рекомбинантная трехвалентная вакцина от гриппа человека

Формула изобретения

1. Рекомбинантная трехвалентная вакцина от гриппа человека на основе рекомбинантного аденовирусного вектора с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует гемагглютинин вируса гриппа, состоящая из трех типов нереплицирующихся наночастиц, на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, взятых в эффективном количестве, каждая из которых несет различные по сравнению с остальными гены гемаглютинина вируса гриппа, причем вакцина содержит дополнительно пептидогликан и буфер.

2. Рекомбинантная трехвалентная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что генами гемагглютинина вируса гриппа являются H1, Н3, НВ.

3. Рекомбинантная трехвалентная вакцина по п.2, отличающаяся тем, что буфер введен до достижения общего объема 0,5 мл.

4. Рекомбинантная трехвалентная вакцина по п.3, отличающаяся тем, что эффективная доза нереплицирующихся наночастиц со вставкой гемагглютинина H1, нереплицирующихся наночастиц со вставкой гемагглютинина Н3 и нереплицирующихся наночастиц со вставкой гемагглютинина НВ и пептидогликана содержится в 0,5 мл вакцины.

5. Рекомбинантная трехвалентная вакцина по п.5, отличающаяся тем, что содержит

нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гемагглютинина H1, взятые в количестве, обеспечивающем активность, не более или равную 10⁷ ЕД, вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1);

нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гемагглютинина Н3, взятые в количестве, обеспечивающем активность, не более или равную 10⁷ ЕД, вируса гриппа A/Perth/16/2009 (H3N2);

нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гемагглютинина НВ, взятые в количестве, обеспечивающем активность, не более или равную 10⁷ ЕД, вируса гриппа B/Brisbane/60/2008;

пептидогликан 1-20 мкг;

буфер до объема 0,5 мл.

6. Рекомбинантная трехвалентная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве пептидогликана она содержит кислый пептидогликан с молекулярной массой от 1200 до 40000 кДа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к вакцинопрофилактике инфекционных заболеваний респираторного тракта человека, в том числе гриппа.

Грипп - высококонтагиозное вирусное заболевание людей, птиц и млекопитающих животных. В мире каждый год регистрируются сезонные подъемы заболеваемости гриппом (эпидемии), вызванные вирусами типа А или В, приводящие к увеличению смертности и значительному экономическому ущербу. Как правило, наиболее тяжелые заболевания вызывают вирусы гриппа А. Среди многих подтипов вирусов гриппа А в настоящее время среди людей циркулируют подтипы гриппа A(H1N1) и A(H3N2). Эти вирусы широко распространены в природе и могут поражать людей, многие виды млекопитающих (лошадей, свиней, тюленей и т.д.) и птиц, они могут представлять угрозу пандемии с большим количеством человеческих жертв (Gorman O.T. et al., Evolutionary processes in influenza viruses: divergence, rapid evolution, and stasis, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1992, № 176, с.75-97 - Эволюционный процесс у вируса гриппа: дивергенция, быстрая эволюция и застой), (Грипп, Информационный бюллетень, 2009, № 211, доступен: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/ru/index.html).

Защита человека от постоянных атак вирусов гриппа осложняется трудностью прогнозирования появления новых пандемических и эпидемических штаммов, а также низкой перекрестной реактивностью вакцин, большинство из которых обеспечивают хорошую защиту только от того штамма вируса гриппа из которого они были произведены.

Для решения проблемы защиты от вируса гриппа птиц максимального числа людей в случае пандемии, вызванной этим вирусом, ВОЗ предлагает вести работы по трем направлениям: увеличение применения вакцин против сезонных эпидемий гриппа, увеличение производственных возможностей для наработки большого количества вакцин в случае пандемии и проведение исследований по получению новых эффективных вакцин, в том числе получение новых типов вакцин, таких как рекомбинантные субъединичные вакцины, ДНК-вакцины и вакцины на основе вирусных векторов и вирусоподобных частиц (Abdulhaqq S.A., Weiner D.B. DNA Vaccines: developing new strategies to enhance immune responses, 2008, № 42, с.219-232 - Вакцины: разработка новых стратегий для усиления иммунного ответа).

Одним из наиболее эффективных на сегодняшний день подходов для решения вышеописанных задач является использование генетических вакцин, базирующихся на аденовирусных векторах (Zaia J.A., The status of gene vectors for the treatment of diabetes, Cell Biochem. Biophys, 2007, № 48 (2-3), с.183-90 - Статус генетических векторов для лечения сахарного диабета). При введении в организм таких вакцин происходит попадание генетического материала в клетки организма и экспрессия в них генов целевых белков патогена. В результате антигены соответствующих патогенов распознаются иммунной системой, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа (Карпов А.П. и др. Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих гены гликопротеинов gB, gE, gI вируса болезни Марека, Биотехнология, 2007, № 5, с.38-44), (Knoblich H.V. et al., Antibody titers to infectious bursal disease virus in broiler chicks after vaccination at one day of age with infectious bursal disease virus and Marek's disease virus, Avian Dis., 2000, № 44 (4), с.874-84 - Титры антител к вирусу Бурсальной болезни у цыплят-бройлеров после вакцинации в однодневном возрасте вирусами Бурсальной болезни и вирусом болезни Марека).

На сегодняшний момент наиболее хорошо изученным и часто используемым для генетической вакцинации является рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа. Вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа имеют ряд преимуществ перед другими генетическими вакцинами. Во-первых, рекомбинантные аденовирусы являются репликативно-дефектными и не способны вызывать заболевания. Безопасность аденовирусов человека пятого серотипа с делегированными Е1 и Е3 областями генома подтверждается целым рядом проведенных клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе (Hoelscher M.A. et al., Development of adenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distinct human H5N1 strains in mice, Lancet, 2006, № 367 (9509), с.475-81 - Разработка аденовекторных пандемических вакцин от гриппа против антигенно различных человеческих штаммов H5N1 на мышах), (Van Kampen K.R. et al., Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans, Vaccine, 2005, № 23(8), с.1029-36 - Безопасность и иммуногенность аденовекторных назальных и накожных противогриппозных вакцин у человека). Во-вторых, рекомбинантные аденовирусы позволяют проводить интраназальную иммунизацию и, как следствие, индуцируют образование мукозального иммунного ответа. В-третьих, на сегодняшний момент разработаны быстрые и гибкие технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие реализовать масштабное производство различных кандидатных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента. Вышеперечисленные свойства делают рекомбинантные аденовирусы хорошей технологической платформой для создания широкого спектра вакцин против различных субтипов вируса гриппа.

