношении энергии углерода или нативных ферментов ПНЖК биосинтетического пути, которые мешают выработке конкретного ПНЖК конечного продукта, могут быть элиминированы путем разрыва гена или понижения уровня регуляции с помощью других средств (например, антисмысловой мРНК).

Подробное обсуждение манипуляций внутри ПНЖК биосинтетического пути как средства для увеличения выхода АРК, ЭПК или ДГК (и связанных с этим методов) представлено в PCT публикации № WO 2006/055322 [патентная публикация США № 2006-0094092-A1], PCT публикации № WO 2006/052870 [патентная публикация США № 2006-0115881-A1] и PCT публикации № WO 2006/052871 [патентная публикация США № 2006-0110806-A1], соответственно, как и необходимых манипуляций на ТАГ биосинтетическом пути и ТАГ деградационном пути (и связанных с этим методов).

В контексте настоящего изобретения может быть полезным модулировать экспрессию жирнокислотного биосинтетического пути с привлечением любой из стратегий, описанных выше. Например, настоящее изобретение предоставляет методы, посредством которых гены, кодирующие ключевые ферменты ПНЖК биосинтетического пути, вводятся в жировые дрожжи для производства омега-3 и/или омега-6 жирных кислот. Особенно полезным будет экспрессировать текущие ДГК синтазные гены в жировые дрожжи, которые не обладают природными омега-3 и/или омега-6 жирнокислотными биосинтетическими путями, и скоординировать экспрессию этих генов для максимизации производства предпочтительных ПНЖК продуктов с использованием различных средств для метаболического инжениринга хозяйского организма.

Микробные ферментационные процессы для производстап ПНЖК

Трансформированная клетка хозяина выращивается при условиях, которые оптимизируют экспрессию химерных генов и дают наибольший и самый экономичный выход ПНЖК, которым отдается предпочтение. В общем, условия среды, которые могут быть оптимизированы, включают тип и количество углеродного источника, тип и количество азотного источника, отношение углерод-азот, количество различных минеральных ионов, уровень кислорода, температуру выращивания, рН, продолжительность фазы производства биомассы, продолжительность фазы накопления масла и время и метод сбора клеток. Yarrowia lipolytica обычно выращиваются в комплексных средах (например, дрожжевой экстракт-пептон-декстрозный бульон (ДПД)) или определенных минимальных средах, в которых отсутствует компонент, необходимый для роста, вынуждая поэтому проводить селекцию необходимых экспрессирующих кассет (например, Yeast Nitrogen Base (Difco Laboratories, Detroit, Ml)).

Ферментационные среды в данном изобретении должны содержать подходящий источник углерода. Пригодные углеродные источники обсуждены в патенте США № 7238482. Хотя предполагается, что источник углерода, использованный в данном изобретении, может охватывать широкое разнообразие источников, которые содержат углерод, источниками углерода, которым отдается предпочтение, являются сахара, глицерин и/или жирные кислоты. Наибольшее предпочтение отдается глюкозе и/или жирным кислотам, которые содержат 10-22 углеродных атомов.

Азот может поставляться из неорганического (например, (NH4 )2SO4) или органического (например, мочевина или глутамин) источника. В дополнение к углеродному и азотному источникам ферментационные среды должны также содержать подходящие минералы, соли, кофакторы, буферы, витамины и другие компоненты, известные специалистам в данной области, пригодные для выращивания маслянистого хозяина и промотирования ферментационных путей, необходимых для производства ПНЖК. Особенное внимание уделяется нескольким металлическим ионам (например, Fe+2, Cu +2, Mn+2, Co+2, Zn+2, Mg+2), которые промотируют синтез липидов и ПНЖК (Nakahara, T. et al., Ind. Appl. Single Cell Oils, авторы D.J. Kyle и R. Colin, стр. 61-97 (1992)).

Ростовыми средами, которым в данном изобретении отдается предпочтение, являются обычные, приготовляемые в промышленности среды, такие как Yeast Nitrogen Base (Difco Laboratoties, Detroit, Ml). Могут также использоваться и другие определенные или синтетические ростовые среды, и соответствующая среда для выращивания трансформантных клеток-хозяев должна быть известна специалистам в области микробиологии или ферментации. Подходящая область рН для ферментации составляет, обычно, 4,0-8,0, где области рН 5,5-7,5 отдается предпочтение как области условий для первичного роста. Ферментация может проводиться в аэробных или анаэробных условиях, где предпочтение отдается микроаэробным условиям.

Типично, накопление высоких уровней ПНЖК в клетках жировых дрожжей требует двухстадийного процесса, поскольку метаболическое состояние должно мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 балансироватьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 между ростом и синтезом/сохранением жиров. Таким образом, лучше всего, когда для производства ПНЖК в жировых дрожжах (например, Yarrowia lipolytica) используется двухстадийный ферментационный процесс. Этот подход описан в патенте США № 7238482, так же, как и разные приемлемые схемы ферментационного процесса (например, порционная, с подпиткой и непрерывная) и соображения относительно роста.

Очистка и обработка ПНЖК масел

ПНЖК могут быть найдены в микроорганизмах-хозяевах и растениях-хозяевах в виде свободных жирных кислот или в этерифицированных формах, таких как ацилглицерины, фосфолипиды, сульфолипиды или гликолипиды, и могут быть экстрагированы из клеток-хозяев с использованием множества средств, хорошо известных в данной области. Одним из обзоров способов экстракции, анализа качества и стандартов пригодности для дрожжевых липидов является обзор Z. Jacobs (Critical Reviews in Biotechnology, 12(5/6):463-491 (1992)). Краткий обзор нижнего процессинга имеется также в работе A. Singh и O. Ward (Adv. Appl. Microbiol., 45:271-312 (1997)).

В целом, средства для очистки ПНЖК могут включать экстракцию (например, патент США № 6797303 и патент США № 5648564) органическими растворителями, обработку ультразвуком, экстракцию флюидом в сверхкритическом состоянии (например, с использованием диоксида углерода), омыление и физические средства, такие как прессование или их комбинации. Дополнительные подробности можно найти в патенте США № 7238482. Способы выделения масел из семян хорошо известны в данной области: (Young et al., Обработка масел и жиров, Руководство по липидам авторы, Gunstone et al., глава, Chapter 5 стр. 253-257; Chapman и Hall: Лондон (1994)). Например, соевое масло вырабатывается с использованием ряда шагов, включая экстракцию и очистку пищевого масляного продукта из маслянистых семян. Соевые масла и соевые побочные продукты производятся с использованием обобщенных шагов, представленных в Таблице 7.

ТАБЛИЦА 7

Обобщенные шаги для производства соевого масла и его побочных продуктов
Шаг процесса ПроцессУдаленные примеси и/или полученные побочные продукты
# 1 Соевые семенамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
# 2 Экстракция маслаМука
# 3Обессмоливание Лецитин
# 4 Щелочное или физическое рафинированиеСмолы, свободные жирные кислоты, пигменты
# 5Водная промывка Мыло
# 6 ОтбеливаниеКолер, мыло, металл
# 7(гидрирование) мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608
# 8 (фракционирование охлаждением)Стеарин
# 9Дезодорирование Свободные жирные кислоты, токоферолы, стерины, летучие вещества
# 10 Масляные продуктымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608

Более конкретно, семена сои подвергаются очистке, темперированию, лущению и вальцеванию, повышая таким способом эффективность экстракции масла. Экстракция масла обычно осуществляется растворителем (например, гексаном), но может также достигаться с помощью комбинации физического давления и/или экстракции растворителем. Результирующее масло называется сырым маслом. Сырое масло может быть обессмолено путем гидрирования фосфолипидов и других полярных и нейтральных липидных комплексов, что облегчает их отделение от триглицеридной фракции, которая не гидрируется (соевое масло). Результирующие лецитиновые смолы могут дополнительно обрабатываться для приготовления коммерционно важных лецитиновых продуктов, которые используются в различных пищевых и промышленных продуктах, таких как эмульсификаторы и вещества, которые предупреждают слипание. Обессмоленное масло потом может подвергаться рафинированию для удаления примесей (главным образом, жирных кислот, пигментов и остаточных смол). Рафинирование проводится путем добавления каустического агента, который реагирует со свободной жирной кислотой с образованием мыла и гидратов фосфатидов и протеинов в сыром масле. Вода используется для вымывания следов мыла, которые образовались в процессе рафинирования. Побочный мыльный продукт может использоваться непосредственно в животных кормах или может подвергаться подкислению для восстановления свободных жирных кислот. От окраски избавляются путем адсорбции отбеливающей землей, которая удаляет большую часть хлорофилла и каротиновых соединений. Рафинированное масло может быть гидрировано, с образованием, в результате, жиров с разными свойствами плавления и текстурами. Фракционирование охлаждением может быть использовано для удаления стеарина из гидрированного масла путем кристаллизации при тщательно контролируемых условиях охлаждения. Дезодорирование (главным образом, путем паровой дистилляции в вакууме) является последним шагом и предназначено для удаления соединений, которые придают запах или аромат маслу. Другие ценные побочные продукты, такие как токоферолы и стерины, могут быть удалены во время процесса дезодорирования. Дезодорированный дистиллят, который содержит эти побочные продукты, может быть продан для производства натурального витамина Е и других высокоценных фармацевтических продуктов. Рафинированные, отбеленные (гидрированные, фракционированные) и дезодорированные масла и жиры могут упаковываться и прямо продаваться или дополнительно перерабатываться в более специализированные продукты. Более подробная ссылка на обработку соевых семян, производство соевого масла и использование побочных продуктов может быть найдена в работе Erickson, Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization, The American Oil Chemistsмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Society and United Soybean Board (1995). Соевое масло является жидким при комнатной температуре, поскольку оно имеет относительно низкое содержание насыщенных жирных кислот в сравнении с маслами, такими как кокосовое, пальмовое и какао.

Растительные и микробные масла, которые содержат ПНЖК, которые были рафинированы и/или очищены, могут быть подвергнуты гидрированию, давая в результате жиры с разными свойствами плавления и структурами. Многие переработанные жиры (включая спреды, кондитерские жиры, твердые масла, маргарины, хлебопекарные жиры и т.д.) требуют разных степеней твердости при комнатной температуре и могут вырабатываться только путем изменения физических свойств исходного масла. В наиболее общем случае это достигается путем каталитического гидрирования.

Гидрирование представляет собой химическую реакцию, в которой водород доставляется к двойным связям ненасыщенной жирной кислоты с помощью катализатора, такого как никель. Например, высокоолеиновое соевое масло содержит ненасыщенную олеиновую, ЛК и линоленовую жирные кислоты, и каждая из них может гидрироваться. Гидрирование имеет два главных эффекта. Во-первых, окислительная стойкость масла повышается в результате восстановления ненасыщенных жирных кислот. Во-вторых, физические свойства масла изменяются, поскольку жирнокислотные модификации повышают точку плавления, что дает полутвердый или твердый жир при комнатной температуре.

Существует много переменных, которые влияют на реакцию гидрирования, что в свою очередь изменяет состав конечного продукта. Рабочие условия, которые включают давление, температуру, тип катализатора и концентрацию, перемешивание и конструкцию реактора, находятся среди наиболее важных параметров, которые могут контролироваться. Условия селективного гидрирования могут быть использованы для гидрирования более насыщенных жирных кислот в сравнении с менее насыщенными кислотами. Очень легкое или щеточное гидрирование часто используется для повышения стабильности жидких масел. Дальнейшее гидрирование превращает жидкое масло в физически твердый жир. Степень гидрирования зависит от необходимой производительности и характеристик плавления, которые предполагаются для конечного продукта. Жидкие шортенинги (которые используются в производстве хлебопекарских продуктов, твердых жиров и шортенингов, применяемых для операций жарки и обжаривания в торговле) и основное сырье для производства маргарина находятся среди огромного множества возможных масляных и жировых продуктов, которые получаются путем гидрирования. Более детальное описание гидрирования и продуктов гидрирования можно найти в работе Patterson, H.B.W., Hydrogenation of Fats and Oils: Theory and Practice. The American Oil Chemistsмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Society (1994).

Гидрированные масла стали в некоторой степени сомнительными в плане употребления из-за присутствия транс-жирнокислотных изомеров, которые возникают в результате процесса гидрирования. Употребление больших количеств транс-изомеров связывается с вредными для здоровья эффектами, включая повышенные отношения липопротеинов низкой плотности к липопротеинам высокой плотности в плазме крови и повышенный риск коронарной болезни сердца).

Масла, содержащие ПНЖК, для использования в пищевых продуктах, продуктах здорового питания и животных кормах

В настоящее время рынок поддерживает значительное разнообразие продуктов питания, которые включает омега-3 и/или омега-6 жирные кислоты (в частности, АЛК, ГЛК, АРК, ЭПК, ДПК и ДГК). Предполагается, что растительные/семенные масла, измененные семена и микробная биомасса и/или масла данного изобретения, которые содержат ПНЖК, будут действовать в пище и пищевых продуктах с пользой для здоровья. По сравнению с другими растительными маслами, масла данного изобретения, как представляется, действуют подобно другим маслам в пищевых приложениях с физической точки зрения (например, частично гидрированные масла, такие как соевое масло, широко применяются как ингредиенты для мягких спреев, маргарина и шортенингов для выпекания и жарки).

Растительные/семенные масла и измененные семенные масла, которые содержат омега-3 и/или омега-6 жирные кислоты, как тут описано, будут пригодны для употребления в различной пище и пищевых продуктах, включая, однако не ограничиваясь этим, пищевые аналоги, мясные продукты, крупяные продукты, мучные продукты, закуски и молочные продукты.

Кроме того, растительные/семенные масла, измененные семенные масла и микробная биомасса, и/или масла могут быть использованы в препаратах, которые действуют с пользой для здоровья в лечебном питании, включая медицинское питание, пищевые добавки, детские смеси, так же как и фармацевтические продукты. Специалисту в области обработки пищевых продуктов и составления пищевых рационов понятно, каким образом и в каком количестве и качестве к еде или пищевому продукту могут быть добавлены растительные и микробные масла данного изобретения. На такое количество будем здесь ссылаться как на мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 эффективноемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 количество, и оно будет зависеть от конкретной пищи или пищевого продукта, диеты, которую должен дополнять данный продукт, или медицинского состояния, которое предролагается скорректировать или вылечить с помощью медицинского питания.

Пищевые аналоги могут быть изготовлены с использованием способов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Здесь можно отметить мясные аналоги, сырные аналоги, молочные аналоги и такое подобное. Мясные аналоги, изготовленные из сои, содержат соевый белок или тофу и другие инградиенты, смешанные для симуляции разных видов мяса. Эти мясные альтернативы продаются как замороженные, консервированные или высушенные пищевые продукты. Обычно, они могут быть использованы тем самым способом, что и пища, которую они заменяют. Мясные альтернативы, изготовленные из сои, служат прекрасными источниками протеина, железа и витаминов В. Примеры мясных аналогов включают, однако не ограничиваясь этим, аналоги ветчины, колбасные аналоги, аналоги бекона и такое подобное.

