модифицированный пептид и его использование для тестирования онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии

Классы МПК:C07K9/00 Пептиды, содержащие до 20 аминокислот с сахаридными радикалами и полностью определенной последовательностью; их производные
G01N33/531 получение материалов для иммунологических испытаний
G01N33/68 с использованием протеинов, пептидов или аминокислот
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ГЕРОФАРМ" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2009-02-16
публикация патента:

В изобретении описан химически модифицированный пептид - фрагмент человеческого белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 , состоящий из последовательности 15 аминокислот, соответствующих аминокислотам в положении 18-32 аминокислотной последовательности белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 . Пептид ковалентно соединен со спейсером (Ahx), состоящим из 2-аминогептановой кислоты или аналогичного с ней соединения, и ковалентно соединенной со спейсером молекулой биотина (Bio). Пептид имеет общую формулу: A-Tyr1-Ser2 -Gly3-Arg4-Glu5-Gly6 -Asp7-Lys8-His9-Lysl0 -Leull-Lysl2-Lysl3-Serl4 -Glul5-Б, где А представляет собой Bio-Ahx, Bio-Acp, Bio или 0, а Б представляет собой 0 или -NH2. Bio обозначает биотин, Ahx обозначает остаток 2-аминогептановой кислоты, Acp - обозначает остаток 6-аминокапроиновой кислоты, 0 обозначает отсутствие аминокислоты. Способ диагностирования и прогнозирования меланомы предусматривает определение уровня содержания натуральных антител (нАТ) в крови к пептиду по изобретению и по концентрации антител в сравнении с контролем диагностируют стадии меланомы. Прогнозирование исхода и эффективности лечения черепно-мознговой травмы осуществляют путем определения уровня содержания нАТ к пептиду по изобретению. При снижении уровня нАТ в крови больных по отношению к контрольному стандартному образцу диагностируют благоприятный исход заболевания и эффективность лечения. Изобретение может с высокой эффективностью использоваться как экспресс-диагностика поражений ГЭБ и мониторинга эффективности терапии ЧМТ и ряда онкологических заболеваний. 3 н.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 5 пр.

Рисунки к патенту РФ 2491291

модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291

Изобретение относится к области:

- медицины, а именно к диагностике нарушений функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и мониторингу эффективности проводимой терапии;

- иммуно-диагностики, а именно к определению уровня содержания натуральных антител в сыворотке крови;

- пептидной химии, а именно к конструированию и модификации синтетических пептидных фрагментов для использования в качестве антигена для определения натуральных антител к природным белкам человеческого организма, в частности для определения натуральных антител к белку S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 человека.

Травматическое повреждение мозга при ЧМТ включает в себя два основных механизма: первичное повреждение мозга, как результат непосредственного воздействия механической энергии, и вторичное его повреждение, возникающие вследствие сложных и многообразных механизмов, запускаемых с момента получения травмы.

Говоря о первичном повреждении головного мозга, подразумевают непосредственное повреждение сосудов, аксонов, нейронов и глии, которое происходит при воздействии механической энергии и приводит к многочисленным формам поражения мозга (диффузные аксональные повреждения; ушибы и размозжения мозга; некоторые виды первичных внутричерепных кровоизлияний; множественные распространенные внутримозговые геморрагии; контузии и разрывы ствола мозга). Большинство авторов считают, что раннее выявление и устранение внутричерепных и внечерепных факторов является основополагающим моментом в лечении больных с черепно-мозговой травмой [Гайтур Э.И., и соавт., 1996; Потапов А.А., и соавт., 1996; Chesnut R.M., e.a., 1993; Pietropaoli JA, e.a., 1992].