Рекомбинантные аденовирусы обладают следующими характеристиками (Harrop R. et al., Recombinant viral vectors: cancer vaccines, Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, № 58(8), с.931-47 - Рекомбинантные вирусные векторы: вакцины против рака):

- способны трансдуцировать как делящиеся, так и постмитотические клетки (Tang D.C. et al., Overexpression of adenovirus-encoded transgenes from the cytomegalovirus immediate early promoter in irradiated tumor cells, Hum. Gene Ther., 1997, № 8(17), с.2117-24 - Гиперэкспрессии трансгенов, кодированных в аденовирусе под действием раннего промотора цитомегаловируса у облученных опухолевых клеток), (Tang D.C. et al., Butyrate-inducible and tumor-restricted gene expression by adenovirus vectors, Cancer Gene Ther., 1994, № 1(1), c.15-20 - Бутират-индуцибельная и уничтожающая опухоль экспрессия гена аденовирусными векторами);

- ДНК аденовируса остается в экстрахромосомной форме;

- они могут быть получены в титре более 10¹⁰ ЕД/мл, что может позволить использовать их в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины;

- способны к размножению только в специальных линиях клеток in vitro;

- обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого гена в клетке-мишени;

- выводятся из организма в течение 4-5 недель;

- иммунизация рекомбинантными аденовирусами обеспечивает индукцию как клеточного, так и гуморального иммунного ответа (Schagena F.H.E. et al., Immune responses against adenoviral vectors and their transgene products: a review of strategies for evasion, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 2004, № 50(1), с.51-70 - Иммунный ответ против аденовирусных векторов и их трансгенных продуктов: обзор стратегий устранения);

- процесс получения нового рекомбинантного аденовируса занимает несколько недель, что может позволить быстро реагировать на меняющуюся эпидемиологическую обстановку в максимально сжатые сроки.

Интраназальная иммунизация рекомбинантным аденовирусом человека 5-ого серотипа не приводит к каким-либо нежелательным эффектам (Van Kampen K.R. et al., Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans, Vaccine, 2005, № 23(8), с.1029-36 - Безопасность и иммуногенность аденовекторных назальных и накожных противогриппозных вакцин у человека).

Применение генетических вакцин на основе аденовируса человека 5-ого серотипа может быть ограничено наличием предсуществующего иммунного ответа у людей, уже встречавшихся ранее с этим вирусом (Bangari D.S. et al., Comparative transduction efficiencies of human and nonhuman adenoviral vectors in human, murine, bovine, and porcine cells in culture, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, № 327, с 960-966 - Сравнительная эффективность трансдукции человеческими и нечеловеческими аденовирусными векторами человеческих, мышиных, бовинных и свиных культур клеток).

Однако в отличие от парентерального введения, при интраназальной иммунизации вакцины на основе аденовируса человека 5-ого серотипа могут избегать воздействия предсуществующего иммунного ответа (Van Kampen K.R. et al., Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans, Vaccine, 2005, № 23(8), с.1029-36 - Безопасность и иммуногенность аденовекторных назальных и накожных противогриппозных вакцин у человека). Высокая иммуногенность рекомбинантного аденовируса человека 5-ого серотипа при интраназальном введении приводит к эффективной доставке трансгена через мукозальный барьер. Показано, что даже однократное введение вакцин на основе аденовируса человека 5-ого серотипа приводит к пролонгированной ex vivo экспрессии трансгена, несмотря на предсуществующий иммунный ответ как у лабораторных животных (Wadsworth S.C. et al., Adenovirus vector-infected cells can escape adenovirus antigen-specific cytotoxic T-lymphocyte killing in vivo, J. Virol., 1997, № 71(7), с.5189-5196 - Клетки, инфицированные аденовирусным вектором, могут избежать уничтожения аденовирусными антигенно-специфичными цитотоксическими Т-лимфоцитами in vivo). Аналогично и у приматов (Zabner J. et al. Safety and efficacy of repetitive adenovirus-mediated transfer of CFTR cDNA to airway epithelia of primates and cotton rats, Nat. Genet, 1994, № 6(1), с.75-83 - Безопасность и эффективность повторяющегося обеспеченного аденовекторами переноса CFTR кДНК на дыхательный эпителий приматов и хлопковых крыс).

Современный уровень формулирования вакцин подразумевает не только индукцию протективного специфического иммунитета, но и индукцию врожденного иммунитета для более широкого спектра противоинфекционной защиты. Одними из ключевых рецепторов врожденной иммунной системы млекопитающих являются Toll-подобные рецепторы (TLR). Рецепторы данного семейства способны распознавать специфические высококонсервативные молекулярные участки (паттерны) в структуре патогенов, инициируя развитие реакций как врожденного, так и приобретенного иммунного ответа, проводя в конечном итоге к элиминации возбудителя из организма. При этом каждый отдельный тип TLR способен связывать широкий спектр молекул микробного происхождения, различных по химическим свойствам и структуре. Таким образом, сегодня полученные данные позволяют повышать иммуногенность вакцинного антигена при совместном применении с веществами, способными взаимодействовать с паттерн-распознающими рецепторами, активация которых приводит к дополнительной стимуляции иммунных реакций. Перспективность описанного подхода подтверждается многочисленными клиническими испытаниями различных лигандов паттернраспознающих рецепторов в качестве молекулярных адъювантов для вакцин (O'Hagan D.T., MF59 is a safe and potent vaccine adjuvant that enhances protection against influenza virus infection MF59, Expert Rev. Vaccines, 2007, № 6(5), 699-710 -безопасный и эффективный вакцинный адъювант, который усиливает защиту против инфицирования вирусом гриппа), (Di Paolo D. et al., One-year vaccination against hepatitis В virus with a MPL-vaccine in liver transplant patients for HBV-reIated cirrhosis, Transplint, 2010, № 23(11), с.1105-1112 - Вакцинация продолжительностью один год против вируса гепатита В MPL-вакциной у пациентов с трансплантацией печени вследствие цирроза, вызванного вирусом гепатита В).

При разработке противогриппозных вакцин следует учитывать рекомендации ВОЗ, которые говорят о преимуществе использования сезонных трехвалентных вакцин, включающих H1N1 (Пандемический грипп H1N1, 2009, Краткое сообщение № 23, 10 августа 2010 г., Женева, доступен: http://www.who.int/csr/disease/swineflu/notes/briefing_20100810/ru/in dex.html).

Итак, для эффективной защиты против респираторных инфекций необходимо создание высокоиммуногенных интраназальных вакцин, вводимых однократно, которые способны одновременно защищать от различных штаммов вируса гриппа и других инфекционных возбудителей респираторных болезней человека.

Известна вакцина против пандемических штаммов вирусов гриппа на основе рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует как минимум один антиген штамма вируса птичьего гриппа (Заявка на выдачу патента США № 2008/0187557).

Существенным недостатком данной вакцины является наличие антигенов только птичьего гриппа (штамма H5N1, штамма H7N7 или штамма H9N2), что существенно сужает спектр ее специфичности и не позволяет использовать для профилактики сезонного гриппа человека, вызванного различными субтипами H ₁, а также других респираторных инфекционных болезней человека. Данная вакцина выбрана авторами в качестве аналога.

Известна также фармацевтическая композиция, содержащая как минимум 4 вектора, при этом каждый вектор способен экспрессировать гемагглютинины или их иммуногенные части различных штаммов вируса гриппа. Данная вакцина способна вызвать иммунный ответ у человека к целевым штаммам вируса гриппа (Заявка на выдачу патента США № 2010/00987221).

Вектором в данном техническом решении могут быть плазмиды и различные вирусные векторы, при этом в состав композиции могут вводиться адъюванты. Данное решение принято авторами за прототип.

Недостаткам данной композиции является необходимость проведения бустерной (повторной) вакцинации для получения протективного иммунитета к штаммам вируса гриппа из-за влияния антигенной конкуренции большого количества антигенов в составе вакцины на иммуногенность каждого из них. Кроме того, вакцина не способна активировать врожденный иммунитет и поэтому не индуцируют более широкую иммунную защиту от других видов микроорганизмов.

