ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ
НОВЫЕ ПАТЕНТЫ, ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ
БИБЛИОТЕКА ПАТЕНТОВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

пептид-антагонист активности интерлейкина-15

Классы МПК:C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот
C07K14/54 интерлейкины (ИЛ)
A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот
A61K38/20 интерлейкины
A61P35/00 Противоопухолевые средства
A61P19/02 для лечения заболеваний суставов, например артритов, артрозов
A61P17/06 противопсориатические средства
Автор(ы):, , , , ,
Патентообладатель(и):СЕНТРО ДЕ ИНХЕНЬЯРИЯ ХЕНЕТИКА И БИОТЕКНОЛОХИЯ (CU)
Приоритеты:
подача заявки:
2009-09-30
публикация патента:

Изобретение относится к области молекулярной фармакологии и, в частности, к пептиду, представляющему собой производное последовательности интерлейкина-15 (IL-15), оптимизированное для ингибирования биологической активности этого соединения. В изобретении показано, что пептид при связывании с субъединицей alfa рецептора (IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 ) ингибирует пролиферацию Т-клеток, индуцированную IL-15, индукцию фактора опухолевого некроза пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 (TNFпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 ), вызываемую IL-15, и экспрессию IL-8 и IL-6, вызываемую IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 . Также изобретение относится к применению пептида при лечении патологий, при которых аномальная экспрессия IL-15 или IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 связана с течением заболевания, такого как ревматоидный артрит (AR) и рак предстательной железы. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 6 пр.

Рисунки к патенту РФ 2506270

пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной фармакологии и, в частности, к пептиду, представляющему собой производное интерлейкина-15 (IL-15), которое препятствует связыванию цитокина с субъединицей alfa рецептора (IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 ) и вследствие этого является полезным для лечения заболеваний, связанных с аномальной экспрессией IL-15 и/или IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 в течение заболевания.

Предшествующий уровень техники

Цитокин, известный как IL-15, представляет собой гликопротеин с массой 14-15 кДа, который был идентифицирован одновременно для двух групп в качестве фактора, активирующего T-клетки (Grabstein, K.H. et al., Science, 1994, 264, 965-968; Burton, J.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4935-4939). Информационная рибонуклеиновая кислота (иРНК) IL-15 присутствует в широкой гамме клеток и тканей, однако белок редко встречается в супернатанте культур клеток, экспрессирующих транскрипт, так как существует сильный посттранкрипционный контроль его экспрессии на уровне трансдукции и внутриклеточного трафика (Bamford R.N. et al., J. Immunol. 1998, 160: 4418-4426; Kurys G. et al., J. Biol. Chem. 2000, 275: 30653-30659). Кроме того, описано, что IL-15 может существовать в активной в форме в качестве белка мембраны (Musso et al., Blood, 1999, 93: 3531-3539), и совсем недавно отмечено, что он может функционировать в качестве лиганда или в качестве рецептора. IL-15, экспрессируемый в качестве белка, присущего мембранам, действует в качестве рецептора и при связывании с растворимой субъединицей alfa рецептора индуцирует секрецию провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8, активацию киназ, называемых MAPK и FAK, и стимулирует миграцию в клетках карциномы простаты (PC-3), экспрессирующих IL-15 в клеточной мембране (Budalgian et al., J. Biol. Chem. 2004, 40: 42192-42201).

Биологические эффекты IL-15 в качестве лиганда опосредованы через связывание IL-15 с рецептором в клеточной мембране, состоящим из трех субъединиц, называемых пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 , пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 и пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 . Три субъединицы могут коэкспрессироваться в одной и той же клетке, или может происходить так, что IL-15, связанный с субъединицей alfa, присутствует в клетках, которые экспрессируют только субъединицы пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 и пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 , и индуцирует в данной клетке сигнализацию, известную как феномен транс-сигнализации (Burkett et al., J. Exp. Med. 2004, 200: 825-834). Субъединица пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора взаимодействует также с IL-2, представляющим собой цитокин, относительно которого IL-15 проявляет большую структурную гомологичность, а субъединица пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 взаимодействует также с другими цитокинами, такими как IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-21. IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 специфична к IL-15, с которым связывается с очень высоким сродством (Kd=10-11), и может находиться в виде рецептора мембраны или в растворимой форме (Budagian V. et al., J. Biol. Chem. 2004, 24: 40368-75; Mortier et al., J. of Immunology, 2004, 173: 1681-1688).

