способ биоремедиации нефтезагрязненных почвогрунтов

Формула изобретения

1. Способ биоремедиации нефтезагрязненных почвогрунтов, включающий обработку грунтов бакпрепаратом на основе наполнителя и микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве наполнителя используют шлам обогащения обогатительной фабрики (ОФ), а в качестве микроорганизмов используют культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что шлам обогащения ОФ и культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 берут в соотношении 8:1,5:0,5.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии ремедиации загрязненных земель и предназначено для восстановления почв, загрязненных сырой нефтью и нефтепродуктами.

Известен способ очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, предусматривающий обработку очищаемой почвы от нефти и нефтепродуктов микроорганизмами Rhodococcum erythropolis AC-1339 Д с питательной средой. Перед внесением микроорганизмов с питательной средой в очищаемую почву вносят высокомолекулярные кислоты (ВМК) от C₆ до C₂₂ в количестве 0,001-0,002 мас.%, обладающие ростстимулирующим действием, полученные путем окисления керогена сланцев в водно-щелочной среде (патент РФ № 2160718 МПК C02F 3/34).

Недостатком известного способа является применение дорогостоящих ВМК, полученных путем окисления керогена сланцев в водно-щелочной среде.

Известен способ биоремедиации нефтезагрязненных почв путем обработки почвы бакпрепаратами и посеве семян бобовых и злаковых культур растений, предварительно обработанных раствором бакпрепаратов, содержащих Actinomycetes sp. 1-96A АбЗТ Биофлора № В-05 и Azotobacter chroococcum ВКПМ, некорневой подкормкой вегетирующих растений минеральными удобрениями. Для обработки почвы используют вышеуказанные препараты с добавлением дополнительных бакпрепаратов, включающих Bacillus mucitaginosus ВКПМ В-5987 и консорциум ВКПМ 5972, состоящего из Streptococcus thermophitus. Streptococcus bobis, Lactobacillus salivanius rear. salicinicus, Lactobacillus saliresriums var salicinicus, Lactobacillus saliuarius var salivanius, Lactobacillus thermophitus и использование для роста растений активатора Эль-1 заводского изготовления (патент РФ № 2176164 МПК B09C 1/10). Способ может быть использован для последующего восстановления плодородного слоя и растительности.

Недостатком указанного способа является обработка семян жидкими бакпрепаратами, что требует немедленного их внесения в почву, так как от длительного хранения они теряют активность. Поэтому бактериальные препараты можно применять только на ближайшем расстоянии от пункта их приготовления, а на большие расстояния - жидкие препараты изготовлять не рекомендуется. Кроме того, внесение большого количества биопрепаратов (8 видов), а также использование для роста растений активатора Эль-1 заводского изготовления требуются определенные затраты, что удорожает использование данного способа.

Известен способ биологической ремедиации нефтезагрязненных почв (патент РФ № 2290270 МПК B09C 1/10), принятый нами за прототип, заключающийся в том, что почву обрабатывают сухим бакпрепаратом с наполнителем, в котором в качестве микроорганизмов используют штамм Pseudomonas fluorescens КО (ВНИИСХМ Д-619) и штамм Pseudomonas aeruginosa КОА-3 (ВНИИСХМ Д-609) в соотношении 1:1, а в качестве наполнителя используют отходы бурого угля. После обработки почвы ее засевают семенами смеси бобовых и злаковых культур, предварительно обработанных сухим регулятором роста растений, в качестве которого берут бакпрепараты на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 (ВНИИСХМ В-35 Д), Bacillus megaterium KC-1 (ВНИИСХМ В-135 Д) в количестве 2 кг/га и соотношении бактериальных культур 1:1.

Недостатком указанного способа является использование 2-х препаратов, содержащий каждый по 2 вида бактерий, что влияет на удорожание процесса, а также применение 2-х операций: обработка грунтов и обработка семян растений, что еще больше удорожает процесс, а также использование углеотходов бурого угля, которые имеют крупную фракцию 4,5-5,5% в количестве 70%, которую необходимо дробить, что еще удорожает процесс ремедиации нефтезагрязненных почв. Кроме того, в составе отходов бурого угля содержатся оксиды токсичных металлов: меди, хрома, цинка, бария, которые при использовании породы в качестве наполнителя отрицательно действуют на почвенную микрофлору и выращиваемые растения.

