штамм вируса гриппа а/17/mallard/нидерланды/00/95(h7n3) для производства живой и производства инактивированной гриппозных вакцин

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3), задепонированный в Государственной коллекции вирусов Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН под № 2717, для производства живой интраназальной и производства инактивированной гриппозных вакцин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа, вызванного пандемически опасными вирусами гриппа птиц. Для производства интраназальной живой гриппозной вакцины (ЖГВ) или инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ) предложен реассортантый штамм вируса гриппа А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3).

Несмотря на широкое распространение пандемического вируса гриппа подтипа А(H1N1), вирусы птичьего гриппа подтипов A(H5N1), A(H7N1) и A(H9N2) продолжают вызывать вспышки заболевания среди людей. Вирусы подтипа Н7 могут получать широкое распространение среди домашней птицы, приобретая при этом свойства повышенной патогенности в результате дополнительной адаптации и рекомбинационного процесса, как было показано во время вспышек, вызванных A(H7N7), A(H7N1) и A(H7N4) - в Европе и Австралии. Необходимость разработки соответствующих вакцинных препаратов, в том числе, и для борьбы с вирусами птичьего гриппа, отражена в приказе Минздрава РФ [Приказ № 40 МЗ РФ от 28.12.2004].

В настоящее время вакцинные штаммы для ЖГВ получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83]. Гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от безвредного ХА донора аттенуации. Из полученных реассортантов выбирают вакцинный кандидат с формулой генома 6:2, наиболее отвечающий требованиям антигенной специфичности, характерной для родительского вируса «дикого» типа, а также соответствующий признакам холодовой адаптации, по способности к репродукции при пониженной температуре.

Применяемые в настоящее время для профилактики эпидемического гриппа А вакцинные штаммы подтипов H1N1 и H3N2 не могут вызывать защитную реакцию в случае широкомасштабной вспышки, вызванной вирусами гриппа с подтипом гемагглютинина подтипа Н7, к которым у подавляющего большинства населения нет иммунитета.

В настоящее время известен реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) [Патент № 2318871, опубл. 10.03.2008], предназначенный как для производства живой, так и инактивированной вакцины против птичьего гриппа подтипа Н5. Но он не может дать профилактический эффект в случае распространения вирусов гриппа подтипа Н7.

За рубежом для подготовки вакцинного штамма ЖГВ подтипа Н7 на основе донорского штамма А/Энн Арбор/6/60(H2N2) был использован высокопатогенный вирус А/Нидерланды/219/03(H7N7) [Min J., J. Virol. 2010 Nov; 84(22): 11950-60].

Известен также температурочувствительный реассортантный штамм А/17/дикая утка/Нидерланды/00/84(H7N3), полученный методами классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) на основе донорского штамма Лен/17 [Дешева А., ЖМЭИ- 2009. - № 1. - С.31-36]. Однако указанный реассортантный штамм не вполне удовлетворял требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам, включаемым в состав ЖГВ для иммунизации людей. В первую очередь, штамм был недостаточно холодоадаптированным: разность в репродуктивной активности при пониженной до 25°С температуре для штамма А/17/дикая утка/Нидерланды/00/84(H7N3) составляла 4,2 Ig ЭИД ₅₀ (rct₂₅-признак), в то время как установлено, что для холодоадаптированных вакцинных штаммов эта разница не должна превышать 3,0 Ig ЭИД₅₀ [Science, 1959. - Vol.129. - № 3358. - Р.1287-1288]. Помимо этого, прямое нуклеотидное секвенирование показало присутствие нуклеотидной замены G A в положении 543 гена НА реассортантного штамма А/17/дикая утка/Нидерланды/00/84(H7N3) по сравнению с геном НА «дикого» вируса птичьего гриппа. Указанная замена сопровождалась аминокислотным замещением глицина на глютаминовую кислоту в положении 214, что приводило к изменению полярности и заряда аминокислоты вблизи рецепторосвязывающего участка НА. Такие замены являются нежелательными для вакцинных штаммов, так как могут отрицательно влиять на их антигенную специфичность, вызывая снижение защитной эффективности вакцинации.