Замечены высокие уровни экспрессии IL-15, связанные с патогенезом аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как болезнь Крона (Kirman I., Am. J. Gastroenterol. 1996, 91: 1789-1794), псориаз (Rückert R., J. Immunol. 2000, 165: 2240-2250), лейкемии (Yamada Y., Leukemia and Limphoma, 1999, 35: 37-45) и ревматоидный артрит (AR) (McInnes I.B., Immunology Today, 1998, 19: 75-79).

McInnes и соавт. в случае AR нашли аномальность экспрессии IL-15, высокие концентрации в синовиальной жидкости и экспрессию цитокина в клетках синовиальной мембраны. Они предположили, что IL-15 предшествует фактору опухолевого некроза пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 (TNFпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 ) в каскаде цитокинов, предложив механизм, зависящий от клеточного контакта, по которому T-клетки, активированные IL-15, индуцируют синтез TNFпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 макрофагами. Кроме того, предложено, что IL-15 действует как важный фактор в миграции T-клеток к синовиальной жидкости (McInnes et al., Nat. Med. 1997, 3: 189-195). Ziolkowska и соавт. сообщили, что IL-15 индуцирует экспрессию IL-17 в суставе больных AR, при этом известно, что данный цитокин стимулирует высвобождение синовиоцитами медиаторов воспаления, таких как IL-6, IL-8, фактор стимуляции колоний гранулоцитов-макрофагов, и простагландина E2, предполагая важную роль IL-15 в патогенезе AR (Ziolkowska et al., J. Immunology 2000, 164: 2832-2838). Недавно было доказано, что IL-15 обостряет артрит, индуцированный коллагеном (по-английски collagen induced artritis, сокращенно CIA) у мыши, трансгенно инфицированной данным цитокином (Yoshihara et al., Eur. J. Immunol. 2007, 37: 2744-2752). Все упомянутые факты приводят к мысли, что действие антагониста IL-15 имеет терапевтический потенциал при лечении AR и других аутоиммунных и воспалительных заболеваний.

Ранее описано, что остаток аспарагиновой кислоты в положении 56 молекулы IL-15 играет важную роль в связывании с субъединицей пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора, а остаток глутамина в положении 156 играет важную роль в связывании с субъединицей пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора. Мутеины (измененные белки) этих аминокислот ведут себя как соединения-антагонисты IL-15, которые связываются с субъединицей пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора и препятствуют трансдукции сигнала через субъединицы пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 и пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 . Антитела, которые распознают данные аминокислоты, также действуют как антагонисты IL-15 (патенты US 6177079, US 6168783, US 6013480, US 6001973, US 9706931, международная заявка WO 9741232).

Использование антагонистов цитокина было эффективным в моделях на животных в случае псориаза (Villadsen L.S. et al., J. Clin. Invest. 2003, 112: 1571-1580) и в случае AR (Ferrari-Lacraz S. et al., J. Immunol. 2004, 173: 5818-5826).

Ruchatz и соавт. воспроизвели растворимый фрагмент IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 мыши и показали, что введение данного фрагмента ингибирует артрит, индуцированный коллагеном у мышей DBA/1 (Ruchatz H., J. Immunology, 1998, 160: 5654-5660). Позже, было обнаружено, что IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 может действовать как мощный агонист биологической функции IL-15 (Mortier E., J. Biol. Chem. 2006, 281: 1612-1619; Rubinstein M.P., PNAS, 2006, 103: 9166-9171).

Genmab подал заявку на антитела человека, специфичные к IL-15 (WO 03017935), в которой описаны четыре антитела. Два из них, обозначаемые 146B7 и 146H5 и связывающиеся с IL-15 в области, взаимодействующей с субъединицей пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора, ингибируют клеточную пролиферацию, индуцированную IL-15, клеточной линии CTLL-2 и в одноядерных клетках периферической крови (по-английски peripheral blood mononuclear cells , сокращенно PBMC), а антитела, обозначаемые 404A8 и 404E4, пролиферацию не ингибируют. Из этих антител антитело 146B7 под наименованием AMG714 находится в стадии II клинических испытаний по лечению AR, проводимых компанией Amgen.

Bernard и соавт. в 2004 году идентифицировали две последовательности связи IL-15 с субъединицей пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора. Эти последовательности находятся между аминокислотами (aa) от 44 до 52 и от 64 до 68 зрелого белка и описывают мутеины, которые могут действовать как агонисты или антагонисты IL-15 (Bernard J. et al., J. Biol. Chem. 2004, 279: 24313-24322).