Задачей изобретения является разработка технологии биоремедиации нефтезагрязненных почв, обеспечивающих разложение нефтепродуктов в почве с наименьшими затратами как физическими, так и материальными.

Технический результат - одновременная очистка деструктированных почв от нефти и нефтепродуктов и восстановление ее продуктивности с минимальными затратами.

Поставленный технический результат обеспечивается за счет того, что в способе биоремедиации нефтезагрязненных почвогрунтов, включающий обработку грунтов бакпрепаратом на основе наполнителя и микроорганизмов, согласно изобретению в качестве наполнителя используют шлам обогащения ОФ, а в качестве микроорганизмов используют культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539, при этом шлам обогащения ОФ и культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 берут в соотношении 8:1,5:0,5.

Штамм Pseudomonas fluorescens ВКГ депонирован 05.07.2011 г. под регистрационным номером RCAM00538 в коллекции ГНУ ВНИИСХМ (г.Санкт-Петербург). Перспективен для создания микробного препарата для рекультивации и биоремедиации нефтезагрязненных почвогрунтов.

Штамм Azotobacter chroococcum АИН депонирован 05.06.2011 г. под регистрационным номером RCAM00539 в коллекции ГНУ ВНИИСХМ, является сверхпродуцентом полисахаридов. Перспективен для создания микробного препарата для восстановления продуктивности и очистки деструктированных почв от нефти.

Использование бактериальных препаратов Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 для биологической ремедиации нефтезагрязненных почв с наполнителем из шлама обогащения ОФ (обогатительная фабрика) позволяет осуществить за вегетационный период одновременно очистку деструктированных почв от нефти и нефтепродуктов и восстановление ее продуктивности с минимальными затратами, как физическими и материальными.

Гранулометрический состав отходов бурого угля, используемый в качестве наполнителя в прототипе, имеет следующий состав:

4,5-5,5 мм	3,0-3,5 мм	2,0-2,5 мм	1,0-1,5 мм
70%	20%	7%	3%

Данную угольную смесь необходимо при приготовлении препарата дробить до получения фракции размером 1,0-1,5 мм, что значительно удорожает процесс приготовления бакпрепарата, кроме того, приходится осуществлять меры по обеспыливанию помещений.

Используемый шлам обогащения ОФ в предлагаемом изобретении имеет следующий гранулометрический состав:

2,5-3,0 мм	1,5-2,0 мм	0,5-1,0 мм	0,2-0,3 мм
0,5%	3%	87%	9,5%

Шлам обогащения ОФ данного состава используется без дробления, что значительно удешевляет технологию приготовления бакпрепарата.

В составе отходов бурого угля содержатся оксиды токсичных металлов: меди, хрома, цинка, бария (Таблица 1), которые при использовании породы в качестве наполнителя отрицательно действуют на почвенную микрофлору и выращиваемые растения.

В шламе обогащения ОФ (Таблица 1) данные элементы отсутствуют, поэтому данный шлам более пригоден для его использования в качестве наполнителя.

Таким образом, гранулометрический состав шлама обогащения ОФ и его химический состав, отсутствие токсичных оксидов меди, хрома, цинка, бария, а также повышенное количество органического вещества (потери при прокаливании) - 59300 мг/кг по сравнению с угольными отходами, где количество органического вещества намного меньше - 34250 мг/кг, что позволяет использовать шлам обогащения ОФ в качестве наполнителя бакпрепаратов и применять их для биоремедиации и рекультивации нефтезагрязненных почвогрунтов.

Таблица 1
№ п/п	Наименование соединения	Шлам обогащения ОФ (Заявленный способ)		Отходы бурового угля прототип
		мг/кг	%	мг/кг	%
1	Оксид марганца (IV)	100	0,01	300	0,03
2	Оксид меди (II)	-	-	100	0,01
3	Оксид железа (III)	8200	0,82	32600	3,26
4	Оксид кремния (IV)	138000	13,8	573000	57,3
5	Массовая доля влаги (влажность)	731700	73,17	308750	30,87
6	Оксид алюминия	40100	4,01	7500	0,75
7	Оксид кальция	1900	0,19	12100	1,21
8	Оксид магния	1000	0,1	9600	0,96
9	Оксид фосфора (V)	300	0,03	2300	0,23
10	Оксид хрома (III)	-	-	100	0,01
11	Потеря массы при прокаливании	59300	5,93	34250	3,42
12	Оксид цинка	-	-	100	0,01
13	Оксид калия	600	0,06	1900	0,19
14	Оксид натрия	200	0,02	700	0,07
15	Оксид бария	-	-	100	0,01
16	Оксид серы	3600	0,36	6500	0,65

Заявленный способ реализуется следующим образом.