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание трехвалентной вакцины, которая обеспечит при однократном интраназальном введении протективный иммунный ответ у человека в течение 6 месяцев и более ко всем входящим в состав вакцины штаммам вируса гриппа, снижение стоимости производства и затрат препаратов, медицинского инструментария и рабочего времени медицинского персонала при обеспечении возможности быстрого создания вакцины из сезонных эпидемически значимых штаммов, снижение реактогенности вакцины, обеспечение широкого профилактического антимикробного спектра действия вакцины, направленной против возбудителей инфекционных заболеваний респираторного тракта.

Поставленная задача решается за счет того, что рекомбинантная трехвалентная вакцина от гриппа человека содержит рекомбинантный аденовирусный вектор, с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует гемагглютинин вируса гриппа, при этом в качестве рекомбинантного аденовирусного вектора используют нереплицирующиеся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-ого серотипа, способные экспрессировать гемагглютинины вируса гриппа, при этом она содержит композицию из трех типов нереплицирующихся наночастиц в эффективном количестве, каждая из которых несет отличные от других гены гемагглютинина вируса гриппа, вакцина также содержит дополнительно пептидогликан и буфер. Генами гемагглютинина вируса гриппа являются: Н1, Н3, НВ, любые рекомендованные на момент производства вакцины Всемирной Организацией Здравоохранения.

Буфер добавляют в композицию до достижения общего объема 0,5 мл, а эффективная доза нереплицирующихся наночастиц со вставкой гемагглютинина Н1, нереплицирующихся наночастиц со вставкой гемагглютинина Н3 и нереплицирующихся наночастиц со вставкой гемагглютинина НВ и пептидогликана содержится в 0,5 мл вакцины.

Рекомбинантная трехвалентная вакцина содержит в объеме 0,5 мл: нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гемагглютинина Н1 вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1) - не более 10⁷ ЕД активности; нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гемагглютинина Н3 вируса гриппа A/Perth/16/2009 (H3N2) - не более 10⁷ ЕД активности; нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гемагглютинина НВ вируса гриппа B/Brisbane/60/2008 - не более 10⁷ ЕД активности;

- пептидогликан - 1-20 мкг

- буфер - остальное.

В рекомбинантной трехвалентной вакцине в качестве пептидогликана используют кислый пептидогликан с молекулярной массой от 1200 до 40000 кДа.

Введение рекомбинантной трехвалентной вакцины осуществляют интраназально.

Реализация изобретения

Для решения поставленной задачи были использованы рекомендации ВОЗ, которая рекомендовала вести работы по трем направлениям: увеличение применения вакцин против сезонных эпидемий гриппа, обеспечение возможностей для наработки большого количества вакцин в случае пандемии и проведение исследований по получению новых эффективных вакцин, в том числе получение новых типов вакцин, таких как рекомбинантные вакцины, на основе вирусных векторов и вирусоподобных частиц (Abdulhaqq S. A., DNA Vaccines: developing new strategies to enhance immune responses, 2008, № 42, с.219-232 - Вакцины: разработка новых стратегий для усиления иммунного ответа).

Защита человека от постоянных атак вирусов гриппа осложняется трудностью прогнозирования появления новых пандемических и эпидемических штаммов, а также низкой перекрестной реактивностью вакцин, большинство из которых обеспечивают хорошую защиту только от того штамма вируса гриппа, из которого они были произведены, поэтому следующей задачей при разработке вакцины была поставлена задача создания трехвалентной вакцины, которая обеспечит протективный иммунный ответ у человека ко всем входящим в состав вакцины штаммам вируса гриппа, при этом обеспечивается снижение стоимости производства и затрат препаратов, медицинского инструментария и рабочего времени медицинского персонала.

Основная же задача состояла в том, чтобы обеспечить возможность быстрого создания вакцины из сезонных эпидемически значимых штаммов, при этом должна снижаться реактогенность вакцины, и обеспечиваться широкий профилактический антимикробный спектр действия вакцины, направленной против возбудителей инфекционных заболеваний респираторного тракта. При этом созданная вакцина должна вводиться однократно интраназально.

Учитывая перечисленные задачи была создана безопасная экономически выгодная высокоиммуногенная интраназальная рекомбинантная трехвалентная вакцина, содержащая нереплицирующиеся наночастицы на основе генома аденовируса 5-го серотипа, продуцирующая непосредственно на слизистой носовой полости 3 типа эпидемически значимых гемагглютининов вируса гриппа и обладающая способностью вызывать образование протективного иммунитета у человека при однократном введении ко всем входящим в состав штаммам вируса гриппа, а также обеспечивающая стимулирование врожденного иммунитета ко многим микроорганизмам, при этом вакцина пригодна для профилактики инфекционных заболеваний респираторного тракта человека, в частности гриппа.

Геном гемагглютинина Н1 может быть любой гемагглютинин субтипа Н1, в частности, рекомендуемый на момент производства вакцины ВОЗ в зависимости от эпидемической ситуации в мире (http://www.who.int/ru/), например Н1 калифорнийский.

Геном гемагглютинина Н3 может быть любой гемагглютинин субтипа Н3, в частности, рекомендуемый на момент производства вакцины ВОЗ в зависимости от эпидемической ситуации в мире (http://www.who.int/ru/), например Н1 пертский.

Геном гемагглютинина НВ может быть любой гемагглютинин субтипа НВ, в частности, рекомендуемый на момент производства вакцины ВОЗ в зависимости от эпидемической ситуации в мире (http://www.who.int/ru/), например НВ брисбанский.

Использование в фармацевтической и клинической практике заявляемой вакцины позволяет достичь нескольких технических, лечебных и экономических результатов:

- заявляемая вакцина безопасна для человека и вызывает протективный иммунитет к специфическим штаммам вируса гриппа;

- вакцина удобна для применения, так как вводится интраназально однократно для создания напряженного иммунитета на протяжении 6 месяцев и более;

- вакцина пригодна для профилактики гриппа человека, а также инфекционных заболеваний респираторного тракта различной этиологии;

- применение вакцины экономически оправдано, поскольку однократное введение обеспечивает профилактику инфекционных респираторных заболеваний человека, в том числе создает протективный иммунитет к специфическим штаммам вируса гриппа на протяжении всего предэпидемического и эпидемического периодов заболеваемости.

Указанные единые технические, лечебные и экономические результаты при осуществлении изобретения по объекту «вакцина» достигаются за счет того, что заявляемая вакцина осуществляется при помощи нереплицирующихся наночастиц на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, несущих вставку гена гемагглютинина вируса гриппа. Особенность заявляемой вакцины заключается в том, что содержание нереплицирующихся наночастиц, экспрессирующих различные гемагглютинины вируса гриппа (по 10⁷ ЕД активности каждого из 3-х входящих в состав вакцины типов), позволяет вызывать образование специфического протективного иммунитета к каждому из них при однократном интраназальном введении, а также обеспечивает активацию врожденного иммунитета к широкому спектру микроорганизмов, вызывающих заболевания респираторного тракта. Вакцина профилактирует инфекционные респираторные заболевания человека, в частности грипп.

Приведенные далее примеры раскрывают:

- Конструирование нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-ого серотипа со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа человека.

- Получение вакцины.

- Определение оптимальной дозы нереплицирующихся наночастиц.

- Определение оптимальной дозы иммуностимулятора.

- Определение оптимального объема вакцины.

- Определение иммуногенных и протективных свойств трехвалентной вакцины с иммуностимулятором.

Определение широких антимикробных свойств иммуностимулятора, входящего в состав вакцины.

Клиническая апробация рекомбинантной трехвалентной вакцины проводилась на 2-х группах добровольцев.

Приведенные в описании таблицы и рисунки подтверждают выполнение поставленной задачи.