Поскольку задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение полностью холодоадаптированного вакцинного штамма с гемагглютинином подтипа Н7 для иммунизации людей, были проведены дополнительные этапы клонирования. Для этого был выбран метод так называемых «коротких пассажей» [Fazekas de St. Groth, Intervirology, 1975. - Vol.5. - P.335-341] при пониженной температуре, когда смесь вирусных клонов пассируют в чувствительной системе (куриные эмбрионы, КЭ) в присутствии селектирующих факторов при укороченном сроке инкубации. Смесь вирусных клонов, полученных после скрещивания донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) и апатогенного вируса гриппа птиц А/mallard/Нидерланды/12/00 (H7N3) в аллантоисной полости 10-11-дневных куриных эмбрионов (КЭ), прошедшую 2 селективных пассажа и одно клонирование в присутствии антисыворотки к донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) при пониженной до 25°С температуре инкубации, дополнительно клонировали 2 раза при пониженной до 30°С температуре в течение укороченного до 28 часов срока, увеличив конечное разведение до 1:10⁹. С помощью подбора именно этих условий удалось выделить клон А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3), который отличался своими характеристиками от прочих, например наиболее выраженными признаками холодовой адаптации, поскольку уровень его репродукции при пониженной до 25°С температуре был в 100 раз выше, чем у полученных ранее реассортантных вирусов (табл.1).

Таблица 1
Репродукция при пониженной температуре клонов A(H7N3)
Реассортант ( № клона)	Количество пассажей в процессе реассортации	Репродуктивная активность ЭИД50/0,2 мл		RCT25 ЭИД50/0,2 мл
		34°С	34°С
8/4	6	8,1±0,5	4,1±0,4	4,0
8/6	6	8,7±0,2	4,7±0,2	4,0
8/10	6	8,3±0,1	4,0±0,1	4,3
9/5 АЛ 7/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3)	7 (включая 2 «укороченных»)	8,7±0,2	6,4±0,2	2,3

Высокий уровень холодовой адаптации реассортанта А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) был обоснован молекулярно-генетическими методами. Секвенирование реассортантного штамма выявило наличие в гене внутреннего белка NP дополнительного нуклеотидного замещения С-1066-А, которое приводило к аминокислотной замене Leu-341-lie. Эта замена ранее была выявлена у дополнительно аттенуированного донорского штамма, А/Ленинград/134/47/57(H2N2), который был получен после ряда пассажей штамма А/Ленинград/134/17/57(H2N2) в КЭ при пониженной температуре и в дальнейшем широко использовался в течение ряда лет при подготовке ЖГВ для иммунизации детей младшего возраста [Klimov et al., 1992].

Анализ клонированного вакцинного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) был выполнен также с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) [Klimov A.I., J. Virol. Method. - 1995. - № 55. - P. 445-446]. Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, M и NS обрабатывали соответственно эндонуклеазами рестрикции Tru9l, Hindlll, BamHI, Asnl, EcoRI, Pvul, Ncil соответственно. Дополнительно копии сегментов РВ1, PA и M были обработаны рестриктазами BstXI, Asnl и BciVI. Рестрикционный анализ ДНК-копий сегментов РНК (Табл.2) и прямое нуклеотидное секвенирование показали, что реассортант А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) имеет состав генома 6:2. Все кодирующие нуклеотидные замещения, характерные для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2), обнаружены в генах внутренних и неструктурных белков реассортантного штамма A/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3).

Нуклеотидное секвенирование гена НА реассортантного вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) не выявило отличий в нуклеотидном составе от родительского вируса «дикого» типа. Проведенное секвенирование гена NA реассортантного вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) также не выявило отличий в нуклеотидном составе от родительского вируса «дикого» типа.

Таким образом, полученный реассортантный штамм характеризуется сочетанием требуемых для вакцинных штаммов ЖГВ признаков: холодовой адаптацией и идентичностью поверхностных антигенов родительскому вирусу «дикого» типа. В то же время полученный штамм обладает высокой репродуктивностью в куриных эмбрионах (>10⁹ ЭИД₅₀/мл), что позволяет использовать его при производстве инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ), где требуется получение большого количества вирусного материала для его последующей очистки и концентрации.