Пример 1. Почву, загрязненную мазутом (содержание мазута 13%), на спланированном и выровненном участке, обрабатываем сухим бакпрепаратом, содержащим наполнитель, в качестве которого использовали шлам обогащения ОФ (угольный штыб), содержащий комплекс всех микроэлементов, необходимых для роста и развития растений, - бактериальные культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538, разлагающую нефтепродукты, и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539, содержащую гуминовые кислоты, стимулирующих рост растений, взятые в соотношении 8:1,5:0,5.

Количество препарата по сухому весу составило 50 кг/га. Бактериальный титр равен 10¹².

После внесения в почву сухих бактериальных препаратов, состоящих из культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 в соотношении 1,5:0,5, проводится рыхление на глубину корнеобитаемого слоя ~15 см для улучшения физического режима влагоемкости и улучшения аэрации.

Через 5 дней обработанный участок засевали смесью семян, состоящей из ржи - 60%, вики - 40%. Контрольный участок загрязненной земли засевали тем же составом семян, в том же количестве, но без обработки бактериальными препаратами.

Опыт проводили в диапазоне температуры окружающей среды от 17 до 25°C. Всходы на опытном участке появились на 6-8 день.

Морфологические и биометрические обследования посевов проводили в процессе роста и развития растений при определении динамики содержания нефтезагрязнителя в почве и микробиологическом анализе почвы. Результаты представлены в таблице 2.

В таблице 2 приведены результаты роста опытных растений в контроле (без обработки бакпрепаратами) в опыте (предлагаемым способом). Результаты опыта сравнивались с прототипом.

Таблица 2
Вариант опыта	Появление всходов, шт.	Плотность травостоя на 1 дм2 через 30 дней, шт.	Число растений после перезимовки
Контроль	единичные	5	«Черный пар»
Прототип	на 4-6 день	75	Густой сплошной газон
Предлагаемый способ	на 3-4 день	92	Очень густой сплошной газон

Из таблицы 2 видно, что в контроле появление всходов было единичным. В прототипе всходы появились на 6-ой день.

Плотность травостоя в контроле через 30 дней составила в количестве 5 шт. на 1 дм ², в прототипе густой сплошной газон, в опыте тоже густой сплошной газон, но рост наземной массы был больше чем в прототипе.

В таблице 3 приведены результаты разложения мазута микроорганизмами.

Были проведены следующие варианты опытов: на почве, незагрязненной мазутом, контроль, без обработки препаратом, по прототипу и предлагаемым способом.

Таблица 3
Вариант опыта	Содержание мазута в почве, %			Динамика численности микроорганизмов в почве в 1 г
	до обработки	через 3 недели	через 3 месяца	до обработки	через 3 недели	через 3 месяца
Почва незагрязненная	-	-	-	5,2·106	6,3·10 6	6,8·106
Контроль	100,0	100,0	98,7	0,1·104	0,1·10 5	0,1·105
Прототип	100,0	75,4	0,08	0,1·104	0,4·10 6	3,7·106
Предлагаемый способ	100,0	22,5	0,005	0,1·104	0,5·107	4,8·10 9

Как видно из таблицы 3, в почве, незагрязненной мазутом, количество бактерий после обработки почвы бакпрепаратом через 3 месяца, возросло с 0,1·10 ⁴ до 0,1·10⁵ в 1 г почвы. Количество мазута в контроле через 3 месяца снизилось со 100 до 98,7%, в прототипе со 100 до 0,08%, в предлагаемом способе через 3 месяца с 100 до 0,005%. В такой же степени наблюдалось увеличение численности микроорганизмов в почве, т.е. в контроле количество микроорганизмов повысилось незначительно за 3 месяца с 0,1·10⁴ до 0,1·10⁵

В прототипе количество микроорганизмов повысилось с 0,1·10⁴ до 3,7·10 ⁶.

В предлагаемом способе через 3 месяца отмечалось значительное повышение количества микроорганизмов с 0,1·10⁴ до 4,8·10⁹.