Пример 1

Конструирование нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-ого серотипа со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа человека.

Конструирование нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-ого серотипа (размером 70-80 нм) со вставкой гена гемагглютинина (из перечня: Н1, Н3, НВ) вируса гриппа человека осуществляли методом гомологичной рекомбинации в клеточной культуре. За основу брали общеизвестную известную рекомбинантную плазмиду, например pJM17 (McGrory W.J. et al., A simple technique for the rescue of early regioni mutations into infectious human adenovirus type 5, Virology, V.163, № 2, 1988 - Простая техника для удаления раннего региона 1 в инфекционном аденовирусе человека 5 типа). Клонирование проводили с использованием общеизвестных лабораторных методик (например, Sambrook J. et al., Molecular cloning: а laboratory manual, 3rd ed., Russell, 2001, том 1, 2, 3 - Молекулярное клонирование - лабораторное руководство). Искусственно синтезированный кДНК гена гемагглютинина вируса гриппа (из перечня: Н1, Н3, НВ) лигировали в общеизвестную шаттл-плазмиду, например pACCMV.pLpA (Roth M.G., Methods in cell biology, № 43, с.175 - Методы в клеточной биологии), (Go' mez-Foix A. et al., Adenovirus-mediated transfer of the muscle glycogen phosphorylase gene into hepatocytes confers altered regulation of glycogen metabolism, J. Biol. Chem., 1992, № 267 (35), 15, с.25129-25134 - Обеспечиваемый аденовирусом перенос гена фосфорилазы мышечного гликогена в гепатоциты меняет регуляцию метаболизма гликогена). Далее, для взаимной трансформации полученной плазмиды pACCMV - Н и плазмиды pJM17 ими трансфецировали клетки 293 (например, № 300192, CLS, Germany) с помощью стандартного метода кальциево-фосфатной преципитации (Graham F.L. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA, Virology, 1973, № 52 (2), с.456-67 - Новая техника метода заражения ДНК аденовируса человека 5-ого серотипа). Получили нереплицирующиеся наночастицы на основе аденовируса человека 5-ого серотипа с делециями в области Е1 и ЕЗ генома аденовируса. В области Е1 нереплицирующиеся наночастицы содержали экспрессирующую кассету с CMV-промотором, геном гемагглютинина вируса гриппа (из перечня: Н1, Н3, НВ) и сигналом полиаденилирования. То есть в результате получили 3 типа нереплицирующихся наночастиц. Тип Н1 выбрают в зависимости от сезонной эпидемиологической ситуации, в период проведения конструирования за Н1 был взят Н1 калифорнийский. Типы Н3 и НВ также выбрают в зависимости от сезонной эпидемиологической ситуации, в период проведения конструирования за Н3 был взят Н3 пертский, за НВ был взят НВ брисбанский.

Бляшки нереплицирующихся наночастиц образовывались на культуре клеток через несколько дней после трансфекции, их отбирали пастеровской пипеткой, полученный материал размножали на клетках линии 293 до получения 10⁸ ЕД активности на мл суспензии.

Пример 2

Получение вакцины.

Исходя из рекомендованных в примерах 3, 4, 5 доз, содержание в вакцине каждого из трех типов нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа (Н1, Н3, НВ), созданных на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, должно составлять не более 10⁷ ЕД активности, а иммуностимулятора от 1 до 20 мкг в 0,5 мл вакцины. Получение данной вакцины проходит в несколько этапов.

Для этого полученную в предыдущем примере клеточную суспензию, содержащую нереплицирующиеся наночастицы в титре 10⁸ ЕД на мл, использовали для дальнейшего наращивания титров нереплицирующихся наночастиц и приготовления готовой вакцины с заданным содержанием нереплицирующихся наночастиц каждого из 3-х типов не более 10⁷ ЕД активности, а также от 1 до 20 мкг иммуностимулятора в 0,5 мл вакцины.

Таким образом, для наработки необходимых титров нереплицирующихся наночастиц волновой биореактор с 4500 мл суспензии пермиссивной клеточной культуры 293 засевали клеточной суспензией объемом 500 мл, содержащей нереплицирующиеся наночастицы с титром 10 ⁸ ЕД активности на мл.

Культивировали для наращивания нереплицирующихся наночастиц внутри клеток и достижения их активности 2×10⁸ ЕД/мл, ориентировочно в течение 48 часов. По достижению необходимого содержания клеточную массу подавали на очистку, которая состояла из нескольких стадий:

1) Проводили осаждение клеточной массы центрифугированием. Поступающая на очистку суспензия имела не менее 3,3×10 ¹¹ частиц на 5 л. Центрифугирование проводили при режиме 6000 g в течение 15 мин, при этом жидкий надосадок сливали, а оставшуюся твердую часть, содержащую клетки и нереплицирующиеся наночастицы, подавали на дальнейшие стадии очистки.

2) Извлечение нереплицирующихся наночастиц из клеточной культуры проводили путем разрушения клеток четырехкратным перемораживанием-оттаиванием. Готовили буферный раствор с рН 8,0: 5 mМ ТрисНСl, 0,075 MNaCl, 1 mM MgCl₂, 5% сахароза, 1% полисорбат 80. Полученный в предыдущую стадию осадок ресуспендировали в 70 мл буфера (коэффициент содержания × 71). Объем раствора составлял 80 мл.

Замораживание проводили в течение 2 часов в жидком азоте, размораживали на водяной бане (при +37°С), не допуская перегрева.

3) Для облегчения дальнейшего удаления геномной клеточной ДНК проводили дополнительную обработку нуклеазой. Для этого добавляли бензоназу до концентрации в растворе 150 U/мл и ставили на мягкое перемешивание с помощью магнитной мешалки на 3 часа при комнатной температуре (21-23°С).

4) Отделение нереплицирующихся наночастиц от разрушенных клеток осуществляли центрифугированием при 9000g 10 мин. Отбирали супернатант, содержащий нереплицирующиеся наночастицы.

5) Дальнейшую очистку проводили ультрафильтрацией. Для этого полученный супернатант разводили буфером (50 mM TrisHCl рН 7,5, 1М NaCl, 2 mM MgCl₂, 5% сахароза, рН 7,5) до объема не менее 200 мл перемешиваем с помощью магнитной мешалки. В процессе фильтрации объем циркулирующего раствора (ретентата) постоянно доводили до исходного (200 мл).

6) Далее очистку производили путем анион-обменной хроматографии.

Ретентат наносили на колонку (AxiChrom 70/300 объемом 400 мл), содержащую анионнообменный сорбент Q Sepharose virus licenced. Нереплицирующиеся наночастицы сорбируются на колонке, в то время как примеси не сорбируются, а вымываются буфером А. После удаления примесей нереплицирующиеся наночастицы десорбировали промывкой буфером Б. Условия хроматографирования: поток 193 мл/мин, буфер A (40mM TrisHCl, 0,27 М NaCl, 2mM MgCl₂, 5% Сахароза, 0,1% Полисорбат 80, рН 7,5), проводимость ×~28-30 mS/cm; буфер Б (40 mM TrisHCl, 0,5M NaCl, 2mM MgCl₂, 5% сахароза, 0,1% полисорбат 80, рН 7,5), проводимость ~50 mS/cm. Элюат в объеме 200 мл отправляли на следующую стадию.

7) Эксклюзионная хроматогафия.

