способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта "королек" in vitro

Формула изобретения

Способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта «Королек» in vitro, включающий стерилизацию эксплантов и апикальных почек растений 0,5%-ным спиртовым раствором хлоргексидина в течение пяти минут и промыванием 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в течение 1 ч, затем из эксплантов вырезают листовые пластинки размером более 4 мм и делают надсечки для увеличения площади соприкосновения ткани растения с питательной средой, апикальные почки очищают от поврежденных тканей и их помещают на агаризованную питательную среду, которая содержит 1/2 концентраций макро- и микросолей по Murashige and Skoog (MS), полный состав витаминов и органических добавок среды MS, 1,0-2,0% сахарозы, 0,50-0,70 µМ 1-нафтилуксусной кислоты (НУК).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию тканей и органов растений, и может быть использовано в садоводстве для повышения коэффициента размножения, оздоровления посадочного материала, а также в селекционной практике для создания новых и улучшения уже известных сортов растений.

Известен способ оздоровления плодовых и цветочных (в частности, гладиолуса) эксплантов и апикальных почек растений. Способ включает замачивание водопроводной водой в течение 24 ч клубнелуковиц диаметром 5-6 мм с последующей поверхностной их стерилизацией 6%-ным раствором гипохлорида натрия в течение 15 мин и промыванием 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в течение 1 ч, повторную стерилизацию 90%-ным эгаполом в течение 10 мин и трехкратное промывание, затем клубнелуковицы освобождают от туники и стерилизуют последовательно 70%-ным этанолом в течение 5-7 мин и 90%-ным - в течение 1 мин (RU 2180165 С2, 7 А01Н 4/00, 10.03.2002).

Недостатком данного способа является длительность обработки и применение токсичного стерилизатора - гипохлорита натрия, который, кроме того, сложно приобрести в России.

Известен способ получения оздоровленного посадочного материала путем проведения термо- и химиотерапии в зависимости от вируса, включенного в клетки экспланта и апикальных почек (Лутова Л.А. Биотехнология высших растений: Учебник. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003. - С.212-215).

Недостаток данного способа - использование раздельного применения термо- и химиотерапии, что занимает достаточно длительное время, и, кроме того, данный способ не позволяет полностью удалить вредные микрооргазмы.

Известен также способ обработки эксплантов и апикальных почек такими стерилизаторами, как диацид 0,1%-ный, сулема 0,1%-ная и перекись водорода 10-12%-ная (Егорова Т.А. Основы биотехнологии: учеб. пособие для высш. пед. учеб заведений / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. - 3-е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академия», 2006. - С.160-161). Это наиболее близкий и распространенный способ.

Недостатком данного способа является применение токсичных веществ, требующих специальных условий работы с ними.

Задача изобретения - повышение коэффициента размножения генетически стабильных и свободных от инфекций растений в условиях in vitro, что дает возможность повышать урожайность сельскохозяйственных культур.

Это достигается техникой микроклонирования, которая сокращает продолжительность развития плодовых растений в несколько раз по сравнению с жизненным циклом в естественных условиях, а коэффициент размножения повышает на порядки.

Микроклонирование включает стерилизацию, потому что растительные ткани служат серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем экспланты и апикальные почки обрабатывают 0,5%-ным спиртовым раствором хлоргексидина в течение пяти минут и промывают 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в течение 1 ч. После из эксплантов вырезают листовые пластинки размером более 4 мм и делают надсечки для увеличения площади соприкосновения ткани растения с питательной средой. Апикальные почки очищают от поврежденных тканей и для определения чистоты стерильности их помещают на агаризованную питательную среду, которая содержит 1/2 концентраций макро- и микросолей по Murashige and Skoog (MS), полный состав витаминов и органических добавок среды MS, 1,0-2,0% сахарозы, 0,50-0,70 рМ 1-нафтилуксусной кислоты (НУК).