Santos и соавт. описали пептид-антагонист IL-15 (WO 2006/029578). Применение пептида малого размера (10 aa) в качестве антагониста IL-15 обладает преимуществом, заключающимся в селективном блокировании связывания IL-15 с субъединицей пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора и в посредничестве или препятствовании действию IL-15, обусловленному взаимодействием с упомянутой субъединицей рецептора.

Однако идентификация пептидных последовательностей антагонистов IL-15, обладающих растворимостью и биологической активностью, большей, чем упомянутый белок, представляет собой единственный значимый факт.

Описание изобретения

Это изобретение предназначено для решения ранее упомянутой проблемы получения пептида, более растворимого и более активного, чем пептид, описанный в WO 2006/029578, за счет уменьшения ингибирующей концентрации 50 или концентрации, вызывающей 50%-е ингибирование (IC50) со 130 до 8 мкМ продукта замещения вторичного Lys аминокислотой Thr и получения димерной формы. Упомянутая последовательность (SEQ ID No. 12), синтезированная в виде линейного пептида, содержащего 10 аминокислот, взаимодействует с субъединицей пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора и проявляет антагонистическую способность по отношению к IL-15.

Оптимизация состояла в осуществлении точечного замещения аминокислот упомянутого пептида с целью идентификации аминокислот, являющихся существенными для его антагонистической активности по отношению к IL-15. При замещении, предусматривавшем изменение заряда, в частном случае вторичного лизина упомянутого пептида треонином с нейтральным зарядом или глутаминовой кислотой, несущей отрицательный заряд, получено увеличение антагонистической активности пептид более чем в 10 раз. Кроме того, было найдено, что димерная форма данного пептида, образованная двумя молекулами пептида при посредстве свободного цистеина, является в 7 раз более активной, чем мономерная форма.

В результате было обнаружено, что, в отношении специфичности, ранее упомянутое замещение позволяет получить пептид, являющийся в 10 раз более активным в испытании на зависящую от IL-15 пролиферацию клеточной линии CTLL-2. Этот пептид сохраняет способность связывания с субъединицей пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора относительно IL-15.

Образующийся пептид, составляющий сущность настоящего изобретения, имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID No. 12 в перечне последовательностей. Это увеличение активности пептида как результат упомянутого замещения Lys аминокислотой Thr оказалось неожиданным. На основании доступной информации специалисты в данной области техники не могли ожидать, что указанное изменение первичной структуры пептида породит настолько заметное увеличение биологической активности пептида, такое как показанное в примерах осуществления настоящего изобретения.

Полученный при посредстве свободного Cys химическим синтезом димер пептида, соответствующий последовательности SEQ ID No. 12 в перечне последовательностей, является в 7 раз более активным, чем мономерная форма, и в 15 раз более активным, чем первоначальный пептид, описанный в WO 2006/029578.

Пептид с аминокислотной последовательностью, зарегистрированной как SEQ ID No. 12, присоединяемый к растворимой цепи alfa соответственно описанному в настоящем изобретении, может ингибировать эффект обратной сигнализации посредством IL-15 мембраны, описанный Budalgian и соавт. в 2004 году (Budalgian et al., J. Biol. Chem. 2004, 40: 42192-42201).

В настоящем изобретении предусмотрено применение упомянутого пептида при лечении AR индивидуально или в комбинации с любым другим приемлемым соединением, таким как, например, стероидные противовоспалительные лекарственные средства (такие как кортикостероиды) и лекарственные средства, изменяющие течение заболевания (например, метотрексат).

Объектом настоящего изобретения является также наружное применение этого пептида при лечении заболеваний, проявляющихся на коже, и в очагах поражения которых обнаруживается экспрессия IL-15 в течение заболевания, таких как псориаз и кожная лимфома Т-клеток.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептид применяют для ингибирования связывания растворимой субъединицы пептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 рецептора с IL-15, экспрессируемым в мембране опухолевой клетки, и ингибирования ее миграции.

Пептид, являющийся объектом настоящего изобретения, может иметь линейную структуру или может быть димеризован и отличается в основном своей антагонистической способностью по отношению к IL-15. С другой стороны, доказан эффект in vitro, вызываемый пептидом по настоящему изобретению в испытании на пролиферацию клеток линии CTLL-2 мыши и линии KiT225 человека лимфоцитарной лейкемии.

Для идентификации пептида, описанного в настоящем изобретении, осуществляли аланиновое картирование пептида, описанного в WO 2006/029578. Каждый измененный пептид синтезировали химическим путем способом синтеза в твердой фазе. Затем очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (по-английски High Performance Liquid Chromatography, сокращенно HPLC (ВЭЖХ)) и анализировали масс-спектрометрически, получая во всех случаях чистоту более 95%. Каждый пептид оценивали относительно его эффективности ингибировать биологическую активность IL-15.