Пищевые аналоги могут быть классифицированы как имитация или заменители, в зависимости от их функциональных и составных характеристик. Например, имитационный сыр должен лишь походить на сыр, который он должен заменять. Однако, продукт может, в общем, называться заменителем сыра, только если он является пищевым эквивалентом сыра, который он заменяет и удовлетворяет минимумум требований по составу для этого сыра. Таким образом, заменитель сыра часто имеет более высокие уровни протеина, чем имитационные сыры, и должен быть подкреплен витаминами и минералами.

Молочные аналоги или немолочные пищевые продукты включают, однако не ограничиваясь этим, имитационное молоко и немолочные замороженные десерты (например, изготовленные из сои и/или соевого белка).

Мясные продукты охватывают широкое разнообразие продуктов. В США мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мясомультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 включает мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 красное мясомультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , полученное из крупного рогатого скота, свиней и овец. В дополнение к красному мясу имеются изделия из птицы, которые включают цыплят, индюков, гусей, рябчиков, уток и рыбу и моллюсков. Имеется широкий ассортимент высушенных и переработанных мясных продуктов: свежих, вяленых и обжареных, и вяленых и выпеченных. Колбаса и хотдоги служат примерами переработанных мясных продуктов. Таким образом, термин мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мясные продуктымультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , как здесь используется, включает, однако не ограничиваясь этим, переработанные мясные продукты.

Крупяной пищевой продукт представляет собой пищевой продукт, полученный в результате переработки крупяного зерна. Крупяное зерно касается любого растения из семейства трав, которое дает съедобное зерно (семечки). Наиболее популярными являются ячмень, кукуруза, просо, овес, киноа, рис, рожь, сорго, тритикале, пшеница и канадский рис. Примеры крупяных продуктов включают, однако не ограничиваясь этим: целое зерно, измельченное зерно, крупу грубого помола, муку, высевки, семечки, хлопья для завтрака, экструдированные пищевые продукты, пасты и таму подобное.

Выпеченные продукты включают любой из крупяных продуктов, упомянутый выше, который был выпечен или переработан с помощью способа, подобного выпечке (например, подверженный действию тепла для высушивания и твердения). Примеры выпеченных продуктов включают, однако не ограничиваясь этим: хлеб, пироги, пончики, палочки, пасты, хлебное крошево, вареные закуски, мини-бисквиты, мини-крекеры, мини-булочки и мини-крендели. Как отмечалось выше, масла настоящего изобретения могут быть использованы в качестве ингредиента.

Закусочные пищевые продукты содержат любой из описанных выше или ниже пищевых продуктов.

Жареный пищевой продукт включает любой из описанных выше или ниже пищевых продуктов, который был поджарен.

Продукт здорового питания представляет собой любой пищевой продукт, который благотворно влияет на здоровье. Многие из пищевых продуктов, которые получены из маслянистых семян, могут считаться продуктами здорового питания.

Напиток может быть в жидкой или сухой порошковой форме.

Например, здесь можно упомянуть негазированные напитки, такие как фруктовые соки, свежие, замороженные, консервированные или концентраты; ароматизированные или простые молочные напитки и т.д. Питательные смеси для детей и взрослых хорошо известны в данной области и имеются в продаже (например, Similac®, Ensure®, Jevity® и Alimentum® от фирмы Ross Products Division, Abbott Laboratories).

Детские смеси являются жидкостями или восстановленными порошками, которыми кормят младенцев или маленьких детей. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Детская смесьмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 определена здесь как энтеральный пищевой продукт, которым можно заменить грудное молоко человека при кормлении младенцев и которая обычно состоит из необходимого процента жира, смешанного с необходимым процентом углеводов и белков в водном растворе (например, см. патент США № 4670285). Основываясь на мировых исследованиях состава и на уровнях, определенных экспертными группами, усредненное грудное молоко человека, типично, содержит приблизительно 0,20-0,40% совокупных жирных кислот (в допущении приблизительно 50% калорий из жира); и, в целом, отношение ДГК к АРК варьирует от приблизительно 1:1 до 1:2 (см., например, рецепты Enfamil LIPILмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 (Mead Johnson & Company) и Similac Advanceмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 (Ross Products Division, Abbott Laboratories)). Детские смеси должны играть специальную роль в детских диетах, поскольку они часто являются единственным источником питания для детей; и, хотя кормление грудью остается наилучшим способом кормления детей, детская смесь является важным компонентом не только для выживания, но и развития детей.

Молочный продукт является продуктом, полученным из молока. Аналог молока или немолочный продукт получается из источника, иного, чем молоко, например, соевого молока, как обсуждалось выше. Такие продукты включают, однако не ограничиваясь этим, несобранное молоко, собранное молоко, продукты из сброженного молока, такие как йогурт или кислое молоко, сливки, масло, сгущенное молоко, обезвоженное молоко, порошковый молочный заменитель для кофе, порошковый сливочный заменитель для кофе, мороженное, сыр и т.д.

Дополнительными пищевыми продуктами, в которые могут включаться масла данного изобретения, которые содержат ПНЖК, являются, например, жевательные резинки, конфеты и сахарная глазурь, желатины и пудинги, твердые и мягкие леденцы, джемы и желе, белый сахар-песок, заменители сахара, сладкие пюре, десерты и сиропы, и смешанные в сухом состоянии порошковые смеси.

Продуктом здорового питания является любой пищевой продукт, который оказывает благотворное влияние на здоровье человека и включает функциональную пищу, медицинскую пищу, лечебное питание и диетические добавки. Кроме того, растительные/семенные масла, измененные семена и микробные масла данного изобретения могут быть использованы в стандартных фармацевтических композициях (например, длинноцепочечные ПНЖК, которые содержат масла, могли бы быть легко введены в любой из упомянутых выше пищевых продуктов, образуя таким способом функциональную или медицинскую пищу). Более концентрированные препараты, которые содержат ПНЖК, включают капсулы, порошки, таблетки, мягкие гели, гелевые колпачки, жидкие концентраты и эмульсии, которые могут быть использованы как диетические добавки к питанию людей или животных.

Животный корм определяется здесь, в целом, как продукты, предназначенные для использования в виде корма или для смешивания с кормом для животных. Растительные/семенные масла, измененые семена и микробные масла данного изобретения могут использоваться как ингредиент в различных животных кормах.

Более конкретно, однако без каких-либо ограничений, ожидается, что масла настоящего изобретения могут использоваться в кормах для домашних животных, жвачных животных, птицы и аквакультур. Кормами для домашних животных служат те продукты, которые предназначены для кормления домашних любимцев (например, собак, котов, птиц, рептилий, грызунов). Эти корма могут включать крупяные продукты и продукты здорового питания, упомянутые выше, так же как и мясо и мясные побочные продукты, продукты из соевого белка, травяные продукты и продукты из сена (например, люцерна, тимофеевка луговая, овес или костер (Bromus), овощи). Корма для жвачных животных и птицы являются теми, которые предназначены для кормления этих животных (например, индюков, цыплят, крупного рогатого скота, свиней). Как и в случае кормов для домашних любимцев, эти корма могут включать крупяные продукты и продукты здорового питания, продукты из соевого белка, мясо и мясные побочные продукты, и травяные продукты, и продукты из сена, как перечислено выше. Корма для аквакультур (или мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 аквакормамультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) являются кормами, которые предназначены для использования на аквафермах для разведення, культивирования или выращивания водных организмов и/или животных в пресной или морской водах.

ПРИМЕРЫ

Данное изобретение дополнительно определяется в следующих Примерах, где части и проценты являются весовыми, и температура приведена в градусах Цельсия, если не указано иное. Следует понимать, что эти Примеры, хотя они относятся к вариантам данного изобретения, которым отдается предпочтение, приведены лишь как иллюстрации. Исходя из приведенного выше обсуждения и этих Примеров, специалист в данной области сможет уяснить существенные особенности данного изобретения, и не отклоняясь от сути и объема изобретения, сможет сделать разные изменения и модификации изобретения с целью его адаптации к разным применениям и условиям. Так, разные модификации данного изобретения, в добавление к показанным и описанным здесь, будут очевидными для специалистов в данной области из предыдущего описания. Такие модификации также, как представляется, подпадают под объем пунктов формулы изобретения, которая прилагается.

Значения сокращений следующие: мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 secмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает секундам (с), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 minмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает минуте(ам), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 hмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает часу(ам), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 dмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает суткам, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 µlмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает микролитру(ам), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 mLмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает миллилитру(ам), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Lмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает литру(ам), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 µМмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает микромолярной (концентрации), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 mMмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает миллимолярной, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Ммультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает молярной, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 mmolмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает миллимольному (количеству), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 µmolмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает микромольной, мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 gмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает грамму(ам), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 µgмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает микрограмму(ам), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ngмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает нанограмму(ам), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Uмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает единице(ам), мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 bpмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает основной паре(ам) и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 kBмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 отвечает тысяче пар (нуклеотидов).

ОБЩИЕ МЕТОДЫ:

Номенклатура для экспрессирующих кассет:

Структура экспрессирующей кассеты будет представлена простой системой обозначений мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 X::Y::Zмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , где X описывает промоторный фрагмент, Y описывает фрагмент участка, кодирующего ген, и Z описывает терминирующий фрагмент, которые связаны между собой действующим образом.

Трансформация и культивирование Yarrowia lipolytica:

Штаммы Yarrowia lipolytica с номерами доступа ATCC 20362, 76982 и 90812 приобретали на фирме American Type Culture Collection (Rockville, MD) (АСТК - Американское собрание типовых культур) Штаммы Yarrowia lipolytica выращивали, типично, при 28-30 оС в нескольких средах, в соответствии с рецептами, приведенными ниже. Агаровые пластинки готовили путем добавления 20 г/л агара в каждую жидкую среду, в соответствии со стандартной методологией.

YPD агаровая среда (на литр): 10 г дрожжевого экстракта [Difco], 20 г of Bacto пептона[Difco]; и 20 г глюкозы.

Базальная минимальная среда (МС) (на литр): 20 г глюкозы; 1,7 г дрожжевой азотной основы без аминокислот; 1,0 г пролина; и pH 6,1 (не скорректирован).

Минимальная среда+урацил (МС+урацил или МСУ (на литр): Приготовить МС среду как выше и добавить 0,1 г урацила и 0,1 г уридина.

Минимальная среда+урацил+сульфонилмочевина (МСУ+СМ) (на литр): Приготовить МСУ среду как выше и добавить 280 мг сульфонилмочевины.

Минимальная среда+лейцин (МС+лейцин или MCLeu) (на литр): Приготовить МС среду как выше и добавить 0,1 г лейцина.

Минимальная среда+лейцин+урацил (MCLeuUra) (на литр): Приготовить МС среду как выше и добавить 0,1 г лейцина, 0,1 г урацила и 0,1 г уридина.

Минимальная среда+лейцин+лизин (MCLeuLys) (на литр): Приготовить МС как выше и добавить 0,1 г лизина, 0,1 г лейцина.

Минимальная среда+5-фторооротовая кислота (МС+5-FOA) (на литр): 20 г глюкозы, 6,7 г Yeast Nitrogen основания, 75 мг урацила, 75 мг уридина и соответствующее количество FOA (Zymo Research Corp., Orange, CA), исходя из тестирования FOA активности в области концентраций от 100 мг/л до 1000 мг/л (поскольку для каждой порции, полученной от поставщика, отмечается расхождение).

Среда с высоким содержанием глюкозы (HGM) (на литр): 80 г глюкозы, 2,58 г KH2PO4 и 5,36 г K 2HPO4, pH 7,5 (корректировка не требуется).

Трансформация Yarrowia lipolytica проводилась в соответствии с методом Chen, D.C. et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 48(2):232-235 (1997)), если не указано иное. В кратком изложении, Yarrowia наносили штрихами на YPD пластинку и выращивали при 30°С на протяжении приблизительно 18 часов. Несколько больших петель клеток соскребали с пластинки и повторно суспендировали в 1 мл трансформационного буфера, котрый содержал 2,25 мл 50% PEG, средний МВ 3350; 0,125 мл 2М ацетата лития, рН 6,0; 0,125 мл 2М DTT; и 50 мкг гидродинамически фрагментированной ДНК молок лосося. Потом приблизительно 500 нг линеаризованной плазмидной ДНК инкубировали в 100 мкл ресуспендированных клеток и выдерживали при 39°С на протяжении 1 часа с вихревым перемешиванием при 15-минутных интервалах. Клетки помещали на пластинки с селективными средами и выдерживали при 30°С на протяжении 2-3 суток.

Анализ Yarrowia lipolytica на жирные кислоты:

Для анализа жирных кислот клетки собирали путем центрифугирования, и липиды экстрагировали как описано в работе Bligh, E.G. & Dyer, W.J. (Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917 (1959)). Метиловые эфиры жирных кислот готовили путем трансэтерификации липидного экстракта метоксидом натрия (Roughan, G. и Nishida, I., Arch Biochem Biophys. 276(1):38-46 (1990)) и потом анализировали с помощью Hewlett-Packard 6890 GC (газовый хроматограф), снабженного 30 м×0,25 мм (внутр. диам.) HP-INNOWAX (Hewlett-Packard) колонкой. Температура печи составляла от 170°С (25 минут выдержки) до 185°С при 3,5°С/минуту.

Для прямой трансэтерификации основания культуру Yarrowia (3 мл) собирали, промывали один раз в дистиллированной воде и высушивали под вакуумом в устройстве Speed-Vac на протяжении 5-10 минут. К образцу прибавляли метоксид натрия (100 мкл 1%), потом его подвергали вихревому перемешиванию и встряхиванию на протяжении 20 минут. После добавления 3 капель 1М NaCl и 400 мкл гексана образец подвергали вихревому перемешиванию и центрифугированию. Верхний слой удаляли и анализировали методом газовой хроматографии как описано выше.

Конструирование штамма Y4305U3 Yarrowia lipolytica:

Штамм Y4305U3 Y. lipolytica был использован как хозяин в Примерах 52, 53 и 54, infra. Последующее описание является сводкой конструирования штамма Y4305U3, полученного из Yarrowia lipolytica ATCC № 20362. Штамм Y4305U3 способен произвести приблизительно 53,2% ЭПК относительно всех липидов через экспрессию дельта-9-элонгаза/дельтаа-8-десатуразного пути (ФИГ.44).