Пример 1

Экспланты и апикальные почки земляники садовой обрабатывают 0,5%-ным спиртовым раствором хлоргексидина в течение пяти минут и промывают 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в течение 1 ч.

Образующийся каллюс имеет очень низкий процент инфицированности, который составляет 1-3%. Формирующиеся при этом растения имеют хорошо развитую корневую систему с многочисленными боковыми корешками. Длина главного корня составляет 5-6 мм. Утолщенный стебель имеет длину 5-8 мм. Проросток обладает насыщенной зеленой окраской. Побеги, достигшие 5-10 миллиметров, отделяют от каллюса и переносят на среду для укоренения. Оценка состояния проростка - пять баллов. Спустя месяц розетки земляники имеют 10-15 см в высоту, листочки обладают интенсивной зеленой окраской. Корневая система хорошо развита (табл., фиг.1, 2).

Пример 2

Экспланты и апикальные почки винограда также обрабатывают 0,5%-ным спиртовым раствором хлоргексидина в течение пяти минут и промывают 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в течение 1 ч.

Каллюс, образующийся из эксплантов и апикальных почек, имеет низкий процент инфицированности, примерно 3-5%. Растеньица также имеют хорошо развитую корневую систему с многочисленными боковыми корешками. Длина главного корня составляет 8-10 мм. Утолщенный стебель имеет длину 10-15 мм. Проросток обладает насыщенной зеленой окраской. Оценка состояния проростка - пять баллов. Растения после пересадки на торфяную смесь очень быстро укореняются и интенсивно растут. Спустя два-три месяца растения винограда имеют до 20 см в высоту. Стебель несет 5-6 настоящих листочков, они обладают интенсивной зеленой окраской. Корневая система хорошо развита (табл., фиг.3, 4).

Пример 3

Экспланты и апикальные почки хурмы сорта «Королек» обрабатывают 0,5%-ным спиртовым раствором хлоргексидина в течение 5 минут и промывают 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в течение 1 ч.

После воздействия 0,5%-ного спиртового раствора хлоргексидина в течение 5 минут экспланты хурмы имеют небольшой процент инфицированности, примерно 8-10%. Каллюс образуется достаточно быстро, в течение пять-семь дней, растеньица формируются сильными, здоровыми. Длина главного корня составляет 10-15 мм. Утолщенный стебель имеет длину до 20 мм. Проросток обладает насыщенной зеленой окраской. Оценка состояния проростка - пять баллов. Растения после пересадки на торфяную смесь быстро укореняются и интенсивно растут. Через два месяца растения хурмы имеют до 15 см в высоту, утолщенный стебель несет до 8 настоящих листочков, они плотные и обладают интенсивной зеленой окраской. Длина главного корня составляет 25-30 см, боковые корни хорошо развиты (табл., фиг.5).

Таблица
Влияние 0,5%-ного спиртового раствора хлоргексидина на обеззараживание посадочного материала в условиях in vitro
Пример	Образцы	Кол-во введенных эксплантов, шт.	Неинфицированные растения, %	Развитие регенерантов в баллах
1	Земляника садовая	50	97-99	5
2	Виноград	50	95-97	5
3	Хурма сорта «Королек»	50	90-92	5

Таким образом, способ получения оздоровленного посадочного материала в условиях in vitro отличается более эффективной обработкой эксплантов и апикальных почек для повышения коэффициента размножения генетически стабильных и свободных от инфекций растений в условиях in vitro, является более быстрым и доступным. Кроме того, данный способ позволяет обеспечить промышленные и любительские садовые хозяйства высококачественным посадочным материалом плодово-ягодных культур местного производства и повысить урожайность сельскохозяйственных растений.

Источники информации

1. RU 2180165 С2, 7 А01Н 4/00, 10.03.2002.

2. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений: Учебник. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003. - С.212-215.

3. Егорова Т.А. Основы биотехнологии: учеб. пособие для высш. пед. учеб заведений / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. - 3-е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академия», 2006. - С.160-161.