Церебральная ишемия является наиболее важным фактором, сопровождающим вторичные повреждения мозга, и часто способствует неблагоприятным исходам ЧМТ. Некоторые авторы считают, что в основе посттравматической болезни мозга могут лежать иммунологические механизмы, которые в одних случаях облегчают течение травмы мозга, а в других - вызывают дополнительное повреждение ткани мозга, способствуя развитию отека мозга [Archelos J.J., Hartung H-P., 2000; Ганнушкина И.В., 1974]. Наиболее важное значение в посттравматических повреждениях мозга, по мнению автора, имеет потеря способности организма вовремя восстанавливать целостность ГЭБ. Сходная ситуация наблюдается при развитии опухолей мозга. Если на ранних стадиях роста опухоли функция ГЭБ остается близкой к норме, то, по мере роста опухоли, проницаемость его растет, что приводит к инфильтрации нервной ткани иммунными клетками, с одной стороны, и проникновению мозговых антигенов в кровь, с другой стороны [Fenstermaker RA and Ciesielski MJ, 2004].

В связи с этим поиск биохимических маркеров повреждения мозга и оценки состояния целостности ГЭБ являются важными задачами современной нейробиологии.

Эффективным маркером в оценке повреждения мозга является белок S-100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 [Kruijk et al, 2001; Ingebrigtsen, Romner, 2003]. S-100 является специфическим белком, способным связывать кальций. Свое название белок получил благодаря свойству оставаться в растворенном состоянии в насыщенном растворе сульфата аммония. Семейство белков S-100 состоит из более, чем 18 тканеспецифических мономеров, два из которых - модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 и модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 с молекулярным весом 10,4 КД и 10,5 КД, образуют гомо- и гетеродимеры, присутствующие в высокой концентрации в клетках нервной системы. S-100(модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 ) находится в высоких концентрациях в астроцитах и шванновских клетках, гетеродимер S-100(модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 ) присутствует в астроцитах. S-100 (модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 ) и S-100 (модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 ) представлены как гомо и гетеродимеры в некоторых тканях злокачественных опухолей (меланома, глиома и некоторые опухоли мягких тканей). Белок S-100 метаболизируется в почках, а его период полураспада составляет два часа. Белок S-100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 является биохимическим маркером повреждения клеток мозга. Повышение содержания этого белка в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости отмечено при многих заболеваниях, сопровождающихся повышением проницаемости мембран и/или гибелью глиальных клеток вследствие некроза и апоптоза, а так же нарушения целостности структуры гематоэнцефалического барьера. Увеличение в биологических жидкостях концентрации белка S-100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 , обозначаемого в некоторых работах как белок S-100, было найдено при остром ишемическом инсульте [Wunderekhen et al., 1999; Herrman, Vos, Wunderlich, 2000], перинатальных гипоксическо-ишемических повреждениях ЦНС у новорожденных детей, злокачественной меланоме [Henze et al., 1999; Hauschild A. et al., 1997] и ряде других заболеваний [Голосная и соавт., 2004].

Белок S-100 участвует в дифференциации цитоскелетных структур и Са+2 -зависимых клеточных информационных процессах. Некроз астроцита, при повреждении мозга в результате травмы или при злокачественных опухолях, вызывающий выход белка S-100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 из цитозоля в экстраклеточное пространство, а также интегральное нарушение мембран в теневой зоне ишемических очагов, приводящее к цитотоксическому и вазогенному отеку, могут являться причиной значительного увеличения содержания белка S-100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 в сыворотке крови.

Определение самого белка S-100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 в сыворотке крови в настоящее время достаточно широко используется в неврологии и отчасти в онкологии. На рынке представлены диагностические наборы, например: CanAg S100 EIA (CanAg Diagnostics Швеция), Human S100B ELISA Kit (Bio Vendor Laboratory Medicine, Чехия), Human S100B ELISA Kit (Abnova Corporation, Тайвань), S-100 Beta EIA Kit (Alpco Diagnostics,CUIA), Human S100 beta ELISA Kit (Cosmo Bio Co., Ltd. Япония). Несмотря на существующее разнообразие диагностических наборов, их высокая цена значительно ограничивает их применение на российском рынке. Кроме того, определение белка S-100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 в крови является достаточно грубым показателем, который хоть и дает возможность диагностировать острое повреждение мозга, но не позволяет делать прогноз относительно эффективности лечении и возможного исхода заболевания.