Полученный в предыдущей стадии элюат наносили на колонку (AxiChrom 100/300 объемом 800 мл), содержащую сорбент Q Sepharose 4 FastFlow. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры сорбента, элюировали первым пиком (к ним относятся нереплицирующиеся наночастицы), примеси элюировали после выхода пика нереплицирующихся наночастиц. Условия хроматографирования: поток 130 мл/мин, буфер (10 mM TrisHCl, 75 мМ NaCl, 1 mM MgCl ₂, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, рН 8,0).

К полученномуй элюату (80 мл) добавляли этанол до концентрации 0,5% и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до концентрации 100 мкМ, отправляли на следующую стадию.

8) Нормальная фильтрация.

Для стерилизации полученного препарата проводили фильтрование через систему фильтров с размером пор 22 мкМ. Конечный объем препарата на данной стадии составлял 80 мл и содержал нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа одного типа в титре 3,3×10 ¹¹ ЕД/мл. Его разбавляли формулирующим буфером (например, 10 mM TrisHCl, 75mM NaCl, 1mM MgCl₂, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, 0,5% Этанол, 100 мкм ЭДТА, рН 8,0) до получения заданной активности 10⁷ ЕД на 0,1 мл, что позволяло длительно хранить препарат при температуре от +4 до +6°С без потери активности.

Для формулирования готовой вакцины к от 1 до 20 мкг иммуностимулятора (патент РФ 2195308), содержащемся в 0,1 мл дистиллированной воды, добавляли полученные в предыдущую стадию препараты 3-х типов нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена гемагглютинина (из перечня: Н1, Н3, НВ) вируса гриппа с активностью не более 10⁷ ЕД, по 0,1 мл каждого препарата (т.е. всего добавляли 0,3 мл) и доводили формулирующим буфером до объема 0,5 мл. Далее стерилизовали нормальной фильтрацией. Таким образом, поставленная задача по приготовлению вакцины выполнена.

Пример 3

Определение оптимальной дозы нереплицирующихся наночастиц.

Определение дозы нереплицирующихся наночастиц проводили с помощью оценки иммуногенной и протективной активности нереплицирующихся наночастиц, экспрессирующих гены 3-х типов гемагглютинина вируса гриппа.

В качестве экспериментальных животных использовали мышей Balb/c весом 7-9 грамм. Для иммунизации лабораторных мышей животные были разбиты на группы не менее 10 особей, иммунизацию проводили под легким эфирным наркозом. В качестве контрольных использовалась группа мышей, получавших 0,9% раствор NaCl. Заражение животных вирусами гриппа птиц или отбор крови для анализа сывороток проводился через три недели после иммунизации.

Для определения вышеописанной оптимальной дозы нереплицирующихся наночастиц на основе генома аденовируса человека 5, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1), мыши были однократно интраназально иммунизированы нереплицирующимися наночастицами в дозе 10⁵ и 10⁷ ЕД на животное. Объем вводимых растворов составил 50 мкл. Через три недели после иммунизации у животных брали кровь для определения в сыворотке крови уровня антител к вирусу гриппа A/California/07/09 (H1N1) и проводили заражение животных летальной дозой вируса гриппа H1N1, адаптированного для мышей.

Уровень специфических антител к вирусу гриппа H1N1 определяли с помощью стандартных реакций вирус-нейтрализации (РВН) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Оценку уровня вирус-нейтрализующих антител к вирусу гриппа H1N1 в сыворотках крови иммунизированных мышей проводили по стандартной методике. Согласно результатам реакции вирус-нейтрализации у группы животных, иммунизированных нереплицирующимися наночастицами в дозе 10⁵ ЕД на животное, наблюдалось повышение титров до 1/10, что означает иммуногенность данной дозы. У животных, получавших нереплицирующиеся наночастицы в дозе 10⁷ ЕД, наблюдалось повышение уровня антител в пределах значений титров 1/10-1/20, что означает иммуногенность данной дозы.

Уровень специфических антител к гемагглютинину вируса гриппа H1N1 в сыворотке крови животных, иммунизированных вакциной, определяли с помощью стандартной методики РТГА (реакции торможения гемагглютинации).

На рисунке 1 представлены результаты РТГА:

1 - уровень специфических антител к гемагглютинину вируса гриппа H1N1 в сыворотках крови мышей, интраназально иммунизированных нереплицирующимися наночастицами со вставкой гена гемагглютинина в дозе 10⁵ ЕД на животное;

2 - уровень специфических антител к гемагглютинину вируса гриппа H1N1 в сыворотках крови мышей, интраназально иммунизированных нереплицирующимися наночастицами со вставкой гена гемагглютинина в дозе 10⁷ ЕД на животное;

3 - контрольное вещество (0,9% раствор NaCl).

Таким образом, титр антител к гемагглютинину вируса гриппа птиц в сыворотках крови мышей, получавших нереплицирующиеся наночастицы в дозе 10⁵ ЕД/мышь, составил 4,2 log ₂ (средний геометрический титр, СГТ 1/20). Титр антител к гемагглютинину вируса гриппа птиц в сыворотках крови мышей, получавших нереплицирующиеся наночастицы в дозе 10⁷ ЕД/мышь, составил 5,8 log₂ (средний геометрический титр, СГТ 1/64). При вакцинации контрольным веществом титр составил 2,7 log₂, т.е. СГТ менее 1/10, что означает отсутствие иммуногенности.

Титр 10⁷ ЕД/мышь является немного более иммуногенным по сравнению с титром 10⁵ ЕД/мышь и в РВН, и в РТГА.

Для изучения протективных (защитных) свойств вакцинации мышей нереплицирующимися наночастицами в двух разных дозах иммунизированных животных заражали летальной дозой вируса гриппа H1N1. Заражение проводили через 21 день после иммунизации интраназально, под легким эфирным наркозом. Животных наблюдали в течение 14 дней после заражения.

На рисунке 2 представлены кривые выживаемости мышей (А) и изменения их веса (Б) после заражения летальной дозой вируса гриппа H1N1:

Кривая 1 ( ) - иммунизация мышей в дозе 10⁵ ЕД на животное;

Кривая 2 ( ) - иммунизация мышей в дозе 10⁷ ЕД на животное;

Кривая 3 (Ж) - контрольное вещество (0,9% раствор NaCl).

Таким образом, результаты, представленные на рисунке, показывают, что мыши, интраназально иммунизированные нереплицирующимися наночастицами в дозе 10⁵ ЕД, так же как и 10⁷ ЕД на животное, в 100% случаев защищены от гибели и проявления признаков заболевания (резкого падения веса).

Дозы нереплицирующихся наночастиц со вставкой гемагглютинина Н1 вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1), со вставкой гемагглютинина Н3 вируса гриппа A/Perth/16/2009 (H3N2); со вставкой гемагглютинина НВ вируса гриппа B/Brisbane/60/2008, рекомендованных ВОЗ на 2011-2012 гг., в результате исследований были определены как не более 10⁷Д активности каждой из перечисленных.

Пример 4

Определение оптимальной дозы иммуностимулятора, в качестве которого был выбран пептидогликан.