Разработка штамма Y4305U3 потребовала конструирования штамма Y2224 (FOA резистентный мутант как результат автономной мутации Ura3 гена дикого типа Yarrowia штамма ATCC № 20362), штамма Y4001 (производящего 17% ЭДК с Leu- фенотипом), штамма Y4001U1 (производящего 17% ЭДК с Leu- и Ura- фенотипом), штамма Y4036 (производящего 18% ДГЛК с Leu- фенотипом), штамма Y4036U (производящего 18% ДГЛК с Leu- и Ura- фенотипом), штамма Y4070 (производящего 12% АРК с Ura- фенотипом), штамма Y4086 (производящего 14% ЭПК), штамма Y4086U1 (Ura3-), штамма Y4128 (производящего 37% ЭПК), штамма Y4128U3 (Ura-), штамма Y4217 (производящего 42% ЭПК), штамма Y4217U2 (Ura-), штамма Y4259 (производящего 46,5% ЭПК) и штамма Y4259U2 (Ura-).

Генерация штамма Y2224: Штамм Y2224 изолировали следующим способом: клетки Yarrowia lipolytica ATCC #20362 из YPD агаровой пластинки наносили штрихами на МС пластинку (по 75 мг/л урацила и уридина, 6,7 г/л YNB с сульфатом аммония, без аминокислот, и 20 г/л гдюкозы) с содержанием 250 мг/л 5-FOA (Zymo Research). Пластинки инкубировали при 28°C, и четыре из результирующих колоний намазывали раздельно на МС пластинки, содержащие 200 мг/мл 5-FOA и МС пластинки без урацила и уридина. Это проделывали для подтверждения ауксотрофии урацил Ura3.

Генерация штамма Y4001, производящего около 17% ЭДК из всех липидов: Штамм Y4001 создавался путем интеграции конструкции pZKLeuN-29E3 (ФИГ.45A). Эта конструкция, содержащая четыре химерных гена (т.е. дельта-12-десатураза, C16/18 -элонгаза и две дельта-9-элонгазы), был интегрирован в Leu2 локусы штамма Y2224, давая таким образом возможность получить ЭДК.

Конструкция pZKLeuN-29E3, содержала компоненты, показанные ниже в Таблице 8.

ТАБЛИЦА 8

Описание плазмиды pZKLeuN-29E3 (SEQ ID NO:315)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:315 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
BsiW I/Asc I

(7797-7002)
788 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Leu2 гена (номер доступа GenBank AF260230)
Sph I/Pac I

(4302-3591)
703 bp 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Leu2 гена (номер доступа GenBank AF260230)

Swa I/BsiW I

(10533-7797)
GPD::FmD12::Pex20, включающий:

GPD: Yarrowia lipolytica GPD промотор;(патент США № 7259255);

FmD12: Fusarium moniliforme дельта-12-десатуразный ген (SEQ ID NO:316) (помечена как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 F.D12мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на Фигуре; PCT публикация No. WO 2005/047485);

Pex20: Pex20 терминирующая последовательность из Yarrowia Pex20 гена (номер доступа GenBank AF054613)
Bgl II/Swa I

(12559-10533)
EXP1::EgD9eS::Lip1, включающий:

EXP1: Yarrowia lipolytica экспортный протеиновый (EXP1) промотор (помеченый как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Exp proмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на Фигуре; патентная заявка США № 11/265761);

EgD9eS: кодон-оптимизированная дельта-9-элонгаза (SEQ ID NO:318), получена из Euglena gracilis (помечена как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9Eмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на рисунке; PCT публикация № WO 2007/061742);

Lip1: Lip1 терминирующая последовательность из Yarrowia Lip1 гена (номер доступа GenBank Z50020)
Pme I/Cla I

(12577-1)
FBAINm::EgD9eS::Lip2, включающий:

FBAINm: Yarrowia lipolytica FBAINm промотор (патент США № 7202356);

EgD9eS: кодон-оптимизированный дельта-9-элонгазный ген (SEQ ID NO:318), получена из Euglena gracilis (помечена как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9ESмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2007/061742);

Lip2: Lip2 терминирующая последовательность из Yarrowia Lip2 гена (гомер доступа GenBank AJ012632)
Cla I/EcoR I

(1-1736)
LoxP::Ura3::LoxP, включающий:

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320);

Yarrowia Ura3 ген (номер доступа GenBank AJ306421);

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320)
EcoR I/Pac I

(1736-3591)
YAT1::ME3S::Pex16, включающий:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на Фигуре; патентная публикация США № 2006/0094102-A1);

ME3S: кодон-оптимизированный C16/18-элонгазный ген (SEQ ID NO:321), получена из M. alpina (PCT публикация № WO 2007/046817);

Pex16: Pex16 терминирующая последоват. Yarrowia Pex 16 гена (номер доступа GenBank U75433)

Плазмиду pZKLeuN-29E3 расщепляли AscI/SphI и затем использовали для трансформации штамма Y2224Y. lipolytica (т.е. ATCC № 20362 Ura3-) в соответствии с разделом Общие методы. Трансформированные клетки помещали на пластинки со средой MCLeu, и пластинки выдерживали при 30°C в течение от 2 до 3 суток. Колонии собирали и наносили штрихами на МС и MCLeu селекционные пластинки. Колонии, которые могли расти на MCLeu пластинках, но не на МС пластинках, были выбраны в качестве Leu- штаммов. Отдельные колонии Leu- штаммов были использованы для инокуляции жидкой MCLeu, и жидкие культуры встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 2 суток при 30°C. Клетки собирали путем центрифугирования, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и потом анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

Газо-хроматографические анализы показали наличие ЭДК в трансформантах, содержащих 4 химерных гена pZKLeuN-29E3, но не в контрольном штамме Yarrowia Y2224. Большиство из выбранных 36 Leu- штаммов продуцировали приблизительно от 12 до 16,9% ЭДК от всех липидов. Три штамма, обозначенных как Y4001, Y4002, и Y4003, давали приблизительно 17,4%, 17%, и 17,5% ЭДК от всех липидов, соответственно.

Отдельные колонии штаммов Y4001, Y4002, и Y4003 использовали для инокуляции жидкой MCLeu, и жидкие культуры встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 2 суток при 30°C. Клетки собирали путем центрифугирования, ресуспендировали в HGM, и потом встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 5 суток. Клетки собирали путем центрифугирования, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и потом анализировали на газовом хроматографе Hewlett-Packard 6890 GC. Анализы GC показали, что штаммы Y4001, Y4002, и Y4003 вырабатывали приблизительно 24% ЭДК от всех липидов.

Генерация штамма Y4001U (Leu-, Ura-): Штамм Y4001U создавали путем временной экспрессии Cre рекомбиназного фермента в плазмиде pY116 (ФИГ.45B) в штамме Y4001 с получением Leu- и Ura- фенотипа. Конструкция pY116 содержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 9

Описание плазмиды pY116 (SEQ ID NO:323)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:323 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
1328-448ColE1 плазмидный источник репликации
2258-1398 Ампицилин-резистентный ген (AmpR) для селекции в E. coli
3157-4461 Yarrowia автономная репликационная последовательность (ARS18; номер доступа GenBank A17608)
SwaI/PacI

6667-4504
Yarrowia Leu2 ген (номер доступа GenBank AF260230)
Swa I/Pme I (6667-218)GPAT::Cre::XPR2, включающий:

GPAT: Yarrowia lipolytica GPAT промотор (патент США № 7264949);

Cre: энтеробактерийный фаг P1 Cre ген для рекомбиназного протеина (номер доступа X03453);

XPR2: ~100 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Xpr гена (номер доступа GenBank M17741)

Плазмиду pY116 использовали для трансформации свежевыращенных Y4001 клеток в соответствии с разделом Общие методы. Трансформированные клетки помещали на MCLeuUra пластинки, содержащие 280 мкг/мл сульфонилмочевины (хлоримурон этил, E. I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE), и пластинки выдерживали при 30°C в течение от 3 до 4 суток. Четыре колонии собирали и потом использовали для инокуляции в 3 мл жидкого YPD. Жидкие культуры встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 1 суток при 30°C. Культуры разбавляли до1:50000 жидкой MCLeuUra средой, и 100 мкл помещали на новые YPD пластинки. Данные пластинки выдерживали при 30°C в течение 2 суток. Колонии собирали и наносили штрихами на селекционные пластинки MCLeu и MCLeuUra. Колонии, которые могли расти на пластинках MCLeuUra, но не на пластинках MCLeu, выбирали и проанализировали методом газовой хроматографии, и подтвердили наличие C20 :2 (ЭДК). Несколько штаммов, каждый из которых имел Leu- и Ura- фенотип, вырабатывали приблизительно 17% ЭДК от всех липидов и были коллективно обозначены как Y4001U. Один из этих штаммов был обозначен как Y4001U1.

Генерация Y4036 штамма, производящего около 18% ДГЛК от всех липидов: Конструкцию pKO2UF8289 (ФИГ.46A; SEQ ID NO:324) генерировали для интеграции четырех химерных генов (включающих дельта-12-десатуразу, одну дельта-9-элонгазу, и две мутантных дельта-8-десатуразы) в дельта-12-локусы штамма Y4001U1, обеспечивая тем самым получение ДГЛК. Конструкция pKO2UF8289 содержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 10

Описание плазмиды pKO2UF8289 (SEQ ID NO:324)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:324 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
AscI/BsiWI

(10337-9600)
5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia дельта-12-десатуразного гена (SEQ ID NO:325) (помеченый какмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YLD12-Nмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патент США № 7214491)
EcoRI/SphI

(13601-13045)
3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia дельта-12-десатуразного гена (SEQ ID NO:325) (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YL12-Cмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2004/104167; патент США № 7214491)
SwaI/BsiWI

(7088-9600)
FBAINm::EgD8M::Pex20, включающий:

FBAINm: Yarrowia lipolytica FBAINm промотор (PCT публикация № WO 2005/049805; патент США № 7202356);

EgD8M: синтетическая мутантная дельта-8-десатураза (SEQ ID NO:327) (помеченная как "D8S-23" на фигуре; патентная заявка США № 11/635258), полученная из Euglena gracilis (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD8Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; патент США № 7256033);

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Pex20: Pex20 терминирующая последовательность из Yarrowia Pex20 гена (номер доступа GenBank AF054613)
SwaI/PmeI

(7088-4581)
YAT1::FmD12::OCT, включающий:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США № 2006/0094102-A1);

FmD12: Fusarium moniliforme дельта-12-десатуразный ген (SEQ ID NO:316) (помеченная как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 F.D12мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2005/047485);

OCT: OCT терминирующая последовательность Yarrowia OCT гена (номер доступа GenBank X69988)
PmeI/PacI

(4581-2124)
EXP1:: EgD8M::Pex16, включающий:

EXP1: Yarrowia lipolytica экспортный протеиновый (EXP1) промотор (PCT публикация № WO 2006/052870 и патентная заявка США № 11/265761);

EgD8M: синтетическая мутантная дельта-8-десатураза (SEQ ID NO:327) (помеченная как "D8-23" на фигуре; патентная заявка США № 11/635258), полученная из Euglena gracilis (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD8Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; PCT публикация № WO 2006/012326; патент США № 7256033);

Pex16: Pex16 терминирующая последовательность из Yarrowia Pex16 гена (номер доступа GenBank U75433)
PmeI/ClaI

(2038-1)
GPAT::EgD9e::Lip2, включающий:

GPAT: Yarrowia lipolytica GPAT промотор (PCT публикация № WO 2006/031937; патент США № 7264949);

EgD9e: Euglena gracilis дельта-9-элонгазный ген (SEQ ID NO:329) (помеченый как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9Eмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2007/061742);

Lip2: Lip2 терминирующая последовательность из Yarrowia Lip2 гена (номер доступа GenBank AJ012632)
ClaI/EcoRI

(13601-1)
LoxP::Ura3::LoxP, включающий:

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320);

Yarrowia Ura3 ген (номер доступа GenBank AJ306421);

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320)

Плазмиду pKO2UF8289 расщепляли AscI/SphI и затем использовали для трансформации штамма Y4001U1 в соответствии с разделом Общие методы. Трансформированные клетки помещались на пластинки со средой MCLeu, и пластинки выдерживали при 30°C в течение от 2 до 3 суток. Колонии собирали и наносили штрихами на MCLeu селекционные пластинки при 30°С на протяжении 2 суток. Эти клетки потом использовали для инокуляции жидкой MCLeu среды, и жидкие культуры встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 2 суток при 30°C. Клетки собирали путем центрифугирования, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и потом анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

Газо-хроматографические анализы показали наличие ДГЛК в трансформантах, содержащих 4 химерных гена pKO2UF8289, но не в родительском штамме Y4001U1. Большиство из выбранных 96 штаммов продуцировали приблизительно от 7 до 13% ДГЛК от всех липидов. Шесть штаммов, обозначенных как Y4034, Y4035, Y4036, Y4037, Y4038 и Y4039 давали приблизительно 15%, 13,8%, 18,2%, 13,1%, 15,6% и 13,9% ДГЛК от всех липидов, соответственно.

Генерация штамма Y4036U (Leu-, Ura3-): Конструкцию pY116 (ФИГ.45B; SEQ ID NO:323) использовали для временной экспрессии Cre рекомбиназного фермента в штамме Y4036. Это высвобождало LoxP сэндвичевый Ura3 ген из генома.

Плазмиду pY116 использовали для трансформации штамма Y4036 в соответствии с разделом Общие методы. Следуя трансформации, клетки помещали на MCLeuUra пластинки, и пластинки выдерживали при 30°C в течение от 2 до 3 суток. Отдельные колонии, выращенные на MCLeuUra пластинках, наносили штрихами в YPD жидкую среду. Жидкие колонии встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 1 суток при 30°C со структурированием pY116 плазмиды. Клетки из выращенных культур наносили штрихами на MCLeuUra пластинки. После двух суток при 30°C отдельные колонии повторно наносили на MCLeuUra, MCU и MCLeu пластинки. Те колонии, которые могли расти на MCLeuUra, но не на MCU или MCLeu пластинках, выбирали. Один штамм с Leu- и Ura- фенотипами был обозначен как Y4036U (Ura-, Leu-).