Известны способы определения уровня антител, в том числе к белку S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 , например, описанный в патенте РФ № 2107913 «Способ скринингового обследования женщин детородного возраста с помощью тест-системы ELI-P для прогноза развития эмбриона/плода и рождения здорового либо аномального ребенка» (Полетаев А.Б.; Вабищевич Н.К.; Морозов С.Г.). Наиболее близким к заявляемому решению можно считать изобретение, защищенное патентом РФ № 2259567 «Способ скриннингового выявления лиц группы риска развития патологии нервной системы и мониторинга за состоянием больных, страдающих нервно-психическими заболеваниями» (Полетаев А.Б., Амбросимова А.А., Соколов М.А.).

Рассмотренные способы обладают рядом существенных отличий и недостатков:

- в качестве компонента тест-систем используется белок S100, выделенный из мозга животных, и/или цельные или фрагментированные идиотипические антитела к этому белку. Использование подверженных денатурации белка и антител затрудняет стандартизацию выполняемого анализа, т.к.

- денатурация белка снижает сроки хранения и точность тест-системы.

- подход никогда не был исследован в качестве диагностического инструмента для оценки нарушений проницаемости ГЭБ и мониторинга эффективности терапии ЧМТ,

- описываемый биомаркер никогда не был использован для диагностики онкозаболеваний, таких как злокачественная меланома, анапластическая астроцитома и мультиформная глиобластома.

Задачей настоящего технического решения является повышение эффективности тестирования неврологических и онкологических заболеваний нервной системы, а также диагностики прогноза исхода и эффективности лечения черепно-мозговой травмы, методом определения специфических антител к белку. Эффективность выражается в увеличении специфичности, снижению вариабельности теста, уменьшения количества сорбированного антигена, снижению стоимости тестирования по сравнению с использованием белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 , за счет создания модифицированного пептида.

Для осуществления этой задачи был разработан химически модифицированный пептид - фрагмент человеческого белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 , который используется следующим образом: пептид S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) применяется в качестве антигена для иммунологического метода диагностики, для чего иммобилизуется на стандартных видах иммунологических сорбентов (полистрироловом луночном планшете, нитроцеллюлозе, нейлоне и магнитных или нано-частицах), отбирается образец крови пациента, из которого выделяется сыворотка, и в ней определяется уровень нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 .

Использование предложенного модифицированного синтетического пептида, позволяет осуществлять анализ и/или мониторинг нАТ к белку S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 в образцах сыворотки крови человека и животных и оптимизировать тестирование неврологических и онкологических заболеваний нервной системы, за счет увеличении специфичности теста, снижения вариабельности результатов теста в 2-3 раза, уменьшения количества сорбированного антигена с 12 до 50 раз.

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен модифицированный пептид, состоящий из последовательности 15 аминокислот (18-32), принадлежащих человеческому белку S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 , ковалентно соединенный с ним спейсер (Ahx), состоящий из 2-аминогептановой кислоты или аналогичного с ней соединения, и ковалентно соединенная со спейсером молекулы биотина (Bio) по формуле (Таблица 1): A-Tyr1-Ser2-Gly 3-Arg4-Glu5-Gly6-Asp 7-Lys8-His9-Lys10-Leu 11-Lys12-Lys13-Ser14-Glu 15-Б, где А представляет собой Bio-Ahx, Bio-Acp, Bio или О, а Б представляет собой О или -NH2 (SEQ ID NO 1-5) (Bio обозначает биотин, Ahx обозначает остаток 2-аминогептановой кислоты, Acp - обозначает остаток, 6-аминокапроиновой кислоты, О обозначает отсутствие аминокислоты).