Принадлежность гемагглютинина родительскому штамму «дикого» типа А/mallard/Нидерланды/12/00(H7N3) у реассортанта была подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Изучение антигенных свойств показало, что апатогенный птичий вирус А/mallard/Нидерланды/12/00 (H7N3) и его ХА реассортант являются антигенно идентичными (взаимодействие с гомологичной типоспецифической сывороткой согласно ТУ 42-14-79-79). Показатели взаимодействия реассортанта А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3), так же как и родительского штамма А/mallard/Нидерланды/12/00(H7N3) с антисыворотками хорьков, полученными к вирусам, выделенным от людей во время вспышки в Нидерландах в 2003 году, включая и случай летальной инфекции (А/Нидерланды/219/03), отличались от гомологичных титров соответствующих антигенов не более чем в 2 раза (табл.2).

Таблица 2
Антигенная специфичность апатогенного вируса птичьего гриппа А/mallard/Нидерланды/12/00 (H7N3) и его ХА реассортанта
Вирусы	Подтип	Антисыворотки хорьков
		Mallard/NL/00	NL/219/03	NL/230/03	NL/231/03	Нормальная сыворотка
A/mallard/H идерланды/12/00 (Mallard/NL/00)	H7N3	320	640	160	40	5
А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (6:2 реассортант)	H7N3	320	320	160	40	5
А/Нидерланды/219/2003 (NL/219/03)	H7N7	320	640	160	40	5
А/Нидерланды/230/2003 (NL/230/03)	H7N7	320	640	320	80	5
А/Нидерланды/231/2003 (NL/231/03)	H7N7	320	320	160	80	5

Для оценки генетической стабильности реассортантного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) проводили 5 серийных пассажей в 10-11-дневных КЭ. После выделения вирусной РНК проводили ОТ-ПЦР рестрикционный анализ. Было показано, что нуклеотидные замещения, ранее охарактеризованные для генов внутренних и неструктурных белков донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), присутствуют в геноме вакцинного штамма после пяти пассажей в КЭ (Табл.3).

Таблица 3
Нуклеотидные замещения, обнаруженные в генах внутренних и неструктурных белков реассортантного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) до и после пассажей в куриных эмбрионах
Вирус	Характеристика	Nucleotide positions in "internal" genes
		РВ2	РВ1		PA		м		NS
		1459	819	1795	107	1045	68	969	798
А/Ленинград/134/57 (H2N2)	Эпидемический вирус	G	G	G	Т	G	А	G	G
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)	ХА донор аттенуации	Т	Т	А	С	Т	G	А	А
A/17/mallard/ Нидерланды/00/95 (H7N3) до пассажей в КЭ	Реассортантный вакцинный штамм	Т	Т	А	C	Т	G	А	А
А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) после 5 пассажей в КЭ		Т	Т	А	C	Т	G	А	А

В таблице 4 представлены показатели репродукции в КЭ реассортантного штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3). Показано, что реассортант А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) проявлял высокую репродуктивную активность при оптимальной температуре инкубации 34°С. Подобно ХА родительскому штамму А/Ленинград/134/17/57(H2N2), реассортантный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) хорошо репродуцировался при пониженной до 25-26°С температуре и практически утратил способность к размножению при 40°С (ts-, ca- фенотип). Родительский вирус «дикого» типа А/mallard/Нидерланды/12/00(H7N3), напротив, отличался температуроустойчивостью и отсутствием репродукции при 25°С.

Таблица 4
Репродуктивная активность реассортанта А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) при различных температурных режимах инкубации в куриных эмбрионах
Вирус (характеристика)	Репродуктивная активность при температуре (Ig ЭИД50/1 мл)				Фенотип
	34°С	40°С	25°С	26°С
А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) (6:2 реассортант)	9,2±0,5	1,8±0,2	6,9±0,5	7,5±0,1	Ts, ca
А/Ленинград/134/17/57(H2N2) (ХА донор аттенуации)	9,5±0,3	1,6±0,1	7,0±0,1	8,7±0,6	7s, ca
А/mallard/Нидерланды/12/00 (H7N3) (апатогенный птичий штамм)	8,7±0,2	8,0±0,2	<1,5	1,6±0,1	Non-ts, non-ca

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму - антигенной специфичностью гемагглютинина вируса «дикого» типа А/mallard/Нидерланды/12/00(H7N3), структурой генома, необходимой для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью, хорошей адаптацией к пониженной температуре культивирования, что коррелирует с аттенуацией, характерной для аттенуированного донорского штамма. Характеристики нового штамма -холодоадаптированность и высокая репродуктивная активность в куриных эмбрионах - позволяют использовать его для производства как живой, так и инактивированной гриппозной вакцины.