Пептид, являющийся объектом настоящего изобретения, ингибирует экспрессию IL-8, индуцируемую IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 . Тот же самый пептид ингибирует экспрессию IL-6 и высвобождение TNF-alfa (TNFпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 ), индуцируемые IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 .

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептид получали генетической манипуляцией или химическим синтезом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пептид получали в виде димера, образованного двумя молекулами пептида, содержащего аминокислотную последовательность, описанную в перечне последовательностей как SEQ ID No. 12. В особом варианте осуществления димер получали, исходя из двух молекул пептида, димеризуемого при посредстве свободного цистеина.

Объектом настоящего изобретения является также дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), кодирующая пептид с последовательностью SEQ ID No. 12, причем ее продукт экспрессии способен связываться с субъединицей alfa клеточного рецептора интерлейкина-15 или с ее растворимой фракцией и ингибирует биологическую активность интерлейкина-15. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор, содержащий упомянутую последовательность ДНК, может быть использован как альтернатива для экспрессии пептидной последовательности.

Полученные результаты предполагают применение заявленного пептида по настоящему изобретению в качестве терапевтического средства при лечении заболеваний, связанных со сверхэкспрессией IL-15 соответственно упомянутому ранее и в случае которых оправдано использование антагонистов IL-15. Таким образом, объектом настоящего изобретения является также терапевтическая фармацевтическая композиция, способная ингибировать биологическую активность IL-15, зависящую от субъединицы alfa клеточного рецептора интерлейкина-15, отличающаяся тем, что она включает в себя пептид, содержащий аминокислотную последовательность, описанную в перечне последовательностей как SEQ ID No. 12. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтическая фармацевтическая композиция содержит димеризованный пептид. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит мономерный или димерный конъюгированный пептид, или пептид, смешанный с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. В другом варианте осуществления терапевтическая фармацевтическая композиция, способная ингибировать биологическую активность IL-15, зависящую от субъединицы alfa клеточного рецептора интерлейкина-15, содержит цепь нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид (SEQ ID No. 12).

Объектом настоящего изобретения является также применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность, описанную в перечне последовательностей как SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, болезни Крона, псориаза и для лечения рака предстательной железы.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Действие пептида в различных концентрациях на пролиферацию клеток линии CTLL-2, индуцированную IL-15. Клетки CTLL-2 инкубированы с 300 пг/мл IL-15 в комбинации с серийными разведениями пептидов. Пролиферация определена при использовании митохондриального окрашивания посредством 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-бромуродифенилтетразолия (MTT). Фиг.1A: Оценка пептидов SEQ ID No. 4 и SEQ ID No. 5. Фиг.1B: Оценка пептидов SEQ ID No. 2 и SEQ ID No. 3. Фиг.1C: Оценка пептидов SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 и SEQ ID No. 9.

Фиг.2. График, отображающий связывание IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 человека с пептидами. Способом ELISA оценена способность пептидов замещать IL-15 в связи с IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 .

Фиг.3. Действие пептида в различных концентрациях на пролиферацию клеток линии KiT225, индуцированную IL-15. Клетки KiT225 инкубированы с 300 пг/мл IL-15 в комбинации с серийными разведениями пептидов. Пролиферация определена при использовании митохондриального окрашивания посредством MTT.

Фиг.4. Действие пептида на пролиферацию клеток линии CTLL-2, индуцированную IL-15 с различными концентрациями при фиксированной концентрации пептида. Использованные концентрации IL-15: 75 пг/мл (1), 150 пг/мл (2), 300 пг/мл (3).

Фиг.5. График, отображающий ингибирующее действие пептида на индукцию иРНК посредством IL-8 (фиг.5A) и IL-6 (фиг.5B) в клетках клеточной линии PC-3 при инкубации с IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 .

Фиг.6. Ингибирование высвобождения TNF-alfa, индуцированного посредством IL-15, при инкубации клеток синовиальной жидкости с пептидом. Клетки синовиальной жидкости больных AR инкубированы с IL-15 (100 нг/мл) в комбинации с пептидом с концентрацией 65 мкМ в течение 48 ч. Количество TNF-alfa определено способом ELISA. Показаны данные анализов излияния синовиальной жидкости вследствие травмы.

Подробное описание вариантов осуществления/Примеры осуществления

Настоящее изобретение пояснено приведенными далее примерами осуществления.