Последовательность человеческого белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 известна: Met-Ser-Glu-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Val-Ala-Leu-Ile-Asp-Val-Phe-His-Gln-Tyr-Ser-Gly-Arg-Glu-Gly-Asp-Lys-His-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Glu-Leu-Lys-Glu-Leu-Ile-Asn-Asn-Glu-Leu-Ser-His-Phe-Leu-Glu-Glu-Ile-Lys-Glu-Gln-Glu-Val-Val-Asp-Lys-Val-Met-Glu-Thr-Leu-Asp-Asn-Asp-Gly-Asp-Gly-Glu-Cys-Asp-Phe-Gln-Glu-Phe-Met-Ala-Phe-Val-Ala-Met-Val-Thr-Thr-Ala-Cys-His-Glu-Phe-Phe-Glu-His-Glu.

Расчет для последовательности пептидного фрагмента с наиболее выраженными иммунологическими свойствами проводили методом компьютерного анализа по программам BSITE1 (Antigenic Sites Analysis Program, при использовании параметров consensus scale) и Peptide Companion (расчет с использованием данных Hopp and Woods hydrophilicity scale). Анализ полученных данных с учетом заданного размера фрагмента (10-15 аминокислотных остатков), стабильности препаратов и особенностей твердофазного пептидного синтеза позволил выбрать в качестве антигенной детерминанты последовательность 18-32:

Tyr-Ser-Gly-Arg-Glu-Gly-Asp-Lys-His-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Glu.

Соответствующий пептид синтезировали в форме:

Bio-Ahx-Tyr-Ser-Gly-Arg-Glu-Gly-Asp-Lys-His-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Glu-NH2

Рассчитанная структура была модифицирована добавлением «спейсера» в виде 2-аминогептановой кислоты. Добавление «спейсера» оптимизирует стерическое положение пептида после сорбции на поверхности иммунологическим планшетом. К «спейсеру» была ковалентно присоединена молекула биотина для обеспечения оптимального аффинного связывания с поверхностью иммунологических планшетов или других пригодных для использования в иммунологическом анализе сорбентов, покрытых стрептавидином. Подобная формула позволяет увеличить специфичность анализа при использовании в 10-15 раз меньшего количества антигена, чем при использовании белкового антигена S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 . Этот подход не только оптимизирует анализ, но и приводит к его значительному удешевлению.

Пример 1. Преимущества использования модифицированного пептида при определении антител к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 .

Проведено изучение эффективности использования модифицированного пептида S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) в качестве антигена в системе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) в сравнении с природным белком S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 . В эксперименте было использованы сыворотки крови крыс с экспериментальной черепно-мозговой травмой (n=9) в сравнении с группой контрольных животных (n=10). Исследование показало, что использование модифицированного пептида S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) приводило к снижению вариабельности при определении нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 : 19% - для белкового антигена и 6% - для пептидного. При этом одинаковая величина сигнала (оптической плотности) достигалась при использовании в 12 раз меньшего количества пептидного антигена: 0.5 мкг на ячейку иммунологического планшета для белкового антигена 0,04 мкг на ячейку для пептида. Таким образом, использование модифицированного пептида S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) оптимизировало проведение анализа. На Фиг.1 приведены результаты иммуноферментного анализа сывороток крови крыс с экспериментальной черепно-мозговой травмой (ЧМТ) с использованием белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (0,5 мкг/яч) и модифицированного пептида S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) (0,04 мкг/яч) в качестве антигена. По оси ординат - оптическая плотность раствора после проведения анализа при длине волны 450 нм.

Исследования также показали, что модифицированный пептид S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 обладает большей эффективностью связывания с иммуносорбентами в 100-1000 раз в различных вариантах иммунодиагностики по сравнению с белком S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 . Эффективность связывания достигается за счет высокоаффинного взаимодействия биотина, входящего в структуру модифицированного пептида. и покрывающего иммуносорбент белка авидина. Таким образом, высокая константа связывания позволяет добиться практически полного связывания антигена с сорбентом, что приводит 100-1000 кратной экономии антигена при использовании модифицированного пептида. При использовании белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 большая часть антигена остается в растворе.

Пример 2. Взаимосвязь между эффективностью терапии в период восстановления после черепно-мозговой травмы у крыс и уровнем нАТ к модифицированному пептиду S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32).

