способ микроклонального размножения ириса сибирского (i.sibirica l.)

Формула изобретения

Способ микроклонального размножения ириса Сибирского (I.sibirica L.) in vitro, включающий, культивирование эксплантов на питательной среде, размножение и укоренение регенерантов, отличающийся тем, что применяют метод прямой регенерации, минуя каллусную культуру, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки, причем экспланты культивируют в течение 30 суток на питательной среде Мурасиге-Скуга (MS), в которую вносят фитогормоны 3 мкМ НУК в сочетании с 8 мкМ БАП и добавляют 0,6% агара, затем полученные побеги переносят на питательную среду, дополненную 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК, размножают по схеме, чередуя среды с высоким (5-7,5 мкМ) и низким (1 мкМ) содержанием БАП, укореняют на питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 1 мкМ НУК.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к цветоводству и биотехнологии, может быть использовано для массового размножения ценных декоративных сортов и гибридов ириса сибирского, освобождения их от системных патогенов, а также в селекционной практике для создания новых улучшенных сортов.

Известен способ получения растений-регенерантов I.Sibirica, согласно которому эксплантами являются верхушечные и боковые почки, изолированные с корневищ многолетних генеративных растений во время вегетации (июнь-июль) и после ее окончания (сентябрь-октябрь). Корневища выкапывали из земли, очищали от частиц почвы и отмерших тканей, делили на участки, содержащие почки, промывали в мыльном растворе и проводили стерилизацию растительного материала. Стерильность и жизнеспособность эксплантов при введении в культуру in vitro составила 49-68%. Экспланты культивировали на безгормональной среде, после формирования первых листьев пересаживали на питательные среды мультипликации побегов. В результате из одного экспланта формировалось одно растение-регенерант (Ишмуратова М.М. Особенности культивирования in vitro растений различных экологических групп на примере видов рода Iris L. Растительные ресурсы. - 1999. - 35, № 4. Москва. 1999. - С.67-74).

Недостатком данного способа (аналога) является сложность проведения стерилизации растительного материала. I.sibirica является геофитом, поэтому получение стерильного и жизнеспособного материала при введении в культуру in vitro почек вегетативного побега представляет большую трудность. Даже при условии успешной поверхностной стерилизации внутренняя инфекция проявляет себя на протяжении всех этапов микроклонального размножения этой культуры. При данном способе повреждается или уничтожается растение-донор.

Наиболее близким (прототипом) является способ получения растений-регенерантов I.sibirica на основе индукции развития почек в каллусной культуре из изолированных фрагментов трубки околоцветника. После стерилизации бутонов из них извлекали части околоцветника, которые делили на фрагменты размером 0,5×0,5 см и помещали на поверхность питательной среды Мурасиге-Скуга, дополненной 10, 20 и 30 мкМ 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) в сочетании с 5 мкМ БАП (6-бензиламинопурин). Культивирование осуществляли в условиях темноты. В первые дни культивирования наблюдали увеличения размеров эксплантов за счет растяжения клеток, а в дальнейшем сформировался зеленый плотный каллус. При пересадке каллуса на среду с уменьшенным содержанием 2,4-Д (0,2 мкМ) и культивировании его в условиях фотопериода происходила регенерация флоральных почек у I.sibirica. Индуцировать регенерацию вегетативных почек на данной среде не удалось. В связи с этим каллусную ткань с флоральными почками пересаживали на среду с повышенной концентрацией БАП - 20 мкМ. В конце пассажа на этой среде происходила регенерация вегетативных почек. Продолжительность пассажа на одной среде составляла 25-30 суток (Вечернина Н.А., Таварткиладзе O.К., Клементьева Л.А., Долганова З.В. Особенности регенерации и размножения растений рода Iris (Iridaceae) in vitro // Раст. Ресурсы, 2004. - Т.40, вып.4. - С.56-60).

Недостатками данного способа (прототипа) является длительный период получения вегетативных почек (90 суток). Получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриогенеза непригодно для использования при микроразмножении сортов растений, так как при дедифференциации клеток может происходить полиплоидизация и анеуплоидизация числа хромосом, которое способствует получению неоднородного потомства.

Задачей заявляемого изобретения является создание способа микроклонального размножения I.sibirica за счет ускорения получения регенерантов данного вида ириса прямым методом, минуя каллусную культуру, и повышение их выхода путем увеличения коэффициента размножения для получения растений, идентичных исходным экземплярам.