Генерация Y4069 и Y4070 штаммов, производящих около 12% АРК от всех липидов: Конструкцию pZKSL-555R (ФИГ.46B; SEQ ID NO:331) генерировали для интеграции трех дельта-5-десатуразных генов в Lys локусы штамма Y4036U, обеспечивая тем самым выработку АРК. pZKSL-555R плазмида содержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 11

Описание плазмиды pZKSL-555R (SEQ ID NO:331)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:331Описание компонентов фрагмента и химерного гена
AscI/BsiWI

(3321-2601)
720 bp 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Lys5 гена (номер доступа GenBank M34929)
PacI/SphI

(6716-6029)
687 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Lys5 гена (номер доступа GenBank M34929)
BglII/BsiWI

(15-2601)
EXP1::EgD5S::Pex20, включающий:

EXP1: Yarrowia lipolytica экспортный протеиновый промотор (EXP1) (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EXPмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная заявка США № 11/265761);

EgD5S: кодон-оптимизированная дельта-5-десатураза (SEQ ID NO:332), полученная из Euglena gracilis (патентная публикация США 2007-0292924-A1 );

Pex20: Pex20 терминаторная последовательность из Yarrowia Pex20 гена (номер доступа GenBank AF054613)
ClaI/PmeI

(11243-1)
YAT1::RD5S::OCT, включающая:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор, помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США 2006/0094102-A1);

RD5S: кодон-отимизированная дельта-5-десатураза (SEQ ID NO:334), полученная из Peridinium sp. CCMP626 (помечена как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 RD5S(626)мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США 2007-0271632-A1);

OCT: OCT терминирующая последовательность Yarrowia OCT гена (номер доступа GenBank X69988)
EcoRI/PacI

(9500-6716)
FBAIN::EgD5::Aco, включающий:

FBAIN: Yarrowia lipolytica FBAIN промотор (патент США № 7202356);

EgD5: Euglena gracilis дельта-5-десатураза (SEQ ID NO:336) (помеченная как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD5WTмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США 2007-0292924-A1 ) с элиминацией внутренних EcoRI, BglII, HindIII и NcoI рестрикционных ферментных сайтов [мутации помечены как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 M.EIмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 M.BIIмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 M.Hмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 M.Nмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 , соответственно];

Aco: Aco терминирующая последовательность из Yarrowia Aco гена (номер доступа GenBank AJ001300)
EcoRI/ClaI

(9500-11243)
Yarrowia Leu2 ген (номер доступа GenBank M37309)

Плазмиду pZKSL-555R расщепляли AscI/SphI и потом использовали для трансформации штамма Y4036U в соответствии с разделом Общие методы. Трансформированные клетки помещали на MCLeuLys пластинки, и эти пластинки выдерживали при 30°C в течение от 2 до 3 суток. Отдельные колонии затем наносили повторно штрихами на MCLeuLys пластинки, и результирующие колонии использовали для инокуляции жидкой MCLeuLys. Жидкие культуры потом встряхивали при 250 оборотв/минуту в течение 2 суток при 30°C. Данные клетки собирали путем центрифугирования, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и впоследствии анализировали на газовом хроматографе Hewlett-Packard 6890 GC.

Газо-хроматографический анализ показал наличие АРК в трансформантах, содержащих 3 химерных гена pZKSL-555R, но не в родительском Y4036U штамме. Большинство из выбранных 96 штаммов производили ~10% АРК от всех липидов. Четыре штамма, обозначненные как Y4068, Y4069, Y4070, и Y4071, производили около 11,7%, 11,8%, 11,9% и 11,7% АРК от всех липидов, соответственно. Дальнейший анализ показал, что данные три химерных гена pZKSL-555R не интегрировались в Lys5 сайт в Y4068, Y4069, Y4070 и Y4071 штаммов. Все штаммы обладали Lys+ фенотипом.

Конечный генотип штамма Y4070, по отношению к Yarrowia lipolytica ATCC #20362 дикого типа, был Ura-, неизвестен 1-, неизвестен 3-, Leu+, Lys+, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, YAT1::ME3S::Pex16, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1::EgD8M::Pex16, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::RD5S::OCT.

Генерация штамма Y4086, производящего около 14% ЭПК от всех липидов: Конструкцию pZP3-Pa777U (ФИГ.47A; SEQ ID NO:338) генерировали для трех дельта-17-десатуразных генов в Pox3 локусы (номер доступа GenBank AJ001301) штамма Y4070, обеспечивая тем самым выработку ЭПК. Плазмида pZP3-Pa777U содержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 12

Описание плазмиды pZP3-Pa777U (SEQ ID NO:338)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:338 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
AscI/BsiWI

(3527-4297)
770 bp 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Pox3 гена (номер доступа GenBank AJ001301)
PacI/SphI

(1-827)
827 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Pox3 гена (номер доступа GenBank AJ001301)
ClaI/SwaWI

(6624-4457)
YAT1::PaD17S::Lip1, включающий:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США 2006/0094102-A1);

PaD17S: кодон-оптимизированная дельта-17-десатураза (SEQ ID NO:339), полученная из Pythium aphanidermatum (патентная заявка США № 11/779915);

Lip1: Lip1 терминирующая последовательность из Yarrowia Lip1 гена (номер доступа GenBank Z50020)
EcoRI/PmeI

(8359-10611)
EXP1::PaD17::Pex16, включающий:

EXP1: Yarrowia lipolytica экспортный протеиновый (EXP1) промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Expмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре;

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 патентная заявка США № 11/265761);

PaD17: Pythium aphanidermatum дельта-17-десатуразный ген (SEQ ID NO:341) (помеченная как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 PaD17WTмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная заявка США № 11/779915);

Pex16: Pex16 терминирующая последовательность из Yarrowia Pex16 гена (номер доступа GenBank U75433)
PmeI/PacI

(10611-1)
FBAINm::PaD17::Aco, включающий:

FBAINm: Yarrowia lipolytica FBAINm промотор (WO 2005/049805; патент США № 7202356);

PaD17: Pythium aphanidermatum дельта-17-десатуразный ген (SEQ ID NO:341) (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 PaD17WTмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная заявка США № 11/779915);

Aco: Aco терминируюшая последовательность из Yarrowia Aco гена (номер доступа GenBank . AJ001300)
ClaI/EcoRI

(6624-8359)
LoxP::Ura3::LoxP, включающий:

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320);

Yarrowia Ura3 ген (номер доступа GenBank AJ306421);

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320)

Плазмиду pZP3-Pa777U расщепляли AscI/SphI и затем использовали для трансформации штамма Y4070 в соответствии с разделом Общие методы. Трансформированные клетки помещали на МС пластинки, и данные пластинки выдерживали при 30°C в течение от 2 до 3 суток. Затем отдельные колонии повторно наносили штрихами на МС пластинки, и результирующие колонии использовали для инокуляции жидкой MCLeuLys. Жидкие культуры встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 2 суток при 30°C. Данные клетки собирали путем центрифугирования, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и впоследствии анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ (газо-хроматографический) анализы выявили присутствие ЭПК в трансформантах, содержащие 3 химерных гена pZP3-Pa777U, но не в родительском Y4070 штамме. Большинство из выбранных 96 штаммов производили 10-13% ЭПК от всех липидов. Два штамма, обозначенных как Y4085 и Y4086, вырабатывали около 14,2% и 13,8% ЭПК от всех липидов, соответственно.

Конечный генотип штамма Y4086, в отношении Yarrowia lipolytica ATCC #20362 дикого типа, был Ura3+, Leu+, Lys+, неизвестен 1-, неизвестен 2-, YALI0F24167g-, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, YAT1::ME3S::Pex16, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1::EgD8M::Pex16, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::RD5S::OCT, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco.

Генерация штамма Y4086U1 (Ura3-): Штамм Y4086U1 создавали посредством временной экспрессии Cre рекомбинантного фермента в конструкции pY117 (ФИГ.47B; SEQ ID NO:343) в штамме Y4086 с образованием Ura- фенотипа. Это высвободило LoxP сэндвичевый Ura3 ген из генома. Мутантный Yarrowia AHAS фермент в плазмиде pY117 дал SUR, который использовали как позитивный скрининговый маркер.

Плазмиду pY117 получали из плазмиды pY116 (описанной supra, и в патентной заявке США № 11/635258) путем инсерции мутантного AHAS гена, фланкированного PacI-SwaI сайтами, в PacI-SwaI, расщепленный pY116, замещая таким образом LEU селективный маркер сульфонилмочевинным маркером. Конструкция pY117 содержала, таким образом, следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 13

Описание плазмиды pY117 (SEQ ID NO:343)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:343 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
1328-448ColE1 плазмидный источник репликации
2258-1398 Ампициллин-резистентный ген (AmpR ) для селекции в E. coli

2438-2838E. coli f1 источник репликации
3157-4461 Yarrowia автономная репликационная последовательность (ARS18; номер доступа GenBank A17608)
PacI/SwaI

4504-7498
Yarrowia lipolytica AHAS ген (номер доступа GenBank XP_501277) включая W497L мутацию (SEQ ID NO:

344; PCT публикация № WO 2006/052870)
SwaI/PmeI

7498-218
GPAT::Cre::XPR, включающий:

GPAT: Yarrowia lipolytica GPAT промотор (PCT публикация № WO 2006/031937; патент США № 7264949);

Cre: Энтеробактерия-фаговый P1 Cre ген для рекомбиназного протеина (номер доступа GenBank X03453), исключая одноосновное изменение (T4G) приводящее к одноаминокислотному изменению (S2A) с образованием NcoI сайта для удобства клонирования;

XPR: ~100 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участка Yarrowia Xpr гена (номер доступа GenBank M17741)

Плазмиду pY117 использовали для трансформации штамма Y4086 в соответствии с разделом Общие методы. Следуя трансформации, клетки помещали на MCU+SU (280 мкг/мл сульфонилмочевины; известная также как хлоримурон этил, E. I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) пластинки, и данные пластинки выдерживали при 30°C в течение от 2 до 3 суток. Отдельные SUR колонии, выращенные на MCU+SU пластинках, собирали и вносили в YPD жидкую среду, и жидкие культуры встряхивали при 250 оборотов/минуту на протяжении 1 суток при 30°C для структурирования pY117 плазмиды. Клетки из выращенных культур наносили штрихами на MCU пластинки. После двух суток при 30°C отдельные колонии повторно наносили на МС и MCU пластинки. Те колонии, которые могли расти на MCU, но не на МС пластинках, отбирали. Два из этих штаммов с Ura- фенотипами были обозначены как Y4086U1 и Y4086U2 (Ura-).

Генерация штамма Y4128, производящего около 37% ЭПК от всех липидов: Конструкцию pZP2-2988 (ФИГ.48A; SEQ ID NO:345) генерировали для интеграции одного дельта-12-десатуразного гена, двух дельта-8-десатуразных генов, и одного дельта-9-элонгазного гена в Pox2 локусы (номер доступа GenBank AJ001300) штамма Y4086U1, обеспечивая тем самым высокий уровень выработки ЭПК. Плазмида pZP2-2988 содержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 14

Описание плазмиды pZP2-2988 (SEQ ID NO:345)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:345 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
AscI/BsiWI

(3083-2273)
803 bp 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Pox2 гена (номер доступа GenBank AJ001300)
PacI/SphI

(6446-5791)
649 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Pox2 гена (номер доступа GenBank AJ001300)
PmeI/BsiWI

(347-2273)
FBA::EgD9eS::Pex20, включающий:

FBA: Yarrowia lipolytica FBA промотор (PCT публикация № WO 2005/049805; патент США № 7202356);

EgD9eS: кодон-оптимизированная дельта-9-элонгаза (SEQ ID NO:318), полученная из Euglena gracilis (PCT публикация № WO 2007/061742);

Pex20: Pex20 терминирующая последовательность из Yarrowia Pex20 гена (номер доступа GenBank AF054613)
ClaI/PmeI

(13318-347)
GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, включающий:

GPM/FBAIN: химерный Yarrowia lipolytica GPM/FBAIN промотор (отдельно помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 GPMмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 FBA intronмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре) (PCT публикация № WO 2005/049805; патент США № 7202356);

FmD12S: кодон-оптимизированная дельта-12-десатураза (SEQ ID NO:346), полученная из Fusarium moniliforme (помеченная как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 F.D12Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2005/047485);

OCT: OCT терминирующая последовательность Yarrowia OCT гена (номер доступа GenBank X69988)
ClaI/EcoRI

(13318-11581)
LoxP::Ura3::LoxP, включающий:

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320);

Yarrowia Ura3 ген (номер доступа GenBank AJ306421);

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320)
EcoRII/SwaI

(11581-8884)
GPDIN::EgD8M::Lip1, включающий:

GPDIN: Yarrowia lipolytica GPDIN промотор (патентная публикация США 2006/0019297-A1);

EgD8M: синтетическая мутантная дельта-8-десатураза (SEQ ID NO:327; патентная заявка

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 США № 11/635258), получена из Euglena gracilis (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD8Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; патент США № 7256033);

Lip1: Lip1 термнирующая последовательность из Yarrowia Lip1 гена (номер доступа GenBank Z50020)
SwaI/PacI

(8884-6446)
YAT1::EgD8M::ACO, включающий:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная заявка США 2006/0094102-A1);

EgD8M: синтетическая мутантная дельта-8-десатураза (SEQ ID NO:327; патентная заявка США № 11/635258), полученная из Euglena gracilis (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD8Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; патент США № 7256033);

Aco: Aco терминирующая последовательность из Yarrowia Aco гена (номер доступа GenBank AJ001300)

Плазмиду pZP2-2988 расщепляли AscI/SphI и затем использовали для трансформации штамма Y4086U1 в соответствии с разделом Общие методы. Трансформированные клетки помещали на МС пластинки, и данные пластинки выдерживали при 30°C в течение от 2 до 3 суток. Отдельные колонии повторно наносили на МС пластинки, и результирующие колонии испоьзовали для инокуляции жидкой MCLeuLys. Жидкие культуры встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 2 суток при 30°C. Клетки собирали путем центрифугирования, ресуспендировали в HGM, и затем встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 5 суток. Данные клетки собирали путем цетрифугирования, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и впоследствии анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ анализы выявили, что большинство из выбранных 96 штаммов производили 12-15,6% ЭРК от всех липидов. Два штамма, обозначенных как Y4128 и Y4129, вырабатывали приблизительно 37,6% и 16,3% ЭПК от всех липидов, соответственно.

Конечный генотип штамма Y4128, относительно Yarrowia lipolytica ATCC #20362 дикого типа, был: YALI0F24167g-, Pex10-, неизвестен 1-, неизвестен 2-, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, YAT1::ME3S::Pex16, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1::EgD8M::Pex16, GPDIN::EgD8M::Lip1, YAT1::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::RD5S::OCT, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco. Штамм Yarrowia lipolytica Y4128 был депонирован в Американском собрании типовых культур 23 августа 2007 года и носит обозначение ATCC PTA-8614.

Генерация штаммов Y4128U: Для разрушения Ura3 гена в штамме Y4128 создали конструкцию pZKUE3S (ФИГ.48B; SEQ ID NO:351) для интеграции EXP1::ME3S::Pex20 химерного гена в Ura3 ген штамма Y4128. Плазмида ZKUE3S содержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 15

Описание плазмиды pZKUE3S(SEQ ID NO:351)
RE сайты нуклеотиды в SEQ ID NO:351Описание компонентов фрагмента и химерного гена
BsiWI/PacI

(318-1038)
721 bp 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Ura3 гена (номер доступа GenBank AJ306421)
SphI/PmeI

(3915-4594)
729 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Ura3 гена (номер доступа GenBank AJ306421)
EcoRI/BsiWI

(4628-318)
EXP1::ME3S::Pex20, включающий:

EXP1: Yarrowia lipolytica экспортный протеиновый промотор (EXP1) (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Expмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная заявка США № 11/265761);

ME3S: кодон-оптимизированный C 16/18 элонгазный ген (SEQ ID NO:321), полученный из Mortierella alpina (PCT публикация № WO 2007/046817);

Pex20: Pex20 терминирующая последовательность Yarrowia Pex20 гена (номер доступа GenBank AF054613)
2149-1269ColE1 плазмидный источник репликации

3079-2219Ампициллин-резистентный ген (AmpR) для селекции в E. coli
3659-3259f1 источник

Плазмиду ZKUE3S расщепляли SphI/PacI и затем использовали для трансформации штамма Y4128 в соответствии с разделом Общие методы. Следуя трансформации, клетки помещали на МС+5-FOA селекционные пластинки, и данные пластинки выдерживли при 30°C в течение от 2 до 3 суток.