Для повышения иммуногенности выбранной в предыдущем примере дозы нереплицирующихся наночастиц, несущих ген гемагглютинина вируса гриппа и расширения противоинфекционного спектра действия вакцины, выбрали кислый пептидогликан с молекулярной массой от 1200 до 40000 кДа (патент РФ 2195308). Определение оптимальной дозы иммуностимулятора проводили при иммунизации лабораторных мышей Balb/c, весом 7-9 г. однократно, интраназально нереплицирующимися наночастицами в дозе 10⁷ ЕД на животное. При этом были использованы три дозы иммуностимулятора - 1, 10 и 20 мкг на мышь. Общий объем смеси нереплицирующихся наночастиц и иммуностимулятора, вводимой животным, составил 50 мкл. Через три недели после иммунизации у животных отбирали кровь и оценивали уровень антител к вирусу гриппа A/California/07/09 (H1N1) с помощью стандартных методик РТГА (реакции торможения гемагглютинации) и РВН (реакции вирус-нейтрализации). Результаты представлены на рисунках 3 и 4.

На рисунке 3 представлены уровни специфических антител к гемагглютинину вируса гриппа H1N1, определенный в РТГА в сыворотках крови мышей, интраназально иммунизированных нереплицирующимися наночастицами в дозе 10 ⁷ ЕД на животное в смеси с иммуностимулятором в дозах:

1 - без иммуностимулятора;

2-1 мкг на животное;

3-10 мкг на животное;

4 - 20 мкг на животное;

5 - контрольное вещество (0,9% раствор NaCl).

На рисунке 3 видно значительное повышение иммуногенности нереплицирующихся наночастиц в смеси с иммуностимулятором во всех предложенных дозах - 1, 10 и 20 мкг на животное по сравнению с наночастицами, введенными без иммуностимулятора, а также контрольным веществом.

На рисунке 4 представлен уровень специфических антител к гемагглютинину вируса гриппа H1N1, определенный в РВН в сыворотках крови мышей, интраназально иммунизированных нереплицирующимися наночастицами в дозе 10⁷ ЕД на животное в смеси с иммуностимулятором в дозах:

1 - без иммуностимулятора;

2 - 1 мкг на животное;

3 - 10 мкг на животное;

4 - 20 мкг на животное;

5 - контрольное вещество (0,9% раствор NaCl).

На рисунке 4 также видно значительное повышение иммуногенности нереплицирующихся наночастиц в смеси с иммуностимулятором во всех предложенных дозах 1, 10 и 20 мкг на животное по сравнению с наночастицами, введенными без иммуностимулятора, а также контрольным веществом (отражает фоновый уровень антител).

Аналогичные результаты (повышение иммуногенности) вышеописанного эксперимента получили при использовании в качестве иммуностимулятора пептидогликана клеточной стенки бактерий (препарат «Гликопин») в дозах 1, 10 и 20 мкг на мышь.

Таким образом, у мышей, получавших иммуностимулятор в дозах 1, 10 и 20 мкг на мышь, был показан значительный прирост антител по сравнению с группой, не получавшей иммуностимулятор, как в РТГА, так и в РВН.

Таким образом, были определены дозы иммуностимулятора в пределах от 1 мкг до 20 мкг, эффективно повышающие иммуногенность нереплицирующихся наночастиц в составе фармацевтической композиции.

Пример 5

Определение оптимального объема вакцины.

Для определения оптимального объема для интраназальной иммунизации мышам Balb/c, весом 7-9 г. однократно, интраназально вводили смесь нереплицирующихся наночастиц в дозе 10⁷ ЕД на животное и иммуностимулятора в дозе 20 мкг на животное. При этом вакцину с иммуностимулятором в общем объеме 5, 20 и 50 мкл делили пополам и вводили в каждую ноздрю. Через три недели после иммунизации у мышей отбирали кровь и в реакциях торможения гемагглютинации (РТГА) и вирус-нейтрализации (РВН) определяли уровни антител к вирусу гриппа. Результаты эксперимента представлены на рисунках 5 и 6.

На рисунке 5 представлены уровни специфических антител к гемагглютинину вируса гриппа H1N1, определенных в РТГА в сыворотках крови мышей, интраназально иммунизированных вакциной, содержащей нереплицирующиеся наночастицы в дозе 10 ⁷ ЕД и иммуностимулятор в дозе 20 мкг на животное, то есть в исследуемых объемах содержалось равное количество действующих веществ. Вакцину вводили мышам в объемах:

1 - 5 мкл;

2 - 20 мкл;

3 - 50 мкл;

4 - контрольное вещество (0,9% раствор NaCl).

На рисунке видно, что наибольшую иммуногенность показали вакцины объемом 20 и 50 мкл.

На рисунке 6 представлены уровни специфических антител к гемагглютинину вируса гриппа H1N1, определенных в РВН в сыворотках крови мышей, интраназально иммунизированных вакциной, содержащей нереплицирующиеся наночастицы в дозе 10⁷ ЕД и иммуностимулятор в дозе 20 мкг на животное. Вакцину вводили мышам в объемах:

1 - 5 мкл;

2 - 20 мкл;

3 - 50 мкл;

4 - контрольное вещество (0,9% раствор NaCl).

На рисунке видно, что наибольшую иммуногенность показали вакцины объемом 20 и 50 мкл.

Таким образом, объем вакцины 5 мкл является недостаточным для эффективного проникновения нереплицирующихся наночастиц в клетки дыхательных путей и формирования иммунного ответа против вируса гриппа. При этом иммунизация как в объеме 20, так и в объеме 50 мкл оказалась достаточно эффективной для формирования высокого уровня противогриппозных антител. Аналогичные результаты по иммуногенности показала фармацевтическая композиция того же состава, но с уменьшенным количеством иммуностимулятора - 1 мкг.

Для удобства применения оптимальными объемом для иммунизации мышей можно считать объем вакцины 20 мкл, для человека брали объем 50 мкл, т.е. 0,5 мл (что совпадает с объемом большинства известных назальных противогриппозных вакцин).

Таким образом, оптимальным содержанием компонентов смеси для проведения иммунизации лабораторных мышей против гриппа является доза нереплицирующихся частиц, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа 10⁷ ЕД, иммуностимулятор - 1-20 мкг на животное, в объеме 50 мкл (доводили формулирующим буфером при приготовлении).

Пример 6

Определение иммуногенных и протективных свойств трехвалентной вакцины с иммуностимулятором.

После определения в примерах 3, 4, 5 соотношения отдельных компонентов вакцины подтвердили иммуногенность вакцины, содержащую по 10⁷ ЕД каждой из 3-х типов нереплицирующихся наночастиц, несущих различные гемагглютинины вируса гриппа (Н1, Н3, НВ).

Иммуногенность такой трехвалентной вакцины с иммуностимулятором изучали на мышах линии Balb/c, весом 7-9 г, самках, иммунизированных в 0 день интраназально 20 мкл вакцины, содержащей 10⁷ ЕД активности каждого типа нереплицирующихся наночастиц, экспрессирующих гены гемагглютининов вируса гриппа, и 20 мкг иммуностимулятора. Контрольным мышам вводили интраназально 20 мкл физиологического раствора. Взятие биологического материала (кровь) осуществляли у 5 мышей каждой группы на 21 день после иммунизации. В сыворотке крови определяли титры гемагглютинирующих антител в РТГА (реакции торможения гемагглютинации) к штаммам вирусов гриппа A/California/07/09 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2), B/Brisbane/60/2008. В таблице 1 представлены титры специфических антител в сыворотке крови на 21 сутки после иммунизации мышей трехвалентной вакциной с иммуностимулятором.

Таблица 1
Гемагглютинирующие антитела в РТГА (средний геометрический титр)
Против вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1)	970,1±350,5
Против вируса гриппа A/Perth/16/2009 (H3N2)	5120±0,0
Против вируса гриппа B/Brisbane/60/2008	430,5±362,0
Против вирусов гриппа у неиммунизированных мышей (контроль)	<8

По результатам таблицы 1 видно, что средний геометрический титр гемагглютинирующих антител в РТГА на 21 сутки к A/California/07/09 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2) и B/Brisbane/60/2008 у иммунизированных мышей был значительно выше, чем у животных из контрольной группы.

