средство, обладающее ранозаживляющей активностью

Классы МПК:A61K31/4375  гетероциклическая система, содержащая шестичленное кольцо с азотом в качестве гетероатома, например хинолизины, нафтиридины, берберин, винкамин
A61K36/714 Aconitum (борец, аконит)
A61P17/02 для обработки ран, язв, ожогов, шрамов, келоидов или подобных заболеваний
Автор(ы):, , , , , , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ фармакологии" СО РАМН) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2012-04-04
публикация патента:

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, к средству, обладающему ранозаживляющей активностью. Применение гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью. Гипактонитин обладает выраженной ранозаживляющей активностью. 6 табл., 1 пр.

Формула изобретения

Применение гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям.

Известно большое количество средств, обладающих ранозаживляющей активностью: метилурапил, солкосерил, облепиховое масло, натрия нуклеинат и др. [1, 2].

Недостатком данных средств является зачастую их низкая эффективность [2].

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих выраженной ранозаживляющей активностью.

Поставленная задача достигается применением гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью.

Новым в предлагаемом изобретении является использование гипаконитина в качестве средства, обладающего ранозаживляющей активностью.

Используемое оригинальное средство гипаконитина разработано и получено ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г. Томск) совместно с Национальным исследовательским Иркутским Государственным Техническим Университетом (г. Иркутск) и представляло собой 0,00025% водный раствор данного алкалоида. Гипаконитин извлекался из травы растений семейства лютиковых в виде свободных оснований экстракцией стандартным методом [3].

Важная роль в регенерации тканей принадлежит резидентным прогениторным, в том числе стволовым (СК), клеткам [4, 5]. При этом существует фармакологическая стратегия регенеративной медицины, заключающаяся в стимуляции эндогенных родоначальных элементов [5]. Причем активация последних может являться следствием как прямого воздействия фармакологических агентов на прогениторные элементы, так и результатом стимуляции клеток микроокружения тканей, опосредованно определяющей ускоренное течение репаративных процессов [5, 6].

Ранее авторами было показано ускорение заживления ран кожи комплексными экстрактами и алкалоидной фракцией живокости высокой [7]. При этом максимальный ранозаживляющий эффект наблюдался при использовании суммы алкалоидов, среди которых доминирующим является элатин [8]. В то же время с помощью метода тонкослойной хроматографии в алкалоидной фракции было установлено содержание других алкалоидов, в том числе гипаконитина. Гипаконитин (C33H45NO10),

средство, обладающее ранозаживляющей активностью, патент № 2481836

представляет собой гетероциклическое азотсодержащее органическое соединение растительного происхождения. Чаще всего его извлекают из растений рода Аконит, хотя он встречается и в других растениях [7, 9]. Известно, что гипоаконитин, как и некоторые другие алкалоиды аконитиновой группы, обладает анальгетической активностью [10]. При этом способность гипаконитина стимулировать процессы регенерации, в том числе заживления ран, в литературе не описана. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения гипоаконитина с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции заживления ран, для специалиста не является очевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе. Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 86 беспородных мышах-самцах. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005).

Пример 1

Ранозаживляющую активность предлагаемого средства и механизмы его действия изучали на модели плоскостной кожной раны [11]. На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали.

Предлагаемое средство получали из травы аконита байкольского и живокости высокой. Надземная часть растений, собранная в период цветения в Иркутской области, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и подвергалась непрерывной экстракции хлороформом в течение 5 суток. Хлороформный экстракт упаривали до небольшого объема и тщательно экстрагировали 5% серной кислотой. Кислотную вытяжку подщелачивали карбонатом натрия до рН 9-10 и экстрагировали сначала эфиром. Эфирный экстракт упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве эфира и хроматографировали на дезактивированной окиси алюминия в системе гексан-ацетон (90средство, обладающее ранозаживляющей активностью, патент № 2481836 50%). При этом гипаконитин, дополнительно очищенный перекристаллизацией из смеси тех же растворителей, элюировался после мезаконитина. Вещество растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 0,00025%.

Полученное средство применяли наружно, начиная с первого дня после моделирования раны, ежедневно в течение всего периода заживления. Раствор наносили в объеме 30 мкл. В качестве средств сравнения использовали гель «Солкосерил» (Ай Си Эн Швейцария АГ, Швейцария) и «Облепиховое масло» (ОАО Нижфарм, Россия), которые применяли по той же схеме и в эквивалентном количестве, что и раствор гипаконитина.