Были проведены исследования взаимосвязи между уровнем нАТ к модифицированному пептиду S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) и эффективностью экспериментальной терапии. Исследование проведено на самцах крыс-альбиносов (n=9) массой 160-220 г. У животных был предварительно выработан условный рефлекс активного избегания плаванием. Моделирование ЧМТ проводилось с помощью weight-drop метода. Экспериментальную терапию начинали через 0,5 часа после механического воздействия. Использовали известный пептидный нейропротектор кортексин (0,15 мг/кг) (Герофарм, Россия) и препарат церебролизин (0,2 мл/кг) (EbwePharma, Австрия). Препараты вводили интраперитонеально один раз в сутки. Контрольная группа получала физиологический раствор в объеме введения препарата. Курс лечения продолжался в течение всего периода наблюдения - 7-10 суток. Оценка восстановления предварительно сформированных условных рефлексов проводилась, начиная с первых суток после нанесения ЧМТ, и продолжалась ежедневно на протяжении всего периода наблюдения (14 суток). На 14-день эксперимента у животных отбирались образцы крови. Уровень нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 в сыворотке определяли с использованием модифицированного пептида S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) в качестве антигена в системе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты исследования продемонстрировали наличие различия по этому показателю между контрольной группой (животные без ЧМТ) и группами животных с ЧМТ с лечением (кортексин, церебролизин) и без лечения. Уровень нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 у животных с травмой превышал контрольный в 1,5-2,5 раза в зависимости от типа лечения. Динамика восстановления условного рефлекса активного избегания плаванием при экспериментальной терапии последствий черепно-мозговой травмы у крыс отражена на Фиг.2.

На Фиг.3 показан уровень нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 в крови крыс на 14 день экспериментальной терапии последствий черепно-мозговой травмы у крыс. Группы: 1 - ЧМТ + Кортексин, 2 - ЧМТ + церебролизин, 3 - ЧМТ контроль (без лечения), 4 - контроль (без травмы) (n=9; Pмодифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 0,05).

Выявлено наличие выраженной корреляционной связи между скоростью восстановления условного рефлекса у животных (R=-0,78; р=0,02) и стойкостью неврологических нарушений (R=0,68; р=0,05) и уровнем нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 . Эксперимент показал, что экспериментальная ЧМТ приводит к значительному повышению уровня нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 к 14 дню после травмы. Кроме того, исследование продемонстрировало существование зависимости между скоростью восстановления функций ЦНС после ЧМТ и уровнем нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 . При этом успех экспериментальной терапии и быстрое восстановление функций ЦНС были ассоциированы с более низким уровнем нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 .

Пример 3. Мониторинг уровня нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 у детей в процессе восстановления после ЧМТ на фоне стандартной терапии.

Исследована сыворотка крови 114 детей в динамике в первые дни после ЧМТ. Параллельно оценивалось содержание белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (с использованием теста CanAg S100 EIA) (CanAg Diagnostics Швеция) и нАТ к модифицированному пептиду S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) с использованием модифицированного пептида S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) в качестве антигена в системе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). На Фиг.4 отражены показатели при тяжелой ЧМТ с последующим хорошим восстановлением. Диагноз: Сочетанная тяжелая ЧМТ, ушиб головного мозга. На Фиг.5 - данные при инвалидности в результате тяжелой ЧМТ. Диагноз: Открытая ЧМТ, перелом основания черепа.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

1. У большинства пациентов увеличение содержания нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) отмечается одновременно с увеличением концентрации белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 в крови (см. Фиг.4).

2. У детей с хорошим восстановлением церебральных функций после ЧМТ и хорошим откликом на проводимую терапию уровень нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) в крови (n=54) (Фиг.6) был достоверно ниже, чем у пациентов с тяжелыми последствиями и мало эффективным лечением (n=45) (Фиг.7). Динамика уровня S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) нАТ характеризовалась снижением уровня (Фиг.4).

3. Выявлено, что у части детей с тяжелой ЧМТ отмечается увеличение содержания нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32). Динамика уровня нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 характеризовалась повышением уровня (Фиг.7).