Всего собрали 24 трансформанта, которых выращивали на МС+5-FOA селекционных пластинках, их собирали и повторно наносили на свежеприготовленные МС+5-FOA пластинки. Данные клетки снимали с пластинок, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и впоследствии анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ анализы выявили присутствие 10-15% ЭПК во всех трансформантах с pZKUE3S с пластинок. Штаммы, обозначеные как Y4128U1, Y4128U2, Y4128U3, Y4128U4, Y4128U5, и Y4128U6, вырабатывали 12,9%, 14,4%, 15,2%, 15,4%, 14%, и 10,9% ЭПК, соответственно (коллективно, Y4128U).

Расхождение в % ЭПК в Y4128 (37,6%) относительно Y4128U (среднее 13,8%) основано на разных условиях выращивания. Конкретно, предыдущая культура была проанализирована после 2 суток выращивания в жидкой культуре, тогда как последняя культура анализировалась после выращивания на агаровой пластинке. Заявители наблюдали 2-3 кратное возрастание % ЭПК, при сравнении результатов на агаровой пластинки с результатами в жидкой культуре. Таким образом, хотя данные результаты не являются прямо сопоставимыми, оба штамма, Y4128 и Y4128U, демонстрируют значительную выработку ЭПК.

Генерация штамма Y4217, производящего около 42% ЭПК от всех липидов: Конструкцию pZKL2-5U89GC (ФИГ.49A; SEQ ID NO:348) генерировали для интеграции одного дельта-9-элонгазного гена, одного дельта-8-десатуразного гена, одного дельта-5-десатуразного гена, и одного Yarrowia lipolytica диацилглицерин холинфосфотрансферазного гена (CPT1) в Lip2 локусы (номер доступа GenBank AJ012632) штамма Y4128U3, обеспечивая таким образом более высокие уровни производства ЭПК. Плазмида pZKL2-5U89GC одержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 16

Описание плазмиды pZKL2-5U89GC (SEQ ID NO:348)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:348 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
AscI/BsiWI

(730-1)
722 bp 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Lip2 гена (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Lip2.5Nмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; номер доступа GenBank AJ012632)
PacI/SphI

(4141-3438)
697 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Lip2 гена (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Lip2.3Nмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; номер доступа GenBank AJ012632)
SwaI/BsiWI

(13382-1)
YAT1::YlCPT1::Aco, включающий:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США 2006/0094102-A1);

YlCPT1: Yarrowia lipolytica диацилглицерин холинфосфотрансферазный ген (SEQ ID NO:349) (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 CPT1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2006/052870);

Aco: Aco терминирующая последовательность из Yarrowia Aco гена (номер доступа GenBank AJ001300)
PmeI/SwaI

(10745-13382)
FBAIN::EgD8M::Lip1 включающий:

FBAIN: Yarrowia lipolytica FBAIN промотор (патент США № 7202356);

EgD8M: синтетическая мутантная дельта-8-десатураза (SEQ ID NO:327) (помеченная как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 D8S-23мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная заявка США № 11/635258), полученная из Euglena gracilis (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD8Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; патент США № 7256033);

Lip1: Lip1 терминирующая последовательность

мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 из Yarrowia Lip1 гена (номер доступа GenBank Z50020)
PmeI/ClaI

(10745-8650)
GPD::EgD9eS::Lip2, включающий:

GPD: Yarrowia lipolytica GPD промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 GPD Proмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патент США № 7259255);

EgD9eS: кодон-оптимизированный дельта-9-элонгазный ген (SEQ ID NO:318), полученный из Euglena gracilis (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9ESмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2007/061742);

Lip2: Lip2 терминирующая последовательность из Yarrowia Lip2 гена (номер доступа GenBank AJ012632)
ClaI/EcoRI

(8650-6581)
Yarrowia Ura3 ген (номер доступа GenBank AJ306421)
EcoRI/PacI

(6581-4141)
YAT1::EgDD5S::ACO, включающий:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США 2006/0094102-A1);

EgD5S: кодон-оптимизированная дельта-5-десатураза (SEQ ID NO:332), полученая из Euglena gracilis (патентная публикация США 2007-0292924-A1);

Aco: Aco терминирующая последовательность из Yarrowia Aco гена (номер доступа GenBank AJ001300)

Плазмиду pZKL2-5U89GC расщепляли AscI/SphI и затем использовали для трансформации штамма Y4128U3 в соответствии с разделом Общие методы. Трансформированные клетки помещали на МС пластинки, и эти пластинки выдерживали при 30°C в течение от 3 до 4 суток. Отдельные колонии повторно наносили на МС пластинки, и результирующие колонии потом использовались для инокуляции жидкой МС. Жидкие культуры встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 2 суток при 30°C. Клетки собирали путем центрифугирования, ресуспендировали в HGM, и потом встряхивали при 250 оборотов/минуту на протяжении 5 суток. Данные клетки собирали путем центрифугирования, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные эфиры готовили путем трансэтерификации и затем анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ анализы выявили, что большинство из выбранных 96 штаммов вырабатывали 32-39,9% ЭПК от всех липидов. Шесть штаммов, обозначенных как Y4215, Y4216, Y4217, Y4218, Y4219 и Y4220, вырабатывали около 41,1%, 41,8%, 41,7%, 41,1%, 41% и 41,1% ЭПК от всех липидов, соответственно. Конечный генотип каждого штамма, относительно Yarrowia lipolytica ATCC #20362 дикого типа, был: YALI0C18711g-, Pex10-, YALI0F24167g-, неизвестен 1-, неизвестен 3-, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, YAT1::ME3S::Pex16, EXP1::ME3S::Pex20, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, GPD::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip1, EXP1::EgD8M::Pex16, GPDIN::EgD8M::Lip1, YAT1::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::EgD5S::Aco, YAT1::RD5S::OCT, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco, YAT1::YlCPT1::ACO.

Генерация штамма Y4217U2 (Ura3-): Для разрушения Ura3 гена в штамме Y4217, конструкцию pZKUE3S (ФИГ.48B; SEQ ID NO:351) использовали для интеграции химерного EXP1::ME3S::Pex20 гена в Ura3 ген штамма Y4217. Следуя трансформации, клетки помещали на МС+5-FOA селекционные пластинки, и данные пластинки выдерживали при 30°C в течение от 3 до 4 суток.

Все из 6 трансформантов, выращенных на МС+5-FOA пластинках, собирали и повторно наносили штрихами на МС пластинки и МС+5-FOA пластинки. Все 6 штаммов имели Ura- фенотип (т.е. клетки могли расти на МС+5-FOA пластинках, но не на МС пластинках). Клетки соскребали с МС+5-FOA пластинок, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и впоследствии анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ анализы выявили присутствие от 18,7% до 28,6% ЭПК во всех трансформантах с pZKUE3S, выращенных на МС+5-FOA пластинках. Два штамма, обозначенных как Y4217U1 и Y4217U2, вырабатывали 22,5% и 28,6% ЭПК, соответственно.

Генерация штамма Y4259, производящего около 46,5% ЭПК от всех липидов: Конструкцию pZKL1-2SP98C (ФИГ.49B; SEQ ID NO:352) генерировали для интеграции одного дельта-9-элонгазного гена, одного дельта-8-десатуразного гена, одного дельта-12-десатуразного гена, и одного Yarrowia lipolytica диацилглицерин холинфосфотрансферазного гена (CPT1) в Lip1 локусы (номер доступа GenBank Z50020) штамма Y4217U2, обеспечивая таким образом более высокие уровни выработки ЭПК. Плазмида pZKL1-2SP98C содержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 17

Описание плазмиды pZKL1-2SP98C (SEQ ID NO:352)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:352 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
AscI/BsiWI

(3474-2658)
809 bp 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Lip1 гена (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Lip1-5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Nмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; номер доступа GenBank Z50020)
PacI/SphI

(6951-6182)
763 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia Lip1 гена (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Lip1.3Nмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; номер доступа GenBank Z50020)
SwaI/BsiWI

(1-2658)
GPD::YlCPT1::Aco, включающий:

GPD: Yarrowia lipolytica GPD промотор (патент США № 7259255);

YlCPT1: Yarrowia lipolytica диацилглицерин холинфосфотрансферазный ген (SEQ ID NO:349) (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 CPT1мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2006/052870);

Aco: Aco терминирующая последовательность из Yarrowia Aco гена (номер доступа GenBank AJ001300)

PmeI/SwaI

(13241-1)
FBAIN::EgD8M::Lip1 включающий:

FBAIN: Yarrowia lipolytica FBAIN промотор (патент США № 7202356);

EgD8M: синтетическая мутантная дельта-8-десатураза (SEQ ID NO:327; патентная заявка США № 11/635258), полученная из Euglena gracilis (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD8Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; патент США № 7256033);

Lip1: Lip1 терминирующая последовательность из Yarrowia Lip1 гена (номер доступа GenBank Z50020)
PmeI/ClaI

(13241-11385)
YAT1::EgD9eS::Lip2, включающий:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США 2006/0094102-A1);

EgD9eS: кодон-оптимизированный дельта-9-элонгазный ген (SEQ ID NO:318), полученный из Euglena gracilis (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD9ESмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2007/061742);

Lip2: Lip2 терминирующая последоватеольность из Yarrowia Lip2 гена (номер доступа GenBank AJ012632)
ClaI/EcoRI

(11385-9648)
LoxP::Ura3::LoxP, включающий:

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320);

Yarrowia Ura3 ген (номер доступа GenBank AJ306421);

LoxP последовательность (SEQ ID NO:320)
EcoRI/PacI

(9648-6951)
EXP1::FmD12S::ACO, включающий:

EXP1: Yarrowia lipolytica экспортный протеиновый (EXP1) промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Expмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная зваявка США № 11/265761);

FmD12S: кодон-оптимизированная дельта-12-элонгаза (SEQ ID NO:346), полученная из Fusarium moniliforme (помеченная как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 FD12Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2005/047485);

Aco: Aco терминирующая последовательность из Yarrowia Aco гена (номер доступа GenBank AJ001300)

Плазмиду pZKL1-2SP98C расщепляли AscI/SphI и потом использовали для трансформации штамма Y4217U2 в соответствии с разделом Общие методы. Трансформированные клетки помещали на МС пластинки, и данные пластинки выдерживали при 30°C в течение от 3 до 4 суток. Отдельные колонии повторно наносили на МС пластинки, и результирующие колонии потом использовали для инокуляции жидкой МС. Жидкие культуры потом встряхивали при 250 оборотов/минуту на протяжении 2 суток при 30°C. Клетки собирали путем центрифугирования, ресуспендировали в HGM и потом встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 5 суток. Клетки собирали путем центрифугирования, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем транс-этерификации и впоследствии анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ анализы показали, что большинство из выбранных 72 штаммов вырабатывали 40-44% ЭПК от всех липидов. Шесть штаммов, обозначенных как Y4259, Y4260, Y4261, Y4262, Y4263, и Y4264, производили около 46,5%, 44,5%, 44,5%, 44,8%, 44,5%, и 44,3% ЭПК от всех липидов, соответственно.

Конечный генотип штамма Y4259 относительно Yarrowia lipolytica ATCC #20362 дикого типа был: YALI0C18711g-, Pex10-, YALI0F24167g-, неизвестен 1-, неизвестен 3-, неизвестен 8-, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, EXP1::FmD12S::Aco, YAT1::ME3S::Pex16, EXP1::ME3S::Pex20 (2 копии), GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, GPD::EgD9eS::Lip2, YAT1::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip1 (2 копии), EXP1::EgD8M::Pex16, GPDIN::EgD8M::Lip1, YAT1::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::EgD5S::Aco, YAT1::RD5S::OCT, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco, YAT1::YlCPT1::ACO, GPD::YlCPT1::ACO.

Генерация штамма Y4259U2 (Ura3-): Для разрушения Ura3 гена в штамме Y4259, конструкцию pZKUM (ФИГ.50A; SEQ ID NO:353) использовали для интеграции Ura3 мутантного гена в Ura3 ген штамма Y4259. Плазмида pZKUM содержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 18

Описание плазмиды pZKUM (SEQ ID NO:353)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:353 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
SalI/PacI

(32845-1)
Синтетический мутантный Ura3 ген (SEQ ID NO:354, где 1459 bp ДНК фрагмент содержит 33 bp делецию от +21 до +53, 1 bp делецию при +376 и 3 bp делецию от +400 до +403 Yarrowia Ura3 кодирующий участок (номер доступа GenBank AJ306421))
1112-232ColE1 плазмидный источник репликации
2042-1182Ампициллин-резистентный ген (AmpR) для селекции в E. coli

Всего 3 трансформанта, выращенных на МС+5-FOA пластинках, собирали и повторно наносили на МС пластинки и МС+5-FOA пластинки. Все 3 штамма имели Ura- фенотип (т.е. клетки могли расти на МС+5-FOA пластинках, но не на МС пластинках). Клетки соскребали с МС+5-FOA пластинок, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и впоследствии анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ анализы выявили присутствие 31,4%, 31% и 31,3% ЭПК в № 1, № 2 и № 3 трансформантах с pZKUM, выращенных на МС+5-FOA пластинках. Эти три штамма были обозначены как Y4259U1, Y4259U2 и Y4259U3, соответственно (коллективно, Y4259U).