Критериями стимулирующего регенерацию действия служили средний диаметр раны и результаты гистологического исследования биоптатов кожи мышей, полученных на 15-е сутки из края раневого дефекта. Биопсийные образцы раневого дефекта кожи окрашивали гематоксилин-эозином. В каждом препарате оценивали: рельеф регенерата кожи, степень и характер инфильтрации, наличие и выраженность отека, количество новообразованных сосудов, волосяных фолликулов и потовых желез. Изучали такие патоморфологические процессы, как акантоз, гиперкератоз, дискератоз [12]. На 3-и и 5-е сут методом клонирования определяли содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в раневой поверхности [13], а также методом колониеобразования в тест-системе изучали продукцию гуморальных факторов стромальными клетками кожи (колониеобразующую активность супернатантов адгезирующих клеток с раневой поверхности в отношении КОЕ-Ф костного мозга) [13]. Кроме того, определяли прямое влияние гипаконитина на КОЕ-Ф. Для этого его вносили в культуру миелокариоцитов в концентрации 100 нМоль/мл, после чего на 7-е сут подсчитывали количество колоний [13]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.

В ходе эксперимента заживление ран у контрольных животных отмечалось к 18 сут опыта. Использование гипаконитина способствовало значительному ускорению процессов регенерации. Заживление дефекта при использовании предлагаемого средства наблюдалось к 14 сут опыта, в то время как при применении средств сравнения таковое отмечалось лишь к 16 сут. При этом в опытной группе (гипаконитин) имело место наиболее выраженное снижение размера ран (табл.1).

При гистологическом исследовании процессов, протекающих в области раневого дефекта кожи мышей, показал, что в контрольной группе имело место формирование неполноценного регенерата. В подавляющем большинстве случаев поверхностный эпителий наблюдался не на всем протяжении, встречались небольшие участки отслойки эпидермиса от дермы с наличием субэпидермальных щелей, отмечалось резкое утолщение эпителиального пласта с нечеткой дифференцировкой слоев и увеличение количества базального, зернистого и рогового слоев. Внутриэпителиально обнаруживались нейтрофильные лейкоциты с формированием микроабсцессов, наблюдались слабовыраженные явления акантоза, гипер- и дискератоза. Подлежащая ткань была представлена созревающими грануляциями с умеренной гистиоцитарно-лейкоцитарной инфильтрацией, явлением отека и очагами кровоизлияний в верхних слоях дермы. Во всех образцах в прилежащей к зоне дефекта ткани отмечается малое количество волосяных фолликулов и потовых желез. Регенерат кожи у животных контрольной группы характеризовался умеренным воспалением, что привело к усиленной пролиферации эпителия, для которой характерны атипические разрастания и изменения эпителия в виде акантоза, гипер- и дискератоза. Изучение гистоструктуры раневого дефекта в группе животных, получавших терапию гипаконитином, показало формирование полноценного соединительнотканного рубца, покрытого эпителием. В остальных образцах (группы сравнения) эпителиальный слой был резко неравномерный, с утолщением в зоне дефекта за счет клеток базального слоя. Подлежащая ткань - грануляционная, местами с очаговой умеренной нейтрофильной инфильтрацией. В области, прилежащей к дефекту, во всех образцах ткани отмечалось умеренное количество волосяных фолликулов и потовых желез. При этом количество животных, у которых произошла полная эпителизация при использовании предлагаемого средства было достоверно выше, чем в контроле (табл.2).

Исследование механизмов регенеративной активности данного средства выявило ряд уникальных феноменов. Применение алкалоида сопровождалось существенным увеличением числа КОЕ-Ф в раневой поверхности (табл.3) и ускорением их дифференцировки (табл.4). При этом выявленные изменения наблюдались на фоне возрастания продукции ростовых факторов стромальными клетками кожи (табл.5). В то же время отмечалось и прямое действие данного алкалоида на прогениторные клетки. Его внесение в культуру миелокариоцитов сопровождалось значительным увеличением выхода в метилцеллюлозной среде числа КОЕ-Ф (табл.6). При этом средства сравнения на данные параметры влияния не оказывали (табл.3-6).