Пример 1. Оптимизация пептида IL-15, связывающегося с IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 и ингибирующего биологическую функцию IL-15

Планирование эксперимента

Исходя из пептида, заявленного в WO 2006/029578, составляют серию пептидов, в которых каждая аминокислота замещена аланином (Ala). В другой группе пептидов осуществляют замены цистеина (Cys) на Ser и Lys на Thr или Glu.

Синтез пептидов

Пептиды синтезировали по стратегии Fmoc/tBu в шприцах. Использовали смолу Fmoc-AM-MBHA с концентрацией 0,54 ммоль/г, осуществляя синтез при механическом перемешивании. После обработки трифторуксусной кислотой пептиды лиофилизовали и анализировали способами ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Все пептиды были получены с чистотой более 95% при соответствии полученной массы массе, ожидаемой для соответствующей аминокислотной последовательности.

Пример 2. Действие описанных пептидов на пролиферацию клеточных линий CTLL-2 и KiT225

Клетки линий CTLL-2 и KiT225 зависят от IL-15 и пролиферируют в присутствии цитокина. Соединения, которые связываются с IL-15 и препятствуют трансдукции сигнала через рецептор, ингибируют пролиферацию клеток данных линий.

Для оценки нейтрализующей способности пептидов по настоящему изобретению готовили серийные разведения пептидов в 96-луночных культуральных планшетах (Costar, США) в объеме 25 мкл среды RPMI (Gibco), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco). Прибавляли клетки CTLL-2 или KiT225 (предварительно промытые) в количестве 5·103 клеток на лунку и инкубировали в течение 30 мин, затем в каждую из лунок вносили достаточное количество IL-15 до концентрации 300 пг/мл.

Также оценивали антагонистическую способность пептидов, изменяя концентрацию IL-15 при фиксированной концентрации пептида 260 мкМ. Инкубацию осуществляли в течение 72 ч при 37°C в атмосфере с 5% CO2. Для определения пролиферации использовали митохондриальное окрашивание посредством MTT (Cosman et al., Nature, 1984, 312: 768-771). MTT восстанавливали митохондриальной дегидрогеназой живой клетки до пурпурного формазана. Определяли IC50 каждого пептида при концентрации IL-15 300 пг/мл.

Таблица 1

Перечень испытуемых пептидов и значения IC50 , полученные в испытании на пролиферацию клеток линии CTLL-2
Пептид IC50 (мкМ)
KVTAMKCFLL130
KVTAMKCFLA260
KVTAMKCFAL200
KVTAMKCALL0
KVTAMKAFLL0
KVTAMACFLLн/о
KVTAAKCFLL130
KVAAMKCFLL130
KATAMKCFLL130
AVTAMKCFLLн/о
KVTAMKSFLL0
KVTAMTCFLL24,6
KVTAMECFLL0
KVTAMTCYLL57,7
н/о: не определено

Данное испытание осуществляли для оценки всех пептидов, что позволило получить значения IC50, приведенные в таблице 1. Значения IC 50 показывают снижение ингибирующего действия пептида в случае пептидов с заменами Cys-Ala, Cys-Ser, Phe-Ala и Gly-Glu и улучшение данного эффекта почти на 50% в случае пептидов с заменой Leu-Ala. Была достигнута ингибирующая активность в 5 раз больше в случае пептида с заменой Lys-Thr и в 15 раз больше в случае димерной формы пептида с заменой Lys-Thr.

На фиг.1A, 1B и 1C представлено изменение оптической плотности (DO) при 576 нм, полученной для различных концентраций пептида с заменами Phe-Ala, Cys-Ala, Leu1-Ala, Leu2-Ala, Met-Ala, Thr-Ala, Val-Ala. На фиг.3 показано изменение оптической плотности в случае пептида с заменой Lys-Thr в мономерной и димерной форме, при этом видно, что ингибирующее действие зависит от концентрации пептида, а наибольшее ингибирующее действие относится к димерной форме пептида с заменой Lys-Thr.

Также оценивали антагонистическую способность пептидов, изменяя концентрацию IL-15 при фиксированной концентрации пептида. На фиг.4 видно, что антагонистическое действие пептида с заменой Lys-Thr зависит от концентрации IL-15.