4. На Фиг.8 показано, что у пациента, находящегося в крайне тяжелом вегетативном состоянии при постоянных реанимационных мероприятиях (полная инвалидность в результате утопления - тяжелой гипоксии), наблюдалось повышенное содержание нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) на протяжении длительного времени, причем, при ухудшении клинического состояния отмечен вторичный подъем нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32). AT к S100B увеличены без повышения самого белка S100B. В этом случае именно увеличение AT к S100B служит показателем повреждения барьерных механизмов, что позволяет высказать предположение, что раннее повреждение ГЭБ является неблагоприятным признаком.

Отсюда можно сделать вывод, что в этих случаях нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) являются чувствительным биомаркером повреждений мозга и ГЭБ в отсроченный период после ЧМТ. Принципиальными и основными отличиями использования уровня нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) от уровня белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 в крови является следующее:

1. Несмотря на то, что повышение выше нормы обоих показателей происходит одновременно после ЧМТ, дальнейшая их динамика значительно отличается. Так, уровень белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 снижается к норме к 3-4 дню после ЧМТ вне зависимости от тяжести, особенностей течения и исхода заболевания, в то время как динамика нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) зависит от этих показателей (Фиг.4, 5 и 8).

2. При благоприятном исходе тяжелой ЧМТ и ЧМТ средней степени тяжести наблюдается незначительный подъем нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) с последующим снижением к 7-10-му дню (Фиг.4). В случае неблагоприятного исхода ЧМТ с последующей инвалидизацией пациента отмечается прогрессирующее увеличение нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) и достижение им более высоких абсолютных значений (Фиг.5 и 7).

3. При легких ЧМТ с благоприятным исходом динамика уровней белка S-100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 и нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) совпадают: незначительное быстрое повышение показателя с последующей нормализацией в течение 7-10 дней (Фиг.4 и 6).

4. При вегетативных состояниях (кома), наступивших в результате тяжелой ЧМТ, наблюдается сложная динамика уровня нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) с периодическими падениями и подъемами на фоне нормального уровня белка S-100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (Фиг.8).

5. Крайним случаем является летальный исход, В этом случае динамики обоих показателей идентичны: значительный подъем, достигающий своего пика 10-15 дню после ЧМТ, сменяется проградиентным снижением, приближающимся к норме к моменту смерти.

Таким образом, на основании проведенных исследований следует вывод о том, что определение уровня содержания натуральных антител (нАТ) к модифицированному пептиду является достоверным способом диагностики прогноза исхода и эффективности лечения черепно-мозговой травмы. При уровне нАТ в крови больных от 110 и до 500% по отношению к контрольному стандартному образцу диагностируют возможность осложнений в течении заболевания. При проведении серии последовательных исследований дальнейшее повышение уровня нАТ в крови больных от 110 и до 500% по отношению к контрольному стандартному образцу является показателем развития осложнений в течении заболевания и неблагоприятного прогноза, а при снижение уровня нАТ от 110% до 50% по отношению к контрольному стандартному образцу является критерием благоприятного течения заболевания и прогноза.

Уровень нАТ к модифицированному пептиду S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) является уникальным, гораздо более специфичным и информативным показателем, чем применявшийся ранее уровень белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 . Он позволяет не только констатировать факт травмы и повреждения ГЭБ, но и оценивать динамику течения заболевания, эффективность терапии и делать прогнозы исхода заболевания.

Пример 4. Уровень нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 у больных со злокачественной меланомой

Злокачественная меланома является одним из наиболее опасных видов рака кожи. Тем не менее, ранняя диагностика заболевания является важным условием эффективности терапии и снижения смертности. Наиболее важной задачей становится раннее обнаружение метастазов. Для выявления диагностического потенциала уровня нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) был проведен анализ сывороток крови больных, находящихся на разных стадиях заболевания (Таблица 1). Результаты анализа демонстрируют достоверное повышение уровня нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32), начиная с III стадии заболевания. Наиболее резкое повышение уровня отмечено на стадии метастазирования. Данные свидетельствуют о перспективности использования нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) в качестве диагностического и, возможно, прогностического критерия при злокачественной меланоме.