Сущность изобретения заключается в том, что способ микроклонального размножения Ириса Сибирского (I.sibirica L.) in vitro позволяет применять метод прямой регенерации, минуя стадию каллусообразования, а в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника и цветоножки. Причем экспланты культивируют на питательной среде, которая обеспечивает высокий процент выхода генетически стабильных регенерантов в более короткие сроки. После обеззараживания бутонов трубку околоцветника и цветоножку делят на фрагменты 3×3 мм, которые затем высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга (MS), содержащую 3 мкМ НУК ( -нафтилуксусную кислоту) в сочетании с 8 мкМ БАП, через 30 суток образовавшиеся вегетативные побеги из всех предложенных типов эксплантов пересаживают на питательную среду, дополненную 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК (3-индолилмасляную кислоту) при чередовании высоких (5-7,5 мкМ) и низких (1 мкМ) концентраций БАП, укореняют побеги на среде Мурасиге-Скуга, дополненной 1 мкМ НУК.

Способ осуществляют в два этапа.

1 этап. Цветки берут в фазе бутонизации (VII этап органогенеза), когда они плотно закрыты листочками обертки, и в условиях ламинарбокса проводят стерилизацию. Части трубки околоцветника и цветоножки делят на фрагменты размером не более 3×3 мм и помещают на питательные среды.

Питательные среды готовят по прописи Мурасиге и Скуга (MS), содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводят фитогормоны в разных концентрациях: 3 мкМ НУК в сочетании с 8 мкМ БАП, рН среды доводят до 5,8-5,9 и добавляют 0,6% агара. Среды разливают в пластиковые контейнеры (по 30 мл) или в культуральные флаконы (по 10 мл). Автоклавируют приготовленные питательные среды в течение 20 мин при 120°С. Экспланты культивируют в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24-26°С.

Через 30 суток в ткани эксплантов развиваются вегетативные побеги достаточной величины для пересадки на среды размножения. В результате прямого органогенеза получают полноценные вегетативные побеги I.sibirica в количестве 10-15 штук на один эксплант.

2 этап. На этапе собственно микроклонального размножения I.sibirica L субкультивирование побегов проводят на питательной среде, содержащей 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 ДмкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК, по схеме чередуя среды с высоким и низким (1 мкМ БАП) содержанием цитокинина, (используются питательные среды: Мурасиге-Скуга или Гамборга и Эвелега (B₅), дополненные 5-7,5 мкМ БАП, 0,1 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК). Данные питательные среды позволяют получать морфологически не измененные побеги с хорошей способностью к укоренению (табл.1).

Укоренение проводят на питательной среде Мурасиге-Скута, дополненной 1 мкМ НУК. Способность к укоренению на данной среде составляет 100%. После укоренения растения переносят в контейнеры с почвой и выращивают обычным способом до получения стандартной рассады с закрытой корневой системой.

Необходимым условием клонального микроразмножения является стабильное воспроизводство исходного генотипа. Однако соблюдение этого условия вызывает ряд трудностей, т.к. биологически активные компоненты питательных сред способны вызвать генетические изменения в клетках, что приводит к генетической вариабельности полученных регенерантов. Для подтверждения идентичности регенерантов материнским растениям I.sibirica сорт Стерх, полученных в результате прямой регенерации побегов из тканей трубки околоцветника, проводят анализ с помощью ПЦР. Методом RAPD-анализа полногеномной ДНК не выявлено никаких отличий между материнскими экземплярами I.sibirica сорт Стерх и полученными от них растениями-регенерантами.

В результате использования микроклонального размножения I.sibirica от одного экспланта за 4 месяца культивирования получают около 100 штук растений-регенерантов, морфологически генетически идентичных материнским.

Таблица 1
Влияние концентрации БАП и способа культивирования на число и высоту побегов у I.sibirica сорт Стерх
БАП, мкМ	Без ауксинов	С ауксинами (0.1 мкМ НУК+ОДмкМ ИМК)
Без чередования	Чередование сред с 1 мкМ БАП	Без чередования	Чередование сред с 1 мкМ БАП
ч.п.	в.р., мм	ч.п.	в.р., мм	ч.п.	в.р., мм	ч.п.	в.р., мм
2,5	2,5±0,5	40,5±7,7	1,8±0,1	55,3±3,6	2,2±0,3	35,7±3,1	2,4±0,4	42,7±2,3
5,0	1,7±0,1	41,4±9,3	2,0±0,1	56,0±4,6	1,9±0,3	34,7±3,8	1,9±0,2	52,3±3,0
7,5	1,9±0,3	42,7±3,0	2,0±0,3	52,0±6,3	1,5±0,2	55,0±4,2	1,8±0,2	52,1±3,1
10,0	1,5±0,2	65,3±4,6	1,5±0,2	53,4±3,6	1,5±0,3	53,6±5,9	2,0±0,5	57,1±5,5
1,0 контр	1,3±0,1	58,4±5,8
Примечание:
	1) ч.п. - число побегов;
	2) в.р. - высота растения.