Вышеописанным методом была также испытана вакцина, содержащая 10⁵ ЕД активности каждого типа нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена гемагглютинина и 20 мкг иммуностимулятора. Также была испытана вакцина, содержащая 10⁵ ЕД активности каждого типа нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена гемагглютинина и 1 мкг иммуностимулятора. В обоих случаях была показана чуть меньшая по сравнению с вышеописанным примером, но, в целом, достаточная иммуногенность композиций.

Таким образом, по данным РТГА доза 3-х типов нереплицирующихся наночастиц, экспрессирующих различные гемагглютинины вируса гриппа, не более 10⁷ ЕД активности каждого в вакцине достаточна для формирования хорошего специфического гуморального ответа у животных.

Для оценки протективности иммунитета, сформировавшегося после введения трехвалентной вакцины, мыши на 21 день после иммунизации были заражены летальной дозой вирусов гриппа: 1-я группа-A/California/07/09 (H1N1), 2-я группа - Aichi/2/68(H3N2), 3-я группа - B/Brisbane/60/2008, адаптированными для мышей. Три контрольные группы заражали теми же штаммами по-отдельности, но мыши не были вакцинированы перед заражением. После заражения лабораторных мышей наблюдение за ними проводили в течение 14 дней. При этом фиксировалась выживаемость и падение веса животных.

На рисунке 7 показаны кривые выживаемости мышей, иммунизированных трехвалентной вакциной, после заражения летальными дозами вирусов гриппа А - H1N1, H3N2 и гриппа В. Кривые и названия соответствующих штаммов, которыми проводили заражение мышей:

1 ( ) - A/California/07/09 (H1N1) (вакцина);

2 (X) - Aichi/2/68(H3N2) (вакцина);

3 (Ж) - B/Brisbane/60/2008 (вакцина);

4 ( ) - A/California/07/09 (H1N1) (контроль);

5 ( ) - Aichi/2/68(H3N2) (контроль);

6 ( ) - B/Brisbane/60/2008 (контроль).

На рисунке 8 представлены кривые падения веса мышей, иммунизированных трехвалентной вакциной, после заражения летальными дозами вирусов гриппа А H1N1, H3N2 и В. Кривые:

1 ( ) - A/California/07/09 (H1N1) (вакцина);

2 (X) - Aichi/2/68(H3N2) (вакцина);

3 (Ж) - B/Brisbane/60/2008 (вакцина);

4 ( ) - A/California/07/09 (H1N1) (контроль);

5 ( ) - Aichi/2/68(H3N2) (контроль);

6 ( ) - B/Brisbane/60/2008 (контроль).

Из рисунков 7 и 8 следует, что мыши, иммунизированные трехвалентной вакциной, были полностью защищены от заражения высокими дозами вирусов гриппа и не теряли в весе в течение всего периода наблюдения в отличие от контрольных животных.

Вакцина, содержащая 10⁵ ЕД активности каждого типа нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена гемагглютинина и 20 мкг иммуностимулятора, и вакцина, содержащая 10⁵ ЕД активности каждого типа нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена гемагглютинина и 1 мкг иммуностимулятора, также были исследованы вышеописанным методом на иммуногенность. Полученные результаты были аналогичны, представленным на рисунках 7 и 8.

При этом животные, получавшие физиологический раствор, полностью погибали в течение 11 дней после заражения любым из 3-х вирусов гриппа.

Таким образом, было показано, что однократная интраназальная иммунизация лабораторных мышей трехвалентной вакциной с иммуностимулятором приводит к индукции протективного иммунного ответа против заражения высокими дозами вирусов гриппа. При этом иммунизированные мыши полностью защищены от заражения летальными дозами соответствующих штаммов вируса гриппа.

Пример 7

Определение широких антимикробных свойств иммуностимулятора, входящего в состав вакцины.

Для определения способности активировать врожденный иммунитет и, соответственно, широкую антимикробную защиту иммуностимулятором, входящим в состав вакцины, оценивали способность иммуностимулятора специфически связываться с Тоll-подобными (TLR) рецепторами человека в условиях in vitro (Тухватулин А.И. и др., Toll-подобные рецепторы и их адапторные молекулы, Биохимия, 2010, т.75, № 9, с.1224). В экспериментах применяли стандартные методики с использованием набора эукариотических клеточных линий на основе линии клеток эмбрионального почечного эпителия человека (НЕК293), экспрессирующих различные типы Тоll-подобных рецепторов.

Стандартно клетки линии НЕК293 не экспрессируют Toll-подобные рецепторы человека. Вышеозначенное свойство клеток линии НЕК293 позволяет создать на их основе набор сублиний, в геном которых генно-инженерными методами введены гены различных Toll-подобных рецепторов человека. Кроме того, для детекции взаимодействия лиганда с Toll-подобным рецептором и активации последнего в геном клеток был введен репортерный ген галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотера.

При связывании добавляемого к клеткам лиганда с соответствующим Toll-подобным рецептором на поверхности описанных клеток происходит инициация нижележащего внутриклеточного сигнального каскада, приводящая, в конечном счете, к активации транскрипционного фактора NF-kB, который затем мигрирует в ядро и связывается с собственным промотерным участоком, запуская экспрессию репортерного гена галактозидазы.

Такая схема позволяет количественно определять взаимодействие лиганда с соответствующим Toll-подобным рецептором и его последующую активацию колориметрическим методом. В ходе данного метода в лизирующий клетки буфер добавляется неокрашенный субстрат галактозидазы - O-нитрофенилгалактопиранозид (ONPG), который подвергаясь расщеплению ферментом, превращается в окрашенный продукт. Интенсивность окраски (оптическая плотность) раствора прямопропорциональна интенсивности активации Toll-подобного рецептора, активации транскрипционного фактора NF-kB и последующей экспрессии репортерного гена галактозидазы.

В работе использовались 3 сублинии клеток (НЕК293-hTLR2/CD14, HEK293-hTLR4/CD14-MD2, HEK293-hTLR5), экспрессирующие следующие типы Toll-подобных рецепторов: TLR2/CD14, TLR4/CD14-MD2, TLR5, соответственно.

Для подтверждения специфичности взаимодействия молекул исследуемого образца с Toll-подобными рецепторами в эксперименте использовались контрольные клетки, не экспрессирующие Toll-подобный рецептор, однако содержащие в своем геноме репортерный ген галактозидазы под контролем NF-kB зависимого промотера - HEK293-hTLRnull.

Отсутствие цитопатического действия анализируемых образцов, которое может стать причиной отсутствия активации NF-kB, и как следствие, сниженного уровня экспрессии -галактозидазы, было определено, используя метод определения выживаемости эукариотических клеток окрашиванием метиленовым голубым.

Клетки линии HEK293-hTLR2/CD14, HEK293-hTLR4/CD14-MD2, HEK293-hTLR5, HEK293-hTLRnuII пассировались на 25 см² культуральном матрасе в культуральной среде DMEM с 10% эмбриональной сывороткой при 37°С, 5% CO₂. Для проведения эксперимента клетки были рассеяны на 96 луночный планшет из расчета 2*10 ⁴ клеток на лунку. Объем среды в лунке составлял 100 мкл. После рассева клеток планшет инкубировали при + 37°С и 5% С0₂ в течение 18-24 часов.