Таблица 1.
Уровень нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 в крови пациентов, находящихся на различных стадиях злокачественной меланомы.
Стадии меланомы AJCC Количество пациентов Уровень нАТ S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) (% по отношению к контролю)
I (локализованная)9 99
IIA (локализованная) 5112
III (метастазы в регион) 11120*
IV (отдаленные метастазы)12 180**
* Рмодифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 0,05, ** Рмодифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 0,01

Пример 5. Взаимосвязь уровень нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) с объемом опухоли у больных с глиомами

У 14 больных с диагнозом анапластической астроцитома (8) и мультиформная глиобластома (6) был проведен анализ уровня нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) в крови. На Фиг.9 приведены данные индивидуально для каждого пациента.

Всем пациентам в период подготовки к операции был проведена МРТ (магниторезонансная томография) для определения объема и локализации опухоли. Объем опухоли рассчитывался с использованием соответствующего программного обеспечения. Анализ нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32) проводили за 3-е суток до операции. Объем опухоли был сопоставлен с уровнем нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32). Выявлена прямая пропорциональность между объемом опухоли и уровнем нАТ к S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (Фиг.9).

Таким образом, настоящее изобретение обладает рядом принципиальных отличий:

- оно включает в себя специально рассчитанный стабильный синтетический пептидный фрагмент белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 человека S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 (18-32);

- данный пептидный фрагмент специальным образом через спейсер ковалентно связан с молекулой биотина, что позволяет значительно улучшить сорбцию антигена за счет высокоаффинного связывания с покрытыми стрепт-авидином иммуно-сорбентом;

- настоящее изобретение с высокой эффективностью применимо для экспресс-диагностики поражений ГЭБ и мониторинга эффективности терапии ЧМТ, а также как независимый прогностический критерий течения заболевания.

- настоящее изобретение применимо для диагностики ряда онкологических заболеваний таких, как меланома и глиома, и для мониторинга эффективности проводимой терапии.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Модифицированный пептид для диагностики и прогнозирования исхода и эффективности лечения заболеваний и повреждений головного мозга, содержащий последовательность из 15 аминокислот, соответствующих аминокислотам в положении 18-32 аминокислотной последовательности человеческого белка S100модифицированный пептид и его использование для тестирования   онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии, патент № 2491291 , и имеющий формулу:

A-Tyrl-Ser 2-Gly3-Arg4-Glu5-Gly 6-Asp7-Lys8-His9-Lys l0-Leull-Lys12-Lysl3-Ser l4-Glu15-Б, где А представляет собой Bio-Ahx, Bio-Acp, Bio или 0, а Б представляет собой 0 или -NH2 , представленную в SEQ ID NO 1-5, где Bio обозначает биотин, Ahx обозначает остаток 2-аминогептановой кислоты, Acp - обозначает остаток 6-аминокапроиновой кислоты, 0 обозначает отсутствие аминокислоты.

2. Способ диагностирования и прогнозирования меланомы путем определения уровня содержания натуральных антител (нАТ) в крови к пептиду по п.1, и при увеличении уровня нАТ в крови к контрольному образцу до 99% диагностируют I стадию меланомы по классификации AJCC, при увеличении уровня нАТ до 112% - II стадию, при увеличении уровня нАТ до 120% - III стадию и при увеличении уровня нАТ до 180% - IV стадию меланомы.