Пример 3. Способ конкурентного анализа ELISA для изучения способности пептидов выступать в качестве заместителя в связи с IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270

Пептиды были охарактеризованы в отношении связывания с IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 способом ELISA. Согласно краткому описанию методики 96-луночные планшеты покрывали раствором очищенного IL-15 в PBS и блокировали 1%-м раствором бычьего альбумина в буферном фосфатно-солевом растворе (по-английски Phosphate Buffered Saline, сокращенно PBS). Разведения каждого пептида вносили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Планшет промывали смесью PBS-Tween 20 и инкубировали с IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 -Fc в течение 1 часа при 37°C. Затем промывку повторяли и инкубировали с конъюгатом "anti-Fc-IgG человека-пероксидаза" в течение 1 часа при 37°C. Далее снова промывали и определяли степень прохождения реакции "антиген-антитело" в присутствии субстрата и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB), осуществляя измерение DO при 450 нм. Результаты показаны на фиг.2, при этом видно, что пептид с заменой Cys-Ala (SEQ ID No. 5) не замещает IL-15 в связи с IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 , а пептид с заменой Phe-Ala (SEQ ID No. 4) замещает только в 10% случаев связи.

Пример 4. Оценка действия пептида (SEQ ID No. 12) на экспрессию IL-8 и IL-6 в клетках рака предстательной железы линии PC-3

Оценивали действие пептида (SEQ ID No. 12) на экспрессию IL-8 и IL-6, которая опосредуется в отношении связывания IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 с IL-15, присутствующим в мембране клеток PC-3 (Budagian V. et al., J. Biol. Chem. 2004, 279: 42192-42201). Эксперимент осуществляли в 24-луночных планшетах, инкубируя 1,5·10 6 клеток с пептидами SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 12 с концентрацией 100 мкг/мл и IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 (1 нг/мл) и с комбинациями IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 с пептидами SEQ ID No. 1 и SEQ ID No. 12.

РНК выделяли способом TriReagent (Sigma) и анализировали посредством измерения DO при 260/280 нм и электрофореза в геле агарозы. Осуществляли обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, используя набор Quantitect Reverse Transcription Kit и QuantiTect SYBR Green PCR (QUIAGEN) на установке Rotor Gene 6000.

На фиг.5A и 5B видно, что пептид SEQ ID No. 12 ингибирует транскрипцию провоспалительных цитокинов IL-8 и IL-6, индуцированную IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 .

Пример 5. Ингибирование продуцирования TNF-alfa, индуцированного IL-15, димеризованным пептидом SEQ ID No. 12 в клетках синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом (AR)

После получения информированного согласия отбирали синовиальную жидкость больных AR и инкубировали с гиалуронидазой в количестве 10 мкг на мл жидкости в течение 45 мин при 37°C. После центрифугирования при 1200 оборотов в минуту в течение 10 мин получали клетки синовиальной жидкости.

В 96-луночном планшете инкубировали 2·10 5 клеток на лунку с 50 мкг/мл пептида, 60 нг/мл IL-15 и комбинацией пептида в количестве, превышающем количество IL-15. После инкубации в течение 48 часов отбирали супернатант и хранили при -70°C для последующей его оценки. Количество TNFпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 определяли способом ELISA (R&D DTA50).

На фиг.6 показано, что пептид SEQ ID No. 12 ингибирует секрецию TNFпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 в клетках синовиальной жидкости больного AR.

Пример 6. Модель на мышах SCID ксенотрансплантата псориаза человека

Мышам SCID (в возрасте 2-3 месяцев) трансплантировали участок кожи размером 1,5×1,5 см, полученный от больного псориазом. Через три недели после трансплантации мышей разделили на три группы, получавшие плацебо, получавшие пептид SEQ ID No. 12 с дозой 10 мг/кг массы и получавшие циклоспорин A с дозой 10 мг/кг через день в течение 2 недель. Через неделю после последней инъекции мышей умерщвляли и производили биопсию диаметром 4 мм из каждого ксенотрансплантата. Биопсийный материал фиксировали в формалине, покрывали парафином и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E).

Как результат эксперимента отмечено, что на коже, полученной от больных псориазом, после лечения пептидом SEQ ID No. 12 или его димерной формой наблюдается уменьшение тяжести заболевания, значительное уменьшение плотности эпидермиса, числа воспаленных клеток и колец кератиноцитов, а также степени паракератоза в очагах псориатических поражений.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пептид-антагонист активности интерлейкина-15, отличающийся тем, что он состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID No. 12.

2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он связывается с субъединицей alfa клеточного рецептора интерлейкина-15 (IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 ) или с ее растворимой фракцией.

3. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он ингибирует биологическую активность интерлейкина-15, зависящую от субъединицы alfa рецептора (IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 ).

4. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он ингибирует экспрессию IL-8, индуцированную IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 .

5. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он ингибирует экспрессию IL-6, индуцированную IL-15Rпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 .

6. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он ингибирует высвобождение TNF-alfa (TNFпептид-антагонист активности интерлейкина-15, патент № 2506270 ), индуцированное IL-15.