Пример 2. Почву, загрязненную гудроном (11%), подготовленную и обработанную сухим бакпрепаратом, содержащим наполнитель, в качестве которого использовался угольный штыб (угольный шлам ОФ, содержащий весь комплекс микроэлементов, необходимых для роста и развития растений, бактериальные культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539, взятых в соотношении 8:1,5:0,5. Количество бакпрепаратов составило 50 кг/га с бактериальным титром 10¹². После внесения в почвогрунты сухого бакпрепарата на опытных участках проводилось рыхление на глубину корнеобитаемого слоя - 15 см. Через неделю (7 дней) обработанный участок засевали смесью семян, состоящей из ржи - 60%, вики - 40%. Результаты представлены в таблице 4.

Из таблицы 4 видно, что в контроле, без обработки почвы бакпрепаратами появление всходов отмечалось единичное, плотность травостоя через 30 суток была минимальной - 3 шт. на 1 м². В прототипе всходы взошли на 7-8 день, плотность травостоя на 1 дм² через 30 дней равнялось 54 шт., а после перезимовки рос сплошной газон.

В опыте всходы взошли на 5-6 день, плотность травостоя на 1 дм² через 30 дней рос сплошной газон, который после перезимовки стал еще гуще, чем в прототипе.

Таблица 4
Вариант опыта	Появление всходов, шт.	Плотность травостоя на 1 дм2 через 30 дней, шт.	Число растений после перезимовки
Контроль	единичные	3	«Черный пар»
Прототип	на 7-8 день	54	густой сплошной газон
Предлагаемый способ	на 5-6 день	85	очень густой сплошной газон

В таблице 5 предоставлено содержание гудрона в почве в течение вегетационного периода роста растений через 3 недели и через 3 месяца и динамики численности микроорганизмов в почве до обработки, через 1 и 3 месяца.

Таблица 5
Вариант опыта	Содержание гудрона в почве, %			Динамика численности микроорганизмов в почве в 1 г:
	до обработки	через 3 недели	через 3 месяца	до обработки	через 3 недели	через 3 месяца
Почва незагрязненная	-	-	-	6,1·106	6,7·10 6	7,4·106
Контроль	100,0	100,0	100,0	0,5·106	единичные колонии	единичные колонии
Прототип	100,0	77,9	10,0	0,5·10 5	0,9·105	1,5·105
Предлагаемый способ	100,0	32,7	4,6	0,6·10 6	1,7·106	2,3·107

В почве, незагрязненной гудроном, количество микроорганизмов до обработки составило 6·1·10⁶, через 1 месяц 6,7·10 ⁶, через 3 месяца - 7,4·10⁶. В контроле без обработки бакпрепаратом, количество гудрона за 3 месяца не снизилось. Количество микроорганизмов до обработки составило 0,5·10⁶, через 1 и 3 месяца вырастали единичные колонии микроорганизмов. В прототипе количество гудрона снизилось в почве через 3 недели до 77,9%, через 3 месяца до 10,0%. В предлагаемом способе количество гудрона через 3 недели снизилось до 32,7%. Через 3 месяца - до 4,6%.

Таким образом, количество микроорганизмов в предлагаемом способе уже через 3 недели достигло 1,7·10⁶ по сравнению с прототипом, где количество бактерий через 3 месяца было меньше чем в предлагаемом через 3 недели, что указывает на хорошие результаты по сравнению с прототипом.

Пример 3.

На спланированном и выровненном участке на почвогрунте загрязненного мазутом (13%) и гудроном (содержание гудрона 11%) проводились работы аналогично примеру 1 и 2. После внесения в почву бакпрепаратов проводилось рыхление на глубину 15 см. Через неделю обработанный участок засевали смесью семян ржи - 60% и вики - 40%.

Результаты приведены в таблице 6 и 7.