3. Способ прогнозирования исхода и эффективности лечения черепно-мозговой травмы, отличающийся тем, что определяют уровень содержания натуральных антител (нАТ) к пептиду по п.1 путем определения уровня нАТ по отношению к контрольному стандартному образцу и при уровне нАТ в крови больных в пределах от 50 и до 110% по отношению к контрольному стандартному образцу диагностируют благоприятный исход заболевания и эффективность лечения, при уровне нАТ в крови больных от 110 и до 500% по отношению к контрольному стандартному образцу диагностируют возможность осложнений в течении заболевания, при проведении серии последовательных исследований дальнейшее повышение уровня нАТ в крови больных от 110 и до 500% по отношению к контрольному стандартному образцу является показателем развития осложнений в течении заболевания и неблагоприятного прогноза, а при снижение уровня нАТ от 110% до 50% по отношению к контрольному стандартному образцу является критерием благоприятного течения заболевания и прогноза.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2491291

patent-2491291.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K9/00 Пептиды, содержащие до 20 аминокислот с сахаридными радикалами и полностью определенной последовательностью; их производные

Патенты РФ в классе C07K9/00:
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
гликозилированные гликопептидные антибиотические производные -  патент 2481354 (10.05.2013)
способ получения пептида -  патент 2478105 (27.03.2013)
пептиды rumc, обладающие антимикробной активностью -  патент 2464274 (20.10.2012)
состав полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура -  патент 2453557 (20.06.2012)
пептид с антипролиферативной активностью и фармацевтическая композиция для лечения пролиферативных заболеваний -  патент 2446174 (27.03.2012)
мономерные производные гликопептидного антибиотика -  патент 2424248 (20.07.2011)
способ очистки ванкомицина -  патент 2400489 (27.09.2010)
композиции далбаванцина для лечения бактериальных инфекций -  патент 2352353 (20.04.2009)
гликопептид глицирризиновой кислоты с глицил-l-фенилаланином, проявляющий анти-вич-1 активность -  патент 2315058 (20.01.2008)

Класс G01N33/531 получение материалов для иммунологических испытаний

Патенты РФ в классе G01N33/531:
способ получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний -  патент 2521232 (27.06.2014)
новый аллерген-простатический калликреин -  патент 2502074 (20.12.2013)
применение моноклональных антител для идентификации ямагатской или викторианской эволюционных линий вируса гриппа типа в, штамм гибридомы 4н7 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в ямагатской ветви, штамм гибридомы в/4н1 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в викторианской ветви -  патент 2491338 (27.08.2013)
способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (рбп) -  патент 2488119 (20.07.2013)
способ получения антигена из сетарий для диагностики дирофиляриоза собак -  патент 2487722 (20.07.2013)
способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности с1 ингибитора по способности связываться с igal-протеазой -  патент 2475756 (20.02.2013)
способ получения слабоположительной контрольной сыворотки, содержащей ad и ay субтипы hbsag -  патент 2473913 (27.01.2013)
способ изготовления панели сывороток с hbsag ad- и ay-субтипов для контроля качества диагностики гепатита в -  патент 2463610 (10.10.2012)
способы получения растворимых многопроходных трансмембранных белков -  патент 2441071 (27.01.2012)
способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума -  патент 2429483 (20.09.2011)

Класс G01N33/68 с использованием протеинов, пептидов или аминокислот

Патенты РФ в классе G01N33/68:
способ прогнозирования инфекционного осложнения атопического дерматита у ребенка -  патент 2528908 (20.09.2014)
способ диагностики генетической предрасположенности к нарушениям сердечной проводимости -  патент 2528900 (20.09.2014)
способ прогнозирования неблагоприятного исхода гипертрофической кардиомиопатии -  патент 2527768 (10.09.2014)
способ прогнозирования риска развития рестеноза коронарных артерий после их стентирования у пациентов с ишемической болезнью сердца -  патент 2523391 (20.07.2014)
способ определения индивидуальной радиочувствительности больных злокачественными новообразованиями при проведении лучевой терапии -  патент 2522507 (20.07.2014)
способ прогнозирования прерывания беременности в первом триместре -  патент 2522244 (10.07.2014)
способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления -  патент 2522231 (10.07.2014)
способ прогнозирования риска развития сахарного диабета второго типа у больных гипертонической болезнью -  патент 2521202 (27.06.2014)
способы и применения, включающие гемсвязывающий белок 1 -  патент 2520748 (27.06.2014)
композиции и мультипараметричекие способы анализа для измерения биологических медиаторов физиологического здоровья -  патент 2520080 (20.06.2014)


Наверх