7. Пептид по пп.1-6, причем пептид получают генетической манипуляцией или химическим синтезом.

8. Пептид по п.7, причем пептид получают в виде димера, образованного двумя молекулами пептида, и причем указанный пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID No. 12.

9. Пептид по п.8, причем димер получают, исходя из двух молекул пептида, димеризуемого при посредстве свободного цистеина.

10. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид с SEQ ID No. 12, причем пептид связывается с субъединицей alfa клеточного рецептора интерлейкина-15 или с ее растворимой фракцией и ингибирует биологическую активность интерлейкина-15.

11. Вектор экспрессии, отличающийся тем, что он содержит последовательность нуклеиновой кислоты по п.10.

12. Терапевтическая фармацевтическая композиция, способная ингибировать биологическую активность IL-15, зависящую от субъединицы alfa клеточного рецептора интерлейкина-15, причем указанная композиция включает по меньшей мере 50 мкг/мл пептида, состоящего из SEQ ID No. 12, и 10% сахарозы.

13. Терапевтическая фармацевтическая композиция по п.12, содержащая пептид с SEQ ID No. 12 в форме димера.

14. Терапевтическая фармацевтическая композиция по п.12, содержащая пептид с SEQ ID No. 12 в форме мономера или конъюгированного димера.

15. Применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита.

16. Применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения болезни Крона.

17. Применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения псориаза.

18. Применение пептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 12, для получения лекарственного средства для лечения рака предстательной железы.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2506270

patent-2506270.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K7/06 содержащие от 5 до 11 аминокислот

Патенты РФ в классе C07K7/06:
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
циклический октапептид, радиофармацевтическое средство на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы -  патент 2528414 (20.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
новый пептид и его применение -  патент 2525913 (20.08.2014)
пептиды и их производные, взаимодействующие с никотиновым ацетилхолиновым рецептором и пригодные для использования в косметологии против мимических и возрастных морщин -  патент 2524428 (27.07.2014)
конъюгаты, содержащие гидрофильные спейсеры линкеров -  патент 2523909 (27.07.2014)
конъюгаты антагониста пептида аналога бомбезина -  патент 2523531 (20.07.2014)
применение производных пептида wnt5-a для лечения меланомы и рака желудка -  патент 2517190 (27.05.2014)
способ получения дегареликса -  патент 2515555 (10.05.2014)
композиции для лечения боли и/или воспаления -  патент 2515054 (10.05.2014)

Класс C07K14/54 интерлейкины (ИЛ)

Патенты РФ в классе C07K14/54:
способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной днк-конструкцией -  патент 2520091 (20.06.2014)
гомогенные препараты il-28 и il-29 -  патент 2518324 (10.06.2014)
способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток рака яичника -  патент 2508298 (27.02.2014)
способ очистки раствора тромбина от инфекционных частиц -  патент 2468032 (27.11.2012)
собачий тимусный стромальный лимфопоэтический белок и его применение -  патент 2457217 (27.07.2012)
соединение, предназначенное для стимуляции пути передачи сигнала через il-15rбета/гамма, с целью индуцировать и/или стимулировать активацию и/или пролиферацию il-15rбета/гамма-положительных клеток, таких как nk-и/или t-клетки, нуклеиновая кислота, кодирующая соединение, вектор экспрессии, клетка-хозяин, адъювант для иммунотерапевтической композиции, фармацевтическая композиция и лекарственное средство для лечения состояния или заболевания, при котором желательно повышение активности il-15, способ in vitro индукции и/или стимуляции пролиферации и/или активации il-15rбета/гамма-положительных клеток и способ получения in vitro активированных nk-и/или t-клеток -  патент 2454463 (27.06.2012)
гетеродимерные полипептиды il-17 a/f и возможности их лечебного применения -  патент 2440134 (20.01.2012)
варианты il-7 со сниженной иммуногенностью -  патент 2437893 (27.12.2011)
выделенный пептид, стимулирующий противоопухолевый иммунный ответ, фармацевтическая композиция на его основе, способ лечения млекопитающего и способ модуляции иммунного ответа -  патент 2425053 (27.07.2011)
варианты ил-21 -  патент 2412199 (20.02.2011)