На следующий день к клеткам были добавлены исследуемые образцы иммуностимулятора в объеме 10 мкл (1/10 от исходного объема среды в лунке) с различными концентрациями. В обоих экспериментах использовались следующие рабочие концентрации иммуностимулятора: 50 мкл/мл, 5 мкл/мл, 500 нг/мл, 50 нг/мл, 5 нг/мл, 500 пг/мл, 50 пг/мл. Отрицательным контролем (К-) эксперимента служили интактные клетки. В качестве положительного контроля, подтверждающего функциональность Toll-подобных рецепторов, экспрессирующихся различными клеточными линиями, использовались клетки, к которым добавляли известные лиганды соответствующих-подобных рецепторов: липополисахарид (ЛПС) E.coli - лиганд Toll-подобного рецептора 4, синтетический липопептид (Rpam) - лиганд Toll-подобного рецептора 2, белок флагеллин - Toll-подобного рецептора 5. В случае контрольных неэкспрессирующих Toll-подобные рецепторы клеток (НЕК293-hTLRnuIl) положительный контроль составляли клетки, к которым добавляли фактор некроза опухоли альфа (ФНО ), который способен активировать транскрипционный фактор NF-kB, связываясь с собственным рецептором (TNFR) на поверхности клеток линии НЕК293. На третьи сутки после добавления препарата измеряли уровень экспрессии -галактозидазы, а также определялась токсичность доз анализируемого вещества окрашиванием живых клеток красителем метиленовым голубым.

По результатам эксперимента была определена активность иммуностимулятора, входящего в состав вакцины, к следующим типам Toll-подобных рецепторов: TLR2/CD14, TLR4/CD14-MD2 и TLR5.

Таким образом, иммуностимулятор, входящий в состав вакцины, активирует Toll-подобные рецепторы (TLR), которые являются одними из ключевых рецепторов врожденной иммунной системы млекопитающих, активация которых означает наличие широкого антимикробного спектра действия. Задача по приданию вакцине способности активировать врожденный иммунитет достигнута.

Пример 8

Клиническая апробация рекомбинантной трехвалентной вакцины проводилась на 2-х группах добровольцев, содержащих по 10 здоровых не иммунных к вирусу гриппа людей (3-я группа -контрольная, вводили 0,9% раствор NaCl). Вакцина содержала нереплицирующиеся наночастицы, экспрессирующие гемагглютинины вируса гриппа каждого из трех типов.

Вакцина в объеме 50 мкл содержала по 10⁷ ЕД каждой из 3-х типов нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена гемагглютинина (Н1, Н3, НВ) и 20 мкг иммуностимулятора. Человеку в каждую ноздрю вводили половину данного объема вакцины (т.е. по 25 мкл) капельно с помощью стерильной пипетки. Введение осуществляли однократно. В день введения вакцины и на 21 сутки у всех иммунизированных были взяты пробы крови для исследования на наличие антител в стандартной РТГА (реакции торможения гемагглютинации) к специфическому антигену, входящему в состав вакцины. Известно, что протективный уровень гемагглютинирующих антител, способный создать защиту от заболевания гриппом у 50% людей составляет 40 (Coudeville L. et al. Relationship between haemagglutination inhibiting antibody titres and clinical protection against influenza: development and application of a bayesian random-effects model, BMC Medical Research Methodology, 2010 - Связь между титрами гемагглютининов и клинической защитой против гриппа: разработка и применение байесовской модели случайных эффектов); http://www.biomedcentral.com/1471-2288/10/18. - Связь между титрами гемагглютинирующих антител и клинической защитой от гриппа: разработка и применение байесовской модели случайных эффектов). Полученные результаты отражены в таблице 2.

Таблица 2
Типы	% титров 40
экспрессируемых вакциной гемагглютининов вируса гриппа	Н1	Н3	НВ
Н1, Н3, НВ	80,9±0,2	83,6±0,3	88,3±0,5
0,9% раствор NaCl (контрольное вещество)	0	0	0

Таким образом, результаты таблицы показывают у большинства людей (не менее чем у 80,9±0,2%) образование протективного уровня специфических гемагглютинирующих антител к каждому из типов рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемому нереплицирующимися наночастицами трехвалентной вакцины.

Протективные уровни специфических антител к гемагглютининам вируса гриппа сохранялись на протяжении 6 месяцев и более. Пробы крови у людей для РТГА брали на 0, 2, 5, 16, 24, 28-ую недели, титры составили соответственно <1/10, 1/20, 1/500, 1/500, 1/200, 1/100.

На рисунке 9 представлена кривая уровня специфических антител к гемагглютинину вируса гриппа Н1. Кривые:

1 (-) - протективный уровень гемагглютинирующих антител;

2 ( ) - уровень антител к Н1.

На представленном рисунке кривая уровня гемагглютинирующих антител поднимается выше известного протективного уровня гемагглютинирующих антител, начиная с 3-й недели, и продолжает быть выше, по крайней мере, до 28-ой недели, что обозначает наличие защиты от вируса гриппа в течение не менее 6 месяцев.

Титры специфических гемагглютинирующих антител к рекомбинантным Н3 и НВ проявляли аналогичную представленной на рисунке 9 динамику, то есть также были протективными на протяжении не менее 6 месяцев.

Таким образом, в результате иммунизации рекомбинантной трехвалентной вакциной с иммуностимулятором, титры антител в РТГА, полученные к каждому из трех экспрессирующихся наночастицами гемагглютининов, входящих в состав, у большинства людей были протективными, что позволяет использовать вакцину для создания широкого иммунного охвата населения при эпидемиологических показаниях. Введение рекомбинантной трехвалентной вакцины с иммуностимулятором людям не вызывало каких-либо местных или общих поствакцинальных побочных эффектов и легко переносилось организмом.

Таким образом, по сравнению с прототипом, преимуществами заявленной рекомбинантной трехвалентной вакцины, содержащей нереплицирующиеся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, продуцирующие различные типы гемагглютининов вируса гриппа, и иммуностимулятор, являются:

- однократное введение для получения протективного иммунного ответа у человека в течение 6 месяцев и более ко всем входящим в состав вакцины штаммам вируса гриппа;

- снижение затрат препаратов, медицинского инструментария, рабочего времени медицинского персонала;

- быстрая возможность создания трехвалентной вакцины из сезонных эпидемически значимых штаммов;

- снижение титра нереплицирующихся нананочастиц со вставкой гена гемагглютинина, необходимого для создания протективного иммунитета у человека, в 10 раз по каждому входящему в состав вакцины штамму;

- снижение реактогенности вакцины;

- снижение стоимости производства;

- широкий профилактический антимикробный спектр действия, направленный против возбудителей инфекционных заболеваний респираторного тракта.

Приведенные в описании примеры, таблицы и рисунки подтверждают выполнение поставленной задачи, а именно: создание трехвалентной вакцины, которая обеспечит при однократном интраназальном введении протективный иммунный ответ у человека в течение 6 месяцев и более ко всем входящим в состав вакцины штаммам вируса гриппа, снижение стоимости производства и затрат препаратов, медицинского инструментария и рабочего времени медицинского персонала при обеспечении возможности быстрого создания вакцины из сезонных эпидемически значимых штаммов, снижение реактогенности вакцины, обеспечение широкого профилактического антимикробного спектра действия вакцины, направленной против возбудителей инфекционных заболеваний респираторного тракта.