Таблица 6
Варианты опыта	Появление всходов, шт.	Плотность травостоя на 1 дм2 через 30 дней, %	Число растений после перезимовки
Контроль	единичные	4	«Черный пар»
Прототип	на 6-8 день	70	сплошной газон
Предлагаемый способ	на 4-5 день	87	густой газон

Таблица 7
Вариант опыта	Содержание мазута и гудрона в почве, %			Динамика численности микроорганизмов в почве в 1 г:
	до обработки	через 3 недели	через 3 месяца	до обработки	через 3 недели	через 3 месяца
Почва незагрязненная	-	-	-	5,6·106	6,1·10 6	6,0·106
Контроль	100	100	100	0,4·104	0,2·10 5	0,2·105
Прототип	100	75,4	6,0	0,8·106	1,2·10 6	1,7·106
Предлагаемый способ	100	37,8	2,0	0,7·106	1,5·106	2,5·10 7

Как видно из таблиц 6 и 7, появление всходов растений в контроле (без обработки бакпрепаратами) было единичным и плотность травостоя на 1 дм² через 30 дней равнялась 4. После перезимовки растения на участке не росли. В опыте по предлагаемому способу появление всходов отмечалось на 4-5 день. Плотность травостоя на 1 дм² через 30 дней составила 87%, а после перезимовки в опыте отмечается сплошной газон растений. Содержание гудрона и мазута в почве в контрольном участке оставалось в течение 3 месяцев в количестве 100%. В опыте через 3 месяца их количество уменьшилось со 100% до 2,0%. Численность микроорганизмов в опыте также значительно увеличилось за 3 месяца с 0,7·10⁶ до 2,5·10⁷. В контроле, наоборот, количество микроорганизмов резко снизилось через 3 месяца. С контрольным участком вырастали единичные колонии микроорганизмов.

Как показали испытания, количество мазута и гудрона под влиянием внесенных микроорганизмов Pseudomonas fluorescens ВКГ КСАМ00538и Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 резко снизились за 3 месяца по сравнению с прототипом, при этом количество микроорганизмов резко возросло за 3 месяца, в прототипе количество микроорганизмов было значительно меньшим, т.е. их количество повысилось с 0,8·10 ⁶ до 1,7·10⁶.

В примере 3 представлены результаты опытов на делянках по предлагаемому способу по определению роста надземной массы в длину и была проведены замеры длины корневой системы в сравнении с прототипом. Данные приведены в таблице 8.

Таблица 8
Вариант опыта	Рост надземной массы в длину, см	Длина корневой системы, см	Сапрофиты, тыс./г	Азотобактер, тыс./г
Прототип
Рожь	22,0	9,5	205,8	1,1
Вика	25,0	4,3	212,4	0,9
Контроль
Рожь	5,8	0,5	10,8	0,0
Вика	6,4	0,7	6,5	0,0
Предлагаемый способ
Рожь	31,0	12,4	347,5	2,3
Вика	35,0	5,9	385,6	2,7

Рост надземной массы в длину в предлагаемом способе у ржи был 31 см, в прототипе 22 см

У вики в предлагаемом способе - 35 см, в прототипе - 25 см. В контроле рост надземной массы у ржи составил 5,8-6,2 см, у вики 6,4-7,5 см. Длина корневой системы в предлагаемом способе у ржи была 12,4 см, у вики 5,9 см. В прототипе у ржи - 9,3 см, у вики - 4,3 см. На контрольных участках корневая система у ржи - 0,5-0,6 см, у вики - 0,7-0,8 см.

Микробиологический анализ (таблица 8) на содержание сапрофитов и азотобактера - показателей на плодородие почвы показало, что количество сапрофитов микрофлоры в предлагаемом способе в корневой системе у ржи составило 347,5 тыс/г, у вики - 385,6 тыс/г, в прототипе у ржи - 205,8 тыс/г, у вики - 212,4 тыс/г. Азотобактер в прототипе у ржи составил 1,1 тыс/г, у вики - 0,9 тыс/г. В предлагаемом способе в корневой системе у ржи - 2,3 тыс/г, у вики - 2,7 тыс/г. В контрольных вариантах рост азотобактера отсутствовал.

Предлагаемый способ позволяет резко снизить количество нефтепродуктов (мазута и гудрона) в почве в течение вегетационного периода роста растений (3 месяца), обеспечивает хороший рост и развитие растений, а также повышает численность микроорганизмов в почве. Использование бактериальной культуры Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 в качестве регулятора роста растений повышает плодородие земель, загрязненных нефтью при минимальных затратах.

Промышленная применимость предлагаемого способа не вызывает затруднений, так как не требуется специального оборудования. Применяемые бакпрепараты, готовятся на предприятии, и доставляются в сухом виде на объект, где также используется в сухом виде.