В целом полученные результаты свидетельствуют о наличии способности у гипаконитина значительно стимулировать процессы заживления ран. Механизмами действия алкалоида является активация резидентных мезенхимальных клеток-предшественников, связанная как с его прямым влиянием на прогениторные клетки, так и с опосредованным повышением выработки ростовых факторов стромальными клетками кожи действием.

Таблица 1
Динамика среднего диаметра ран, в см (Х±т)
Сроки исследования/сутки Контроль ГипаконитинСолкосерил Облепиховое масло
1 1,09±0,011,12±0,02 1,06±0,03 1,03±0,02
30,98±0,02 0,94±0,03 1,0±0,020,92±0,04
5 0,9±0,020,79±0,02* 0,78±0,03* 0,9±0,03
7 0,76±0,030,61±0,04 0,73±0,02 0,67±0,02*
90,57±0,02 0,52±0,03 0,51±0,01* 0,54±0,03
120,28±0,03 0,17±0,02* 0,21±0,01* 0,2±0,01*
13 0,20±0,020,06±0,01* 0,14±0,01* 0,16±0,02
14 0,1±0,030,0±0,0 0,07±0,01 0,06±0,02
160,06±0,03 0,0±0,0 0,0±0,00,0±0,0
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 2
Доля животных с полной эпителизацией места дефекта кожи, в % (Х±m)
КонтрольГипаконитин Солкосерил Облепиховое масло
4,6±0,991,2±5,47* 56,4±10,3* 51,7±9,4*
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 3
Содержание мезенхимальных клеток-предшественников в раневой поверхности, на 2,5×105 нуклеаров, (Х±m)
Сроки исследования/сутки Контроль ГипаконитинСолкосерил Облепиховое масло
3 0,67±0,212,83±0,31* 0,7±0,3 0,65±0,19
51,17±0,3 3,0±0,37* 1,0±0,220,92±0,43
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 4
Индекс дифференцировки клеток-предшественников (отношение кластреробразующих единиц фибробластов к колониеобразующим единицам фибробластов) в раневой поверхности, в усл. ед., (Х±m)
Сроки исследования/сутки КонтрольГипаконитин Солкосерил Облепиховое масло
31,33±0,21 1,82±0,2 1,34±0,191,42±0,37
5 1,42±0,272,4±0,26* 1,36±0,22 1,41±0,16
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 5
Колониестимулирующая активность супернатантов стромальных клеток кожи, в усл. Ед. ×105, (Х±m)
Сроки исследования/сутки Контроль ГипаконитинСолкосерил Облепиховое масло
3 8,08±0,5713,25±0,88* 11,3±2,42 7,65±0,78
50,17±0,11 2,75±0,28* 1,0±0,57 0,19±0,03
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Таблица 6
Число КОЕ-Ф в культуре клеток костного мозга при добавлении стимуляторов регенерации, на 2,5×105 миелокариоцитов, (Х±m)
Контроль Гипаконитин СолкосерилОблепиховое масло
12,25±0,85 17,6±0,33* 13,7±0,64 10,32±0,79
* - отмечена достоверность относительно контроля при р<0,05

Литература

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: OO «Изд-во Новая Волна», 2008. - 1206 с.

2. Котельников В.П. Раны и их лечение. - М.: Знание. 1991. - 123 с.

3. Погодаева Н.Н., Жапова Ц., Верещагин А.Л., Горшков А.Г., Семенов А.А. / Изучение алкалоидного состава некоторых видов сибирских аконитов // Раст. ресурсы, вып.2, 2000 г., с.79-84.

4. Бабаева А.Г. Регенерация: факты и перспективы. - М.: Изд-во РАМН, 2009. - 336 с.

5. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: ООО «Печатная мануфактура», 2011. - 149 с.

6. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России. - М.: Наука, 2009. - Том. 169. - № 1. - С.4-8.

7. Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Нагорняк Ю.Г., Перова А.В., Андреева Т.И., Рослякова Е.П., Суслов Н.И. Механизмы влияния комплексных и выделенных веществ на репаративную активность тканей в эксперименте // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т.72, № 3. - С.40-43.

8. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: Учебник 3-е изд. М.: Медицина, 2002.