Генерация штамма Y4305, производящего около 53% ЭПК от всех липидов: Конструкцию pZKD2-5U89A2 (ФИГ.50B; SEQ ID NO:355) генерировали для интеграции одного дельта-9-элонгазного гена, одного дельта-5-десатуразного гена, одного дельта-8-десатуразного гена, и одного дельта-12-десатуразного гена в диацилглицерил ацилтрансферазные (DGAT2) локусы штамма Y4259U2, обеспечивая таким образом более высокие уровни выработки ЭПК. Плазмида pZKD2-5U89A2 содержала следующие компоненты:

ТАБЛИЦА 19

Описание плазмиды pZKD2-5U89A2 (SEQ ID NO:355)
RE сайты и нуклеотиды в SEQ ID NO:355 Описание компонентов фрагмента и химерного гена
AscI/BsiWI

(1-736)
728 bp 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia DGAT2 гена (SEQ ID NO:356) (помеченного как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YLDGAT5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патент США № 7267976)
PacI/SphI

(4164-3444)
714 bp 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 участок Yarrowia DGAT2 гена (SEQ ID NO:356) (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YLDGAT3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патент США № 7267976)
SwaI/BsiWI

(13377-1)
YAT1::FmD12S::Lip2, включающий:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США 2006/0094102-A1);

FmD12S: кодон-оптимизированная дельта-12-элонгаза (SEQ ID NO:346), полученная из Fusarium moniliforme (помеченная как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 F.D12Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2005/047485);

Lip2: Lip2 терминирующая последовательность из Yarrowia Lip2 гена (номер доступа GenBank AJ012632)
PmeI/SwaI

(10740-13377)
FBAIN::EgD8M::Lip1 включающий:

FBAIN: Yarrowia lipolytica FBAIN промотор (патент США № 7202356);

EgD8M: синтетическая мутантная дельта-8-десатураза (SEQ ID NO:327; патентная публикация США № 11/635258), полученная из Euglena gracilis (мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgD8Sмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; патент США № 7256033);

Lip1: Lip1 терминирующая последовательность из Yarrowia Lip1 гена (номер доступа GenBank Z50020)
ClaI/PmeI

(8846-10740)
YAT1::E389D9eS::OCT, включающий:

YAT1: Yarrowia lipolytica YAT1 промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 YATмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная публикация США 2006/0094102-A1);

E389D9eS: кодон-оптимизированная дельта-9-элонгаза (SEQ ID NO:358), полученная из Eutreptiella sp. CCMP389 (помеченная как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 D9ES-389мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; PCT публикация № WO 2007/061742);

OCT: OCT терминирующая последовательность из Yarrowia OCT гена (номер доступа GenBank X69988)

ClaI/EcoRI

(8846-6777)
Yarrowia Ura3 ген (номер доступа GenBank AJ306421)
EcoRI/PacI

(6777-4164)
EXP1::EgD5S::ACO, включающий:

EXP1: Yarrowia lipolytica экспортный протеиновый (EXP1) промотор (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Expмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на фигуре; патентная заявка США № 11/265761);

EgD5S: кодон-оптимизированная дельта-5-десатураза (SEQ ID NO:332), полученная из Euglena gracilis (патентная публикация США 2007-0292924-A1);

Aco: Aco терминирующая последовательность из Yarrowia Aco гена (номер доступа GenBank AJ001300)

Плазмиду pZKD2-5U89A2 расщепляли AscI/SphI и потом использовали для трансформации штамма Y4259U2 в соответствии с разделом Общие методы. Трансформированные клетки поимещались на МС пластинки, и данные пластинки выдерживали при 30°C в течение от 3 до 4 суток. Отдельные колонии повторно наносили на МС пластинки, и результирующие колонии использовали для инокуляции жидкой МС. Жидкие культуры встряхивали при 250 оборотов/минуту в течение 2 суток при 30°C. Клетки собирали путем центрифугирования, ресуспендировали в HGM, и потом встряхивали при 250 оборотов/минуту в течении 5 суток. Данные клетки собирали путем центрифугирования, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и впоследствии анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ анализы показали, что большинство из выбранных 96 штаммов вырабатывали 40-46% ЭПК от всех липидов. Четыре штамма, обозначенные как Y4305, Y4306, Y4307 и Y4308, вырабатывали около 53,2%, 46,4%, 46,8%, и 47,8% ЭПК от всех липидов, соответственно. Полный липидный профиль Y4305 следующий: 16:0 (2,8%), 16:1 (0,7%), 18:0 (1,3%), 18:1 (4,9%), 18:2 (17,6%), АЛК (2,3%), ЭДК (3,4%), ДГЛК (2,0%), АРК (0,6%), ЭТК (1,7%), и ЭПК (53,2%). Полный липидный % от сухого веса клетки (dcw) составлял 27,5.

Конечный генотип штамма Y4305 относительно Yarrowia lipolytica ATCC #20362 дикого типа был SCP2- (YALI0E01298g), YALI0C18711g-, Pex10-, YALI0F24167g-, неизвестен 1-, неизвестен 3-, неизвестен 8-, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, EXP1::FmD12S::Aco, YAT1::FmD12S::Lip2, YAT1::ME3S::Pex16, EXP1::ME3S::Pex20 (3 копии), GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, GPD::EgD9eS::Lip2, YAT1::EgD9eS::Lip2, YAT1::E389D9eS::OCT, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip1 (2 копии), EXP1::EgD8M::Pex16, GPDIN::EgD8M::Lip1, YAT1::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::EgD5S::Aco, EXP1::EgD5S::ACO, YAT1::RD5S::OCT, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco, YAT1::YlCPT1::ACO, GPD::YlCPT1::ACO.

Генерация штамма Y4305U3 (Ura3-): Для разрушения Ura3 гена в штамме Y4305, конструкцию pZKUM (ФИГ.50A; SEQ ID NO:353) использовали для интеграции Ura3 мутантного гена в Ura3 ген штамма Y4305. Всего 8 трансформантов, выращенных на МС+5-FOA пластинках, повторно наносили на МС пластинки и МС+5-FOA пластинки, раздельно. Все 8 штаммов имели Ura- фенотип (т.е. клетки могли расти на МС+5-FOA пластинках, но не на МС пластинках). Клетки соскребали с МС+5-FOA пластинок, и липиды экстрагировали. Жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и впоследствии анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ анализы выявили присутствие 37,6%, 37,3% и 36,5% ЭПК в pZKUM трансформантах № 1, № 6 и № 7, выращенных на МС+5-FOA пластинках. Эти три штамма были обозначены как штаммы Y4305U1, Y4305U2 и Y4305U3, соответственоо (коллективно, Y4305U).

Конструирование Yarrowia lipolytica штамма Y4184U

Y. lipolytica штамм Y4184U был использован как хозяин в Примерах 32, 33, 34 и 51, infra. Штамм Y4184U был получен из Y. lipolytica ATCC #20362, и он способен вырабатывать около 31% ЭПК относительгно полного количества липидов посредством экспрессии дельта-9-элонгаза/дельта-8-десатуразного пути.

Разработка штамма Y4184U потребовала конструирования штамма Y2224, штамма Y4001, штамма Y4001U, штамма Y4036, штамма Y4036U и штамма Y4069 (supra). Дальнейшая разработка штамма Y4184U (см. схему на ФИГ.51A) потребовала конструирования штамма Y4084 (вырабатывающего 14% ЭПК), штамма Y4084U1 (Ura-), штамма Y4127 (вырабатывающего 18% ЭПК), штамма Y4127U2 (Ura-), штамма Y4158 (вырабатывающего 25% ЭПК), штамма Y4158U1 (Ura-), и штамма 4184 (вырабатывающего 30,7% ЭПК). Хотя детали, касающиеся трансформации и селекции ЭПК-производящих штаммов разрабатывались позднее, и штамм Y4069 здесь не конструировался, методология, использованная для изоляции штамма Y4084, штамма Y4084U1, штамма Y4127, штамма Y4127U2, штамма Y4158, штамма Y4158U1, штамма Y4184, и штамма Y4184U, отвечала описанной при конструировании штамма Y4305, supra.

Вкратце, конструкцию pZP3-Pa777U (ФИГ.47A; SEQ ID NO:338) использовали для интеграции трех дельта-17-десатуразных генов в Pox3 локусы (номер доступа GenBank AJ001301) штамма Y4069, в результате чего произошла изоляция штамма Y4084 (вырабатывающего 14% ЭПК). Штамм Y4084U1 был создан посредством временной экспрессии Cre рекомбиназного фермента в конструкцию pY117 (ФИГ.47B; SEQ ID NO:343) внутри штамма Y4084 с образованием Ura- фенотипа. Конструкцию pZP2-2988 (ФИГ.48A; SEQ ID NO:345) затем использовали для интеграции одного дельта-12-десатуразного гена, двух дельта-8-десатуразных генов, и одного дельта-9-элонгазного гена в Pox2 локусы (номер доступа GenBank AJ001300) штамма Y4084U1, что привело к изоляции штамма Y4127 (вырабатывающего 18% ЭПК). Yarrowia lipolytica штамм Y4127 был депонирован в Американское собрание типовых культур 29 ноября 2007 года и носит обозначение ATCC PTA-8802.

Штамм Y4127U2 был создан путем разрыва Ura3 гена в штамме Y4127 посредством конструкции pZKUE3S (ФИГ.48B; SEQ ID NO:351), включающей химерный EXP1::ME3S::Pex20 ген, нацеленный на Ura3 ген. Конструкцию pZKL1-2SP98C (ФИГ.49B; SEQ ID NO:352) использовали для интеграции одного дельта-9-элонгазного гена, одного дельта-8-десатуразного гена, одного дельта-12-десатуразного гена, и одного Yarrowia lipolytica диацилглицерин холинфосфотрансферазный гена (CPT1) в Lip1 локусы (номер доступа GenBank Z50020) штамма Y4127U2, что привело к изоляции штамма Y4158 (вырабатывающего 25% ЭПК). Потом была создана Ura- производная (т.е. штамм Y4158U1), посредством трансформации конструкцией pZKUE3S (ФИГ.48B; SEQ ID NO:351), включающей химерный EXP1::ME3S::Pex20 ген, нацеленный на Ura3 ген. Наконец, конструкция pZKL2-5U89GC (ФИГ.49A; SEQ ID NO:348) была использована для интеграции одного дельта-9-элонгазного гена, одного дельта-8-десатуразного гена, одного дельта-5-десатуразного гена, и одного Yarrowia lipolytica CPT1 в Lip2 локусы (номер доступа GenBank AJ012632) Y4158U1, что привело к изоляции штамма Y4184.

Полный липидный профиль штамма Y4184 следующий: 16:0 (3,1%), 16:1 (1,5%), 18:0 (1,8%), 18:1 (8,7%), 18:2 (31,5%), АЛК (4,9%), ЭДК (5,6%), ДГЛК (2,9%), АРК (0,6%), ЭТК (2,4%), и ЭПК (28,9%). Полный липидный % от веса сухой клетки (dcw) составлял 23,9.

Конечный генотип штамма Y4184 относительно Yarrowia lipolytica ATCC #20362 дикого типа был неизвестен 1-, неизвестен 2-, неизвестен 4-, неизвестен 5-, неизвестен 6-, неизвестен 7-, YAT1::ME3S::Pex16, EXP1::ME3S::Pex20 (2 копии), GPAT::EgD9e::Lip2, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBA::EgD9eS::Pex20, YAT1::EgD9eS::Lip2, GPD::EgD9eS::Lip2, GPDIN::EgD8M::Lip1, YAT1::EgD8M::Aco, EXP1::EgD8M::Pex16, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip1 (2 копии), GPM/FBAIN::FmD12S::Oct, EXP1::FmD12S::Aco, YAT1::FmD12::Oct, GPD::FmD12::Pex20, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::EgD5S::Aco, YAT1::Rd5S::Oct, FBAIN::EgD5::Aco, FBAINm::PaD17::Aco, EXP1::PaD17::Pex16, YAT1::PaD17S::Lip1, YAT1::YlCPT1::Aco, GPD::YlCPT1::Aco.

Для разрыва Ura3 гена в штамме Y4184 конструкцию pZKUM (ФИГ.50A; SEQ ID NO:353) использовали с целью интеграции Ura3 мутантного гена в Ura3 ген штамма Y4184.

Всего 11 трансформантов, выращенных на МС+5-FOA пластинках, собирали и повторно наносили на МС пластинки и МС+5-FOA пластинки, раздельно. Все 11 штаммов имели Ura- фенотип (т.е. клетки могли расти на МС+5-FOA пластинках, но не на МС пластинках). Данные клетки соскребали с МС+5-FOA пластинок; липиды экстрагировали; и жирнокислотные метиловые эфиры готовили путем трансэтерификации и впоследствии анализировали с помощью газового хроматографа Hewlett-Packard 6890 GC.

ГХ анализы выявили присутствие 11,2%, 10,6%, и 15,5% ЭПК в № 7, № 8 и № 10 трансформантах с pZKUM, выращенных на МС+5-FOA пластинках. Эти три штамма были обозначены как штаммы Y4184U1, Y4184U2 и Y4184U4, соответственно (коллективно, Y4184U).

ПРИМЕР 1

Условия выращивания Euglena gracilis, липидный профиль и выделение мРНК

Euglena gracilis получали из лаборатории Dr.Richard Triemer at Michigan State University (East Lansing, MI). Из 10 мл активно растущей культуры 1 мл аликвотного количества переносили в 250 мл Euglena gracilis (Eg) среды в 500 мл стеклянную бутылку. Eg среду готовили путем комбинирования 1 г ацетата натрия, 1 г мясного бульона (U126-01, Difco Laboratories, Detroit, MI), 2 г Bacto® триптона (0123-17-3, Difco Laboratories) и 2 г Bacto® дрожжевого экстракта (0127-17-9, Difco Laboratories) в 970 мл воды. После фильтрационной стерилизации 30 мл почвенно-водного супернатанта (15-3790, Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC) добавляли асептическим образом с получением конечной Eg среды. Культуры Euglena gracilis выращивали при 23°С c 16 часовым световым, 8 часовым темновым циклом на протяжении 2 недель без перемешивания.

Через 2 недели 10 мл культуры извлекали для липидного анализа и центрифугировали при 1800xg в течение 5 минут. Таблетку промывали один раз водой и повторно центрифугировали. Результирующую таблетку высушивали в течение 5 минут под вакуумом, ресуспендировали в 100 мкл триметилсульфоний гидроксида (ТМСГ) и инкубировали при комнатной температуре на протяжении 15 минут при встряхивании. После этого добавляли 0,5 мл гексана, и бутылочки инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре при встряхивании. Жирнокислотные метиловые эфиры (5 мкл, выделенных из гексанового слоя) отделяли и анализировали количественно с использованием газового хроматографа марки Hewlett-Packard 6890 Gas Chromatograph, снабженного капиллярной колонкой из плавленного кварца Omegawax 320 (корпорация Supelco Inc., Cat. No. 24152). Температура печи была запрограммирована на выдержку при 220°С в течение 2,7 минут, повышение до 240°С при 20°С/минуту и последующую выдержку еще на протяжении 2,3 минут. Газ-носитель подавался с помощью водородного генератора Whatman. Время удерживания было сравнимо с таковым для метиловых эфиров стандартов, которые имеются в продаже (Nu-Chek Prep, Inc. Cat. No. U-99-A), и результирующая хроматограмма показана на ФИГ.27.

Оставшуюся двухнедельную культуру (240 мл) таблетировали путем центрифугирования при 1800xg на протяжении 10 минут, промывали один раз водой и подвергали повторному центрифугированию. Полную РНК экстрагировали из результирующей таблетки с использованием RNA STAT-60мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 реагента (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX) и в соответствии с представленным протоколом производителя (использовать 5 мл реагента, растворенную РНК в 0,5 мл воды). Таким способом из таблетки получали 1 мг полной РНК (2 мг/л). мРНК выделяли из 1 мг полной РНК с использованием набора mRNA Purification Kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) в соответствии с протоколом производителя. Таким способом получили 85 мкг мРНК.