Класс A61K38/08 пептиды, содержащие 5-11 аминокислот

Патенты РФ в классе A61K38/08:
применение пептида актг (4-7)-пгп гепатопротекторного воздействия -  патент 2528741 (20.09.2014)
циклический октапептид, радиофармацевтическое средство на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы -  патент 2528414 (20.09.2014)
содежащий октреотид состав с замедленным высвобождением со стабильно высоким уровнем воздействия -  патент 2526822 (27.08.2014)
применение опиорфина в качестве психостимулирующего агента -  патент 2526819 (27.08.2014)
способ хирургического лечения острого панкреатита с ранним энтеральным интраоперационным питанием пациента -  патент 2526247 (20.08.2014)
способ лечения болезни альцгеймера -  патент 2526155 (20.08.2014)
новый пептид и его применение -  патент 2525913 (20.08.2014)
пептиды и их производные, взаимодействующие с никотиновым ацетилхолиновым рецептором и пригодные для использования в косметологии против мимических и возрастных морщин -  патент 2524428 (27.07.2014)
ингибиторы протеазы вируса гепатита с и их применение -  патент 2523790 (27.07.2014)
применение аналогов соматостатина при менингиоме -  патент 2523416 (20.07.2014)

Класс A61K38/20 интерлейкины

Патенты РФ в классе A61K38/20:
способ лечения больных с синдромом внутрипеченочной портальной гипертензии -  патент 2529414 (27.09.2014)
комбинированные препараты с антагонистом цитокина и кортикостероидом -  патент 2526161 (20.08.2014)
способ профилактики гнойно-септических осложнений у больных с острым гангренозным холециститом при операции из мини-доступа -  патент 2523629 (20.07.2014)
лечение болезни альцгеймера цитокинами -  патент 2519651 (20.06.2014)
гомогенные препараты il-28 и il-29 -  патент 2518324 (10.06.2014)
способ лечения больных с местно-распространенными формами рака матки -  патент 2514342 (27.04.2014)
способ терапии при маститах у собак -  патент 2513998 (27.04.2014)
применение противомикробного полипептида для лечения микробных нарушений -  патент 2503460 (10.01.2014)
способ лечения больных раком легкого -  патент 2500435 (10.12.2013)
способ лечения вагинальных инфекций -  патент 2491956 (10.09.2013)

Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства

Патенты РФ в классе A61P35/00:
способ лечения рака толстой кишки -  патент 2529831 (27.09.2014)
способ оценки эффекта электромагнитных волн миллиметрового диапазона (квч) в эксперименте -  патент 2529694 (27.09.2014)
новые (поли)аминоалкиламиноалкиламидные, алкил-мочевинные или алкил-сульфонамидные производные эпиподофиллотоксина, способ их получения и их применение в терапии в качестве противораковых средств -  патент 2529676 (27.09.2014)
производные 1, 2-дигидроциклобутендиона в качестве ингибиторов фосфорибозилтрансферазы никотинамида -  патент 2529468 (27.09.2014)
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
модулирующие jak киназу хиназолиновые производные и способы их применения -  патент 2529019 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ лечения местнораспространенного неоперабельного рака поджелудочной железы -  патент 2528881 (20.09.2014)
новые бензолсульфонамидные соединения, способ их получения и применение в терапии и косметике -  патент 2528826 (20.09.2014)

Класс A61P19/02 для лечения заболеваний суставов, например артритов, артрозов

Патенты РФ в классе A61P19/02:
биологический материал, подходящий для терапии остеоартроза, повреждения связок и для лечения патологических состояний суставов -  патент 2529803 (27.09.2014)
способ восстановительного лечения нервно-мышечного аппарата у больных с ложным суставом шейки бедренной кости после эндопротезирования тазобедренного сустава -  патент 2528637 (20.09.2014)
новое производное пиразол-3-карбоксамида, обладающее антагонистической активностью в отношении рецептора 5-нт2в -  патент 2528406 (20.09.2014)
способ приготовления средства, обладающего свойством стимуляции регенерации хрящевой, костной, мышечной тканей и способ стимуляции регенерации хрящевой, костной, мышечной тканей с использованием приготовленного средства -  патент 2527701 (10.09.2014)
ингибиторы поли(адф-рибозо)полимеразы-1 человека на основе производных урацила -  патент 2527457 (27.08.2014)
способ сопроводительного лечения при эндопротезировании крупных суставов -  патент 2527159 (27.08.2014)
способ лечения артрита -  патент 2526201 (20.08.2014)
комбинированные препараты с антагонистом цитокина и кортикостероидом -  патент 2526161 (20.08.2014)
новый пептид и его применение -  патент 2525913 (20.08.2014)
способы контроля и профилактики воспаления и ослабления воспалительных состояний у животных компаньонов -  патент 2525579 (20.08.2014)

Класс A61P17/06 противопсориатические средства



Наверх