9. Осадчий С.А., Ганбаатар Ж., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Алкалоиды сибирских видов живокости и аконита и их превращения // Материалы Первой Международной конференции "Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов" (том 1) Москва, 9-12 октября 2001 г.

10. Алефиров А.Н. Борец за жизнь. Аконит / А.Н.Алефиров. - СПб.: ИД «Весь», 2002. - 192 с.

11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство "Медицина"», 2005. - 832 с.

12. Микроскопическая техника / Под ред. Д.С.Саркисова. М., 1996.

13. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992.

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2481836

patent-2481836.pdf

Класс A61K31/4375  гетероциклическая система, содержащая шестичленное кольцо с азотом в качестве гетероатома, например хинолизины, нафтиридины, берберин, винкамин

производные 5-гидроксиметилоксазолидин-2-она для лечения бактериальных кишечных заболеваний -  патент 2527769 (10.09.2014)
производные 5-амино-2-(1-гидроксиэтил)тетрагидропирана -  патент 2525541 (20.08.2014)
хиназолинон, хинолон и родственные аналоги в качестве модуляторов сиртуина -  патент 2519779 (20.06.2014)
производные [4-(1-аминоэтил)циклогексил]метиламина и [6-(1-аминоэтил)тетрагидропиран-3-ил]метиламина -  патент 2515906 (20.05.2014)
новые химические соединения производные 2,4-диамино-1,3,5-триазина для профилактики и лечения заболеваний человека и животных -  патент 2509770 (20.03.2014)
производные оксазолидиновых антибиотиков -  патент 2506263 (10.02.2014)
антивирусные соединения -  патент 2505539 (27.01.2014)
комбинированный лекарственный препарат -  патент 2500415 (10.12.2013)
производные 5-аминоциклилметилоксазолидин-2-она -  патент 2492169 (10.09.2013)
гидратированные кристаллические сложные эфиры камптотецина для лечения рака -  патент 2483071 (27.05.2013)

Класс A61K36/714 Aconitum (борец, аконит)

способ промышленного получения аллапинина -  патент 2518742 (10.06.2014)
гемостимулирующее средство -  патент 2505308 (27.01.2014)
средство, обладающее церебропротекторной активностью -  патент 2501562 (20.12.2013)
церебропротекторное средство -  патент 2497540 (10.11.2013)
способ лечения острого неврита зрительного нерва -  патент 2494709 (10.10.2013)
фармацевтическая композиция для лечения кардиомиопатии -  патент 2482865 (27.05.2013)
средство, обладающее регенеративной активностью -  патент 2475260 (20.02.2013)
способ лечения рака молочной железы с помощью определения индивидуальной чувствительности к химиотерапии культуральным методом и применения комбинации растительных цитостатиков -  патент 2470658 (27.12.2012)
гомеопатическое лекарственное средство и биологически активная добавка к пище, содержащие nisylen, сера, euphrasia, belladonna и/или mercurius solubilis -  патент 2442599 (20.02.2012)
препарат для лечения онкологических заболеваний -  патент 2428200 (10.09.2011)

Класс A61P17/02 для обработки ран, язв, ожогов, шрамов, келоидов или подобных заболеваний

способ лечения трофических язв -  патент 2528973 (20.09.2014)
новое производное пиразол-3-карбоксамида, обладающее антагонистической активностью в отношении рецептора 5-нт2в -  патент 2528406 (20.09.2014)
ранозаживляющее средство на основе штамма trichoderma harzianum rifai -  патент 2528065 (10.09.2014)
лечение инфекции поверхности тела человека или животного -  патент 2527341 (27.08.2014)
мазь доктора рустамова -  патент 2527335 (27.08.2014)
концентрированная гидрогелевая микрокапсульная композиция и перевязочное средство из нее -  патент 2527331 (27.08.2014)
композиция для парентерального введения, способ получения и применение композиции -  патент 2526826 (27.08.2014)
способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными ранами с дефектом мягких тканей (варианты) -  патент 2526814 (27.08.2014)
комбинированный трансплантат дермального матрикса с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками, способ его получения и способ лечения ран с его использованием -  патент 2526813 (27.08.2014)
способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека -  патент 2526811 (27.08.2014)
Наверх