Штамм депонирован в коллекции Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН под № 2717. Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА.

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°С в течение 48 часов - 9,2 Ig ЭИД ₅₀/ 0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Паспорт на вакцинный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3)

прилагается (стр.7).

Результаты доклинического изучения заявляемого штамма.

Пример 1. Изучение безвредности реассортанта А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) проводили на курах породы белый Леггорн. Каждой из восьми 5-недельных кур вводили внутривенно 0,2 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с инфекционной активностью вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) 10^8,1 ЭИД₅₀/0,2 мл. В течение 10 суток проводили наблюдение за развитием признаков инфекции (респираторная инфекция, слабость, диарея, цианоз в области инокуляции, отек головы, неврологические симптомы). Индекс патогенности рассчитывали как 0 - отсутствие симптомов, 1 - развитие признаков инфекции, 2 - тяжелая инфекция, 3 - летальный исход.

В течение 10 суток после в/в инокуляции реассортантным штаммом А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) ни у одного животного не было зарегистрировано признаков развития инфекции (индекс патогенности 0). Таким образом, реассортантА/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) был безвредным при внутривенном введении курам.

На третьи сутки после интраназального введения в дозе 6 Ig ЭИД ₅₀/мл реассортант А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) не был выделен из ротоглоточных и клоакальных смывов.

Выделение вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) из смывов после интраназального введения курам
№ животного	Ротоглототка	Клоака
1001	100.9/мл	100.9/мл
1002	100.9/мл	100.9/мл
1003	100.9/мл	100.9/мл
1004	100.9/мл	100.9/мл
1005	100.9/мл	100.9/мл
1006	100.9/мл	100.9/мл
1007	100.9/мл	100.9/мл
1008	100.9/мл	100.9/мл
1009	100.9/мл	100.9/мл
1010	100.9/мл	100.9/мл

В течение 14 дней не наблюдалось признаков развития инфекции, вирус не был выделен из ротоглоточных и клоакальных смывов и тканей легких, почек, сердца и головного мозга. На 14-е сутки после интраназального введения не зарегистрировано сероконверсий. Таким образом, эффект при введении реассортантного вируса А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) курам был подобен действию вирусов сезонного гриппа с низким риском инфицирования.

Пример 2. Заявляемый вакцинный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95 (H7N3) безвреден для мышей и морских свинок.

Суммарные данные определения острой токсичности на мышах и морских свинках
Вид животных	Вирус	Доза	Пало/выжило	Среднее изменение веса, г
Мыши	A/17/mallard/ Нидерланды/ 00/95 (H7N3)	0,5 мл внутрибрюшинно	0/10	+0,8
Морские свинки	A/17/mallard/ Нидерланды/ 00/95 (H7N3)	5 мл подкожно	0/3	+11,7

При гистологическом исследовании показано, что введение вакцинного штамма A/17/mallard/Нидерланды/00/95 лабораторным животным - мышам, не вызывает защитной реакции в виде - воспаления, альтеративных проявлений - в виде дистрофических и деструктивных изменений в печени, почках, селезенке, сердечной мышце - миокарде, стромальном компоненте внутренних органов. Кроме того, не отмечается дистрофических изменений нейронов, глиальных элементов и нарушений кровообращения микроциркуляторного русла головного мозга. Таким образом, применение вакцины не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности вакцины А/17/mallard/Нидерланды/00/95.

Пример 3. Вакцинный штамм A/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) иммуногенен для мышей.

Показано, что вакцинный штамм А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) проявляет иммуногенные свойства при интраназальном введении мышам. Среднегеометрические титры антигемагглютинирующих антител возрастают в группе иммунизированных мышей, при этом двукратная иммунизация является более эффективной.

Результаты РТГА с сыворотками мышей, иммунизированных интраназально 107 Ig ЭИД 50 штамма А/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3) через 4 недели после иммунизации
Группы	СГТ
	До иммунизации	Однократно	Двукратно
ЖГВ	5,0	8,7	40,0
Плацебо (раствор ФБ)	5,0	5,0	5,0