ПРИМЕР 2

Синтез Euglena gracilis кДНК, конструирование библиотеки и секвенирование

кДНК библиотеку генерировали с использованием набора Cloneminerмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 cDNA Library Construction Kit (Cat. No. 18249-029, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) и согласно представленного протокола производителя (Version B, 25-0508). С использованием метода не-радиомечения кДНК была синтезирована из 3,2 мкг мРНК (описано выше) с использованием Biotin -attB2-Oligo(dT) праймера. После синтеза первой и второй цепи добавляли и лигировали адаптер attB1, и кДНК фракционировали по размерам с использованием колонковой хроматографии. ДНК из фракций 7 и 8 (размеры варьировали от приблизительно 800 до 1500 bp) концентрировали, рекомбинировали в pDONRмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 222 и трансформировали в клетки E. coli ElectroMAXмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 DH10Bмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 T1 Phage-Resistant (Invitrogen Corporation). Библиотека Euglena gracilis получила название eeg1c.

Для секвенирования клоны сначала восстанавливали из архивных глицериновых культур, выращенных/замороженных в 384-ячеечных планшетах с морозильной средой. С использованием автоматического QPix® сборщика колоний (Genetix) клетки собирали и потом использовали для инокуляции 96-ячеечных планшетов с глубокими ячейками, которые содержали LB+50 мкг/мл канамицина. После выращивания в течение 20 часов при 37°С клетки таблетировали путем цетрифугирования и сохраняли при температуре -20°С. Потом плазмиды выделяли на автомате Eppendorf 5Prime с использованием модифицированного мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 минипрепмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 (miniprep) метода щелочного лизиса в 96-ячеечном формате (Eppendorf PerfectPrep®). В кратком изложении, для облегчения удаления клеточных остатков после осаждения ацетатом применяли фильтр и вакуумный коллектор. Плазмидную ДНК потом связывали на втором фильтровальном планшете прямо из фильтрата, промывали, высушивали и элюировали.

Плазмиды подвергали конечному секвенированию в 384-ячеечных планшетах с использованием затравленного вектором M13F Universal праймера (SEQ ID NO: 1) и набора для секвенирования ABI BigDye version 3 Prism. Для реакции секвенирования использовали 100-200 нг матрицы и 6,4 пмоль праймера, и следующие условия реакции повторялись 25 раз: 96°С на протяжении 10 с, 50°С на протяжении 5 с и 60°С на протяжении 4 минут. После этанольной очистки продукты цикличной реакции секвенирования растворяли и анализировали на автоматических секвенаторах Perkin-Elmer ABI 3700.

ПРИМЕР 3

Идентификация C20-ПНЖК элонгирующих ферментных гомологов из Euglena gracilis кДНК библиотеки eeg1c

кДНК клоны, кодирующие С20-ПНЖК элонгирующие ферментные гомологи (т.е. мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 С20-ПНЖК Eloмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ), идентифицировали путем проведения поисков с помощью BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993)) на подобие относительно последовательностей, которые содержатся в базе данных BLAST мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 nrмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 (которая включает все не-избыточные GenBank CDS трансляции, последовательности, полученные из 3-мерной структуры Brookhaven Protein Data Bank, последний основной выпуск базы данных протеиновых последовательностей SWISS-PROT, базы данных EMBL и DDBJ). кДНК последовательности, полученные в Примере 2, проанализировали на подобие относительно всех доступных ДНК последовательностей, которые содержатся в мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 nrмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 базе данных, с использованием алгоритма BLASTN, представленного Национальным центром биотехнологической информации (НЦБИ). ДНК последовательности транслировали во всех рамках считывания и сравнивали на совпадение со всеми доступными протеиновыми последовательностями, которые содержатся в мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 nrмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 базе данных, с использованием алгоритма BLASTX (Gish и States, Nat. Genet. 3:266-272 (1993)), представленного НЦБИ. Для удобства, Р-значения (вероятность) наблюдения просто случайного совпадения кДНК последовательности с последовательностью, которая содержится в поисковых базах данных, определяется с помощью BLAST, здесь приводятся как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 pLogмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 значения, которые представляют собой отрицательные значения логарифма приведенного Р-значения. Соответственно, чем больше значение pLog, тем больше вероятность того, что кДНК последовательность и мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 попаданиемультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 BLAST представляют гомологичные протеины.

BLASTX поиск с использованием нуклеотидной последовательности из клона eeg1c.pk005.p14.f выявил подобие протеина, кодированного кДНК, с C20-PUFA Elo из Pavlova sp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) (номер доступа НЦБИ AAV33630 (GI 54307108), локус AAV33630, CDS AY630573; Pereira et al., Biochem. J. 384:357-366 (2004)). Последовательность участка кДНК инсерта из клона eeg1c.pk005.p14.f показана в SEQ ID NO:3 (5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конец кДНК инсерта). Потом была получена полная последовательность инсерта (т.е. eeg1c.pk005.p14.f), и она показана в SEQ ID NO:4. Последовательность для кодирующей последовательности (CDS) приведена в SEQ ID NO:5. Последовательность для соответствующей выведенной аминокислотной последовательности показана в SEQ ID NO:6.

Секвенирование всего инсерта (FIS) проводили с использованием модифицированного транспозиционного протокола. Клоны, идентифицированные для FIS, восстанавливали из архивных глицериновых запасов как отдельные колонии, и плазмидная ДНК была изолирована путем щелочного лизиса. Плазмидные матрицы подвергали транспозиции через Template Generation System (TGS II) транспозиционный набор (Finnzymes Oy, Espoo, Finland) согласно протоколу изготовителя. Подвергнутые транспозиции ДНК трансформировали в ЕН10В электро-компетентные клетки (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) путем электропорации. Множественные трансформаниты произвольно выбирали из каждой транспозиционной реакции, была создана плазмидная ДНК, и матрицы подвергали секвенированию как и выше (ABI BigDye v3.1) наружу от сайта транспозиционного события, с использованием уникальных праймеров SeqE (SEQ ID NO:7) и SeqW (SEQ ID NO:8).

Данные по последовательностям собирали (ABI Prism Collections software (программа)) и составляли с использованием программы составления последовательностей Phrap (P. Green, University of Washington, Seattle). Результаты рассматриваются Consed sequence editor (D. Gordon, University of Washington, Seattle) для окончательного издания.

Аминокислотная последовательность, определенная в SEQ ID NO:6, оценивалась BLASTP и дала значение pLog 61,22 (значение Е составляет 6е-62) относительно Pavlova sp. CCMP459 C20-PUFA Elo (SEQ ID NO:2). Аминокислотная последовательность, определенная в SEQ ID NO:6, на 45,1% идентична с Pavlova sp. CCMP459 C20-PUFA Elo последовательностью (SEQ ID NO:2), с использованием метода Jotun Hein. Вычисления процента идентичности последовательностей, проведенные с помощью метода Jotun Hein (Hein, J. J., Meth. Enz. 183:626-645 (1990)), были проведены с использованием программы MegAlignмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 v6.1 вычислительного биоинформационного пакета LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) с параметрами по умолчанию для парной группировки (KTUPLE=2). Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:6, на 40,4% идентична с Pavlova sp. CCMP459 C 20-PUFA Elo последовательностью (SEQ ID NO:2), с использованием метода Clustal V. Вычисления процента идентичности последовательности, которые проводились по методу Clustal V (Higgins, D.G. та Sharp, P.M., Comput. Appl. Biosci. 5:151-153 (1989); Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191 (1992)), осуществлялись с использованием программы MegAlignмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 v6.1 вычислительного биоинформационного пакета LASARGENE (supra) с параметрами по умолчанию для парной группировки (KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 и DIAGONALS SAVED=5 и GAP LENGTH PENALTY=10). BLAST оценки и вероятности указывают на то, что фрагмент данной нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:5) кодирует весь Euglena gracilis C20-PUFA Elo ген, обозначенный здесь как EgC20 elo1.

ФИГ.25 резюмирует BLAST данные и данные по процентам идентичности для EgC20elo1 (Пример 3), EgDHAsyn1 (Пример 4, infra), и EgDHAsyn2 (Пример 5, infra).

ПРИМЕР 4

Идентификация ДГК синтазы 1 (EgDHAsyn1) из Euglena gracilis кДНК библиотеки eeg1c

КДНК клоны, кодирующие дополнительные C20-ПНЖК Elo гомологи, идентифицировали путем проведения BLAST поисков в отношении подобия последовательностям, которые содержатся в базе данных BLAST мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 nrмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 как описано в Примере 3.

BLASTX поиск с использованием нуклеотидных последовательностей из клона eeg1c.pk016.e6.f (также называемого pKR1049) выявил подобие протеина, кодированного кДНК, с C20-PUFA Elo из Pavlova sp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) (номер доступа НЦБИ AAV33630 (GI 54307108), локус AAV33630, CDS AY630573; Pereira et al., Biochem. J. 384:357-366 (2004)). Последовательность части кДНК инсерта из клона eeg1c.pk016.e6.f показана в SEQ ID NO:9 (5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конец кДНК инсерта). Затем была получена последовательность всего инсерта (eeg1c.pk016.e6.f:fis) как описано в Примере 3 и показано в SEQ ID NO:10. Кодирующая последовательность приведена в SEQ ID NO:11; соответствующая выведенная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:12.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:12, оценивалась BLASTP, как описано в Примере 3. Интересно отметить, что SEQ ID NO:12, как было найдено, была схожа как с C20-PUFA Elo, так и с дельта-4-десатуразой жирных кислот. N-окончание SEQ ID NO:12 (приблизительно от аминокислот 16-268) дает значение pLog 60,30 (E значение 5e-61; 124/258 идентичные аминокислоты; 48% идентичность), относительно Pavlova sp. CCMP459 C20-PUFA Elo (SEQ ID NO:2). C-окончание SEQ ID NO:12 (приблизительно от аминокислот 253-793) дает E значение 0,0 (535/541 идентичные аминокислоты; 98% идентичность), относительно дельта-4-десатуразы жирных кислот из Euglena gracilis (SEQ ID NO:13) (номер доступа НЦБИ AAQ19605 (GI 33466346), локус AAQ19605, CDS AY278558; Meyer et al., Biochemistry 42(32):9779-9788 (2003)). Данные и вероятности BLAST указывают на то, что текущий фрагмент нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:11) кодирует весь Euglena gracilis C20-PUFA Elo/delta-4-десатуразы жирных кислот слитый ген, названный здесь Euglena gracilis ДГК синтаза 1 (EgDHAsyn1).

Аминокислотная последовательность EgDHAsyn1 (SEQ ID NO:12) на 47,8% идентична C20-PUFA Elo из Pavlova sp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) и на 98,9% идентична дельта-4-десатуразы жирных кислот из Euglena gracilis (SEQ ID NO:13), при использовании метода Jotun Hein, как описано в Примере 3. Аминоксилотная последовательность EgDHAsyn1 (SEQ ID NO:12) на 41,2% идентична C20-PUFA Elo из Pavlova sp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) и на 98,9% идентична дельта-4-десатуразы жирных кислот из Euglena gracilis (SEQ ID NO:13), с использованием метода Clustal V, как описано в Примере 3.

ФИГ.27 резюмирует данные BLASTP и значения процентов идентичности для EgDHAsyn1 (Пример 4), EgC20elo1 (Пример 3, supra) и EgDHAsyn2 (Пример 5, infra).

ПРИМЕР 5

Идентификация ДГК синтазы 2 (EgDHAsyn2) из Euglena gracilis кДНК библиотеки eeg1c

Приблизительно 17000 клонов Euglena gracilis кДНК библиотеки eeg1c высевали на три больших квадратных (24 см×24 см) чашки Петри (Corning, Corning, NY), каждая из которых содержала LB+50 мкг/мл канамицин агаровой среды. Клетки выращивали в течение ночи при 37°C, и потом чашки охлаждали до комнатной температуры.

Лифтинг колоний:

Биодин B 0,45 мкм мембрану (Cat. No. 60207, Pall Corporation, Pensacola, FL) обрезали до приблизительных размеров 22 см×22 см и потом ее осторожно помещали на верхнюю часть агара для удаления пузырьков воздуха. После инкубирования в течение 2 минут при комнатной температуре мембрану пометили для ориентации, подняли с помощью пинцета и поместили верхней стороной колоний на фильтровальную бумагу, пропитанную 0,5 M гидроксида натрия и 1,5 M хлорида натрия. После денатурации в течение 4 минут гидроксид натрия нейтрализовали путем помещения мембраны на фильтровальную бумагу, пропитанную 0,5 M Tris-HCL (pH 7.5) и 1,5 M хлорида натрия, на 4 минуты. Эту стадию повторяли, и мембрану в течение непродолжительного времени ополаскивали в 2X SSC буфере (20X SSC представляет собой 3M хлорид натрия, 0,3 M цитрат натрия; pH 7,0) и высушивали на воздухе на фильтровальной бумаге.

Гибридизация:

Мембраны подвергали предварительной гибридизации при 65°C в 200 мл гибридизационного раствора в течение 2 часов. Гибридизационный раствор содержал 6X SSPE (20X SSPE представляет собой 3 M хлорид натрия, 0,2 M фосфат натрия, 20 мМ ЭДТА; pH 7,4), 5X реактив Денгардта (Denhardt) (100X реактив Денгардта представляет собой 2% (вес/объем) фикола, 2% (вес/объем) поливинилпирролидона, 2% (вес/объем) ацетилированного альбумина бычьей сыворотки), 0,5% натрия додецила сульфата (НДС), 100 мкг/мл ДНК срезанных молок лосося и 5% декстрана сульфата.

ДНК зонд сделали с использованием NcoI/NotI ДНК фрагмента, очищенного агарозным гелем, который содержал EgDHAsyn1*, из pY141 (см. Пример 10), меченый P32 dCTP с использованием системы для радиоактивного мечения RadPrime DNA Labeling System (Cat. No. 18428-011, Invitrogen, Carlsbad, CA), следуя инструкциям производителя. Невнедренный P32 dCTP отделяли с использованием колонки NICK (Cat. No. 17-0855-02, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) в соответствии с инструкциями производителя. Данный зонд денатурировали в течение 5 минут при 100°C, помещали на лед на 3 минуты, и его половину добавляли к гибридизационному раствору.

Указанную мембрану подвергали гибридизации с зондом в течение ночи при 65°C при легком встряхивании и на следующий день промывали два раза 2X SSC, который содержал 0,5% SDS (каждый раз по 5 минут), и два раза 0,2X SSC, который содержал 0,1% SDS (каждый раз по15 минут). После промывания гиперпленку (Cat. No. RPN30K, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) экспонировали на мембране на протяжении ночи при -80°C.

Исходя из расположения пластинок с экспонированной гиперпленкой, позитивные колонии собирали с использованием затупленного конца пипетки Пастера в 1 мл воды и встряхивали. Было сделано несколько разбавлений, и их высевали на небольшие круглые чашки Петри (82 мм), содержавшие LB среду плюс 50 мкг/мл канамицина, с получением около 100 хорошо изолированных колоний на отдельной чашке. Лифтинги были сделаны как описано выше, за исключением использования мембранных кружочков NytranN (Cat, No. 10416116, Schleicher & Schuell, Keene, NH), и гибридизация проводилась в 100 мл с использованием меченого радиоактивным изотопом зонда, который остался. Таким способом был идентифицирован один позитивный клон (обозначенный как eeg 1c-1). На плазмиду из eeg 1c-1 можно также ссылаться как на pLF116.

Индивидуальные позитивные клоны выращивали при 37°C в LB+50 мкг/мл канамициновой жидкостной среде, и плазмиду подвергали очистке с использованием набора QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen Inc.) согласно протоколу производителя. Плазмидный инсерт секвенировали как описано в Примере 2, с помощью набора для секвенирования ABI BigDye version 3 Prism с использованием затравленного вектором M13F Universal праймера (SEQ ID NO:1), затравленного вектором M13rev праймера (SEQ ID NO:14), и затравленного поли(A) хвостом праймера WobbleT олигонуклеотидов. Вкратце, WobbleT праймер является эквимолярной смесью 21mer поли(T)A, поли(T)C, и поли(T)G, использованной для секвенирования 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конца кДНК клонов. На основе первичных данных по секвенированию подобным образом была получена дополнительная последовательность внутреннего фрагмента с использованием олигонуклеотидов oEUGel4-1 (SEQ ID NO:15), EgEloD4Mut-5 (SEQ ID NO:16), oEUGel4-2 (SEQ ID NO:17), EgDHAsyn5' (SEQ ID NO:18), и EgDHAsyn3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 (SEQ ID NO:19). Таким способом была получена последовательность полного инсерта eeg1c-1, и она показана в SEQ ID NO:20. Кодирующая последовательность представлена в SEQ ID NO:21, и соответствующая выведенная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:22.

Аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:22, оценивали с помощью BLASTP, как описано в Примере 3. Как и в случае для EgDHAsyn1, SEQ ID NO:22, как было установлено, схожа как с C20-PUFA Elo, так и с дельта-4-десатуразы жирных кислот. N-окончание SEQ ID NO:22 (приблизительно от аминокислот 41-268) дает значение pLog 61,0 (E значение 1e-61; 118/231 идентичные аминокислоты; 51% идентичности) относительно Pavlova sp. CCMP459 C20-PUFA Elo (SEQ ID NO:2). C-окончание SEQ ID NO:22 (приблизительно от аминокислот 253-793) дает E значение 0,0 (541/541 идентичные аминокислоты; 100% идентичность), относительно аминокислотной последовательности дельта-4-десатуразы жирных кислот из Euglena gracilis (SEQ ID NO:13). BLAST данные и вероятности указывают, что текущий нуклеиновокислотный фрагмент (SEQ ID NO:21) кодирует весь Euglena gracilis C 20-ПНЖК Elo/дельта-4-десатуразы жирных кислот слитый ген, названный здесь Euglena gracilis ДГК синтаза 2 (EgDHAsyn2).

Аминокислотная последовательность EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) на 48,2% идентична C20-PUFA Elo из Pavlova sp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) и на 100% идентична дельта-4-десатуразы жирных кислот из Euglena gracilis (SEQ ID NO:13), при использовании метода Jotun Hein, как описано в Примере 3. Аминокислотная последовательность EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) на 41,2% идентична C20-PUFA Elo из Pavlova sp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) и на 100% идентична дельта-4-десатуразы жирных кислот из Euglena gracilis (SEQ ID NO:13), при использовании метода Clustal V, как описано в Примере 3.

ФИГ.25 резюмирует данные BLASTP и значения процентов идентичности для EgDHAsyn2 (Пример 5), EgC20 elo1 (Пример 3, supra) и EgDHAsyn1 (Пример 4, supra).

ПРИМЕР 6

Основной структурный анализ EgC 20elo1, EgDHAsyn1 и EgDHAsyn2

При 100% аминокислотной идентичности между С-окончанием EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) и Euglena gracilis дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:13) выполняли группирование нуклеотидной последовательности между кодирующей последовательностью EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:21), кДНК последовательностью Euglena gracilis дельта-4-десатуразы (SEQ ID NO:23) (номер доступа НЦБИ AY278558 (GI 33466345), локус AY278558, Meyer et al., Biochemistry 42(32):9779-9788 (2003)), и кодирующей последовательностью Euglena gracilis дельта-4-десатуразы (SEQ ID NO:24) (Meyer et al., supra). Группировку последовательностей проводили с использованием метода Clustal W (с помощью программы MegAlignмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 v6.1 вычислительного биоинформационного пакета LASERGENE (DNASTAR Inc.) с параметрами по умолчанию для множественной группировки (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=0.5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB). Группировка показана на ФИГ.2. Кодирующая последовательность Euglena gracilis дельта-4-десатуразы названа EgD4_CDS (SEQ ID NO:24); Euglena gracilis дельта-4-десатуразная кДНК последовательность названа EgD4_cDNA (SEQ ID NO:23); и Euglena gracilis ДГК синтаза 2 кодирующая последовательность названа EgDHAsyn2_CDS (SEQ ID NO:21).

5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конец (где последовательности расходятся) и 3мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 конец (где последовательности идентичны) данной группировки усечены с целью размещения группировки на одной странице. ФИГ.2 иллюстрирует, что последовательности сильно расходятся от начала Euglena gracilis дельта-4-десатуразной кДНК до 83 bp вверх от инициирующего сайта кодирующей последовательности (CDS). Из группировки очевидно, что нуклеотидные последовательности для EgD4_cDNA и EgDHAsyn2_CDS идентичны от 83 bp вверх от CDS инициирующего сайта Euglena gracilis дельта-4-десатуразной кДНК последовательности (SEQ ID NO:23), который эквивалентен нуклеотиду 674 EgDHAsyn2_CDS (SEQ ID NO:21), вплоть до конца данных последовательностей. В точной точке дивергенции NotI сайт может быть найден в Euglena gracilis кДНК последовательности (нуклеотиды 656-663 SEQ ID NO:23), и поскольку NotI линкеры были использованы в первичном клонировании Euglena gracilis дельта-4-десатуразной кДНК (см. Meyer et al., supra), вероятно, что то, что было клонировано, являлось незавершенным, с неполной длиной транскрипта для EgDHAsyn2.

Аминокислотную последовательность EgDHAsyn1 (SEQ ID NO:12) сравнивали с EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) и EgC20elo1 (SEQ ID NO:6) с использованием метода Clustal W, как описано выше, и группировка показана на ФИГ.3A и 3B. В сравнении с EgDHAsyn1 и EgDHAsyn2, EgC20elo1 имеет делецию 7 аминокислот (т.е. A L D L A [V/I] L) и 2 других аминокислотных субституции (т.е. W47R, T48I; основываясь на нумерации для EgDHAsyn1) в N-окончании. После аминокислоты 289 EgC20elo1, данные последовательности сильно различаются при сравнении с ДГК синтазами. EgDHAsyn1 и EgDHAsyn2 имеют дополнительные 498 аминокислоты в своих C-терминальных концах с гомологией к дельта-4-десатуразы жирных кислот, тогда как EgC20elo1 заканчивается после лишь 9 дополнительных аминокислот. Аминокислотные последовательности EgDHAsyn1 (SEQ ID NO:12) и EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) имеют 8 аминокислотных различий между данными 2 последовательностями (т.е. V25I, G54V, A305T, L310P, V380I, S491N, I744T, R747P; основываясь на нумерации для EgDHAsyn1). Последние четыре различия имеют место в дельта-4-десатуразнром домене.

ФИГ.4A и 4B изображают группировку Clustal W N-окончания EgDHAsyn1 (SEQ ID NO:12) и N-окончания EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) с EgC20elo1 (SEQ ID NO:6), Pavlova sp. CCMP459 C20-PUFA Elo (SEQ ID NO:2), Ostreococcus tauri ПНЖК элонгазой 2 (SEQ ID NO:25) (номер доступа НЦБИ AAV67798 (GI 55852396), локус AAV67798, CDS AY591336; Meyer et al., J. Lipid Res. 45(10):1899-1909 (2004)), и Thalassiosira pseudonana ПНЖК элонгазой 2 (SEQ ID NO:26) (номер доступа НЦБИ AAV67800 (GI 55852441), локус AAV67800, CDS AY591338; Meyer et al., J. Lipid Res., supra). На ФИГ.4A и 4B, Pavlova, Ostreococcus, и Thalassiosira протеины помечены как PavC20elo, OtPUFAelo2, и TpPUFAelo2, соответственно.

ФИГ.5A, 5B, 5C, и 5D изображают группировку Clustal W C-окончания EgDHAsyn1 (EgDHAsyn1_CT; аминокислот 253-793 SEQ ID NO:12; N-окончание EgDHAsyn1 не показано и обозначено как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) и C-окончания EgDHAsyn2 (EgDHAsyn2_CT; аминокислот 253-793 of SEQ ID NO:22, N-окончание EgDHAsyn2 не показано и обозначено как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ) с Euglena gracilis дельта-4-десатуразы жирных кислот (SEQ ID NO:13), Thraustochytrium aureum дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:27) (номер доступа НЦБИ AAN75707(GI 25956288), локус AAN75707, CDS AF391543), Schizochytrium aggregatum дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:28) (PCT публикация № WO 2002/090493), Thalassiosira pseudonana дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:29) (номер доступа НЦБИ AAX14506 (GI 60173017), локус AAX14506, CDS AY817156; Tonon et al., FEBS J. 272 (13):3401-3412 (2005)), и Isochrysis galbana дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:30) (номер доступа НЦБИ AAV33631 (GI 54307110), локус AAV33631, CDS AY630574; Pereira et al., Biochem. J. 384(2),:357-366 (2004) и PCT публикация № WO 2002/090493). На ФИГ.5A, 5B, 5C, и 5D, Euglena, Thraustochytrium, Thalassiosira, и Isochrysis протеины помечены как EgD4, TaD4, TpD4, и IgD4, соответственно.

ФИГ.6 изображает группировку внутренних фрагментов EgDHAsyn1 (помеченных как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn1_ NCT.proмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; аминокислот 253-365 SEQ ID NO:12) и EgDHAsyn2 (помеченных как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 EgDHAsyn2_NCT.proмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 ; аминокислот 253-365 SEQ ID NO:22), разделяющих как C 20-элонгазный участок так и дельта-4-десатуразный домен (основываясь на гомологии), с C-окончаниями C20-элонгаз (EgC20elo1_CT.pro, аминокислот 246-298 SEQ ID NO:6; PavC20elo_CT.pro, аминокислот 240-277 SEQ ID NO:2; OtPUFAelo2_CT.pro, аминокислот 256-300 SEQ ID NO:25; TpPUFAelo2_CT.pro, аминокислот 279-358 SEQ ID NO:26) и N-окончанием дельта-4-десатураз (EgD4_NT.pro, аминокислот 1-116 SEQ ID NO:13; TaD4_NT.pro, аминокислот 1-47 SEQ ID NO:27; SaD4_NT.pro, аминокислот 1-47 of SEQ ID NO:28; TpD4_NT.pro, аминокислот 1-82 of SEQ ID NO:29; IgD4_NT.pro, аминокислот 1-43 of SEQ ID NO:30). Законсервированный мотив в C-окончании всех C20-элонгазных доменов (т.е. VLFXXFYXXXY (SEQ ID NO:180)) также присутствует в N-окончании EgD4 и дополнительно подтверждает то, что EgD4 является неполной ДГК синтазой.

В C-окончании C20-элонгазного домена для каждого из EgDHAsyn1, EgDHAsyn2, и EgC20elo1 имеется повторяющаяся последовательность, содержащая NG мотив (т.е. KNGK (SEQ ID NO:186), PENGA (SEQ ID NO:187), PENGA (SEQ ID NO:187), и PCENGTV (SEQ ID NO:191); названные NG повторами и обозначенные на ФИГ.6 линиями под последовательностью). Хотя данная структура встречается с высокой вероятностью появления, просмотр NG повторяющегося участка с использованием Prosite показывает последний NG мотив (т.е. NGTV) в этой области как потенциальный N-гликосилирующий сайт. После NG повторяющегося участка как EgDHAsyn1 так и EgDHAsyn2 содержат обогащенный пролином участок (помеченный как мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 Обогащенный пролином линкермультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 на ФИГ.6), который может действовать в качестве линкера между C20-элонгазным и дельта-4-десатуразным доменами. Данный линкер может играть роль в поддержании C20-элонгазного и дельта-4-десатуразного доменов в соответствующей структурной ориентации, позволяющей осуществлять эффективную конверсию ЭПК в ДГК. Хотя обогащенный пролином линкер показан на ФИГ.6 как тянущийся от P304 до V21 (основываясь на нумерации для EgDHAsyn1), NG повторяющийся участок также в некоторой степени обогащен пролином и может также играть роль в этой линкерной функции.

Нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательности для обогащенного пролином линкера EgDHAsyn1, как определено на ФИГ.6, представлены в SEQ ID NO:197 и SEQ ID NO:198, соответственно. Нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательности для обогащенного пролином линкера EgDHAsyn2, как определено на ФИГ.6, представлены в SEQ ID NO:199 и SEQ ID NO:200, соответственно.

Нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательности для EgDHAsyn1 C20-элонгазного домена из EgDHAsyn1 представлены в SEQ ID NO:201 и SEQ ID NO:202, соответственно. Нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательности для EgDHAsyn2 C20-элонгазного домена представлены в SEQ ID NO:203 и SEQ ID NO:204, соответственно.

ПРИМЕР 7

Конструирование pDMW263

Плазмида pY5-30 (которая была ранее описана в патенте США № 7259255 (на содержание которого здесь сделана ссылка)), представляет собой челночную плазмиду, которая может воспроизводиться как в E. coli так и в Yarrowia lipolytica. Плазмида pY5-30 содержит следующее: Yarrowia автономную репликационную последовательность (ARS18); ColE1 плазмидный источник репликации; ампициллин-резистентный ген (AmpR), для селекции в E. coli; Yarrowia LEU2 ген, для селекции в Yarrowia; и химерный TEF::GUS::XPR ген. Плазмиду pDMW263 (SEQ ID NO:31) была создана из pY5-30 путем замены TEF промотора Yarrowia lipolytica FBAINm промотором (патент США № 7202356), с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области. Вкратце, FBAIN промотор локализован в 5мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 верхнем нетранслированном участке перед 'ATGмультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных   кислот, патент № 2517608 